Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Podsumowanie

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Streszczenie

Dzięki postępom w technologiach sekwencjonowania następnej generacji niemal codziennie otrzymujemy dostęp do nowych sekwencji genomowych. Tempo tych postępów przyspiesza, obiecując większą głębokość i szerokość analiz. W świetle tych nadzwyczajnych osiągnięć coraz ważniejsza staje się potrzeba opracowania szybkich, równoległych metod definiowania funkcji genów. Kolekcje mutantów z delecjami w całym genomie drożdży oraz E. coli służyły jako podstawowe narzędzia do funkcjonalnej charakterystyki genów, jednak podejście to nie jest skalowalne, ponieważ obecne metody delecji wymagają usunięcia i weryfikacji każdego z tysięcy genów tworzących genom. Dopiero po zakończeniu tych prac można przystąpić do wysokoprzepustowego fenotypowania. W ciągu ostatniej dekady nasze laboratorium udoskonaliło zestaw konkurencyjnych, zminiaturyzowanych, wysokoprzepustowych testów genomowych, które można przeprowadzać równolegle. Ta paralelizacja jest możliwa dzięki wprowadzeniu „tagów” DNA, czyli „kodów kreskowych” (barcodes), do każdego mutanta, gdzie kod kreskowy służy jako wskaźnik mutacji, a pomiar jego liczności pozwala ocenić kondycję (fitness) mutanta. W niniejszym badaniu dążymy do wypełnienia luki między sekwencją DNA a kolekcjami mutantów z kodami kreskowymi. Aby to osiągnąć, wprowadzamy połączoną metodę zakłócania przez transpozony i kodowania kreskowego, która umożliwia przeprowadzanie równoległych testów z kodami kreskowymi dla nowo zsekwencjonowanych, lecz słabo scharakteryzowanych drobnoustrojów. Aby zilustrować to podejście, prezentujemy nową kolekcję zakłóceń z kodami kreskowymi dla Candida albicans i opisujemy, w jaki sposób platformy oparte na mikromacierzach oraz sekwencjonowaniu następnej generacji mogą być wykorzystane do zebrania od 10 000 do 1 000 000 interakcji gen-gen i lek-gen w ramach jednego eksperymentu.

Protokół

1. Informacje wprowadzające

Istnieje kilka sposobów generowania mutantów posiadających tagi kodowe. Obecnym złotym standardem jest kolekcja Yeast KnockOut (YKO), stworzona przez konsorcjum laboratoriów i ukończona w 2002 roku. ¹Od czasu wprowadzenia oryginalnej kolekcji YKO stworzono inne kolekcje drożdży; w różnych tła szczepowych, przy użyciu konstruktów nadekspresyjnych oraz w innych mikroorganizmach, takich jak E. coli ²Równolegle szybko postępują prace nad tworzeniem bibliotek shRNA z kodami kreskowymi, przy czym w rzeczywistości wiele zasad projektowania tych kolekcji dla ssaków zostało przejętych z drożdży. Aby wykazać, w jaki sposób transpozony z kodami kreskowymi mogą stanowić szybką i szeroko stosowalną strategię tworzenia systematycznych kolekcji mutantów, skupiamy się na jednej kolekcji, którą niedawno stworzyliśmy u ludzkiego patogenu grzybiczego, Candida albicansNasza praca nad *Candida* opierała się na sukcesie przesiewów z użyciem kodów kreskowych w S. cerevisiaei został tutaj wykorzystany jako organizm modelowy. Przykładowy protokół, po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji, może być stosowany do przesiewu każdego organizmu, który można hodować w kulturach zawiesinowych. Ze względu na to, że niewiele organizmów wykazuje wymagane wysokie tempo transformacji oraz efektywną rekombinację mitotyczną niezbędną do tworzenia doskonałych mutantów z delecją, opracowaliśmy protokół wykorzystujący mutogenezę transpozoniczną in vitro aby zmutować bibliotekę DNA genomowego, a następnie wprowadzić te zakodowane kreskowo fragmenty genomowe do Candida albicans ^{3, 4}Zainspirowani sukcesem oryginalnej kolekcji YKO oraz jej rolą w dokonaniu fundamentalnych odkryć dotyczących natury sieci genowych ^5-8, haploinsuficjencja w skali całego genomu ⁹, cel terapeutyczny leku i mechanizm działania ^10,11or niezbędność wszystkich genów w genomie ¹² Przewidujemy, że rozszerzenie tego podejścia na inne mikroorganizmy okaże się niezwykle owocne.

Poniższy protokół zakłada, że pożądana kolekcja mutantów została utworzona (np. YKO lub kolekcja delecji Candida albicans) i jest dostępna w formie indywidualnie zarchiwizowanych szczepów. Szczegółowy opis konstrukcji szczepów znajduje się w publikacjach ^1,13,14.

2. Połączenie poszczególnych mutantów w jedną pulę

1. Należy przeznaczyć jeden tydzień na przygotowanie pulowanych alikwotów komórek (mogą być one przechowywane bezterminowo w temperaturze -80°C).
2. Całkowicie rozmrozić zamrożone banki glicerolowe interesujących szczepów, jednak nie dopuszczać do pozostawania komórek w stanie rozmrożonym przez >2 godz.
3. Sterylizować narzędzie z pinami do płytek 96-dołkowych, zanurzyć je w wodzie w celu usunięcia pozostałych komórek, a następnie dwukrotnie zanurzyć w kąpielach z 70% etanolem (np. w pokrywkach od pudełek na końcówki do pipet), wysterylizować narzędzie nad płomieniem i pozostawić do ochłonięcia przez 1 minutę. Należy uważać, aby wypalać narzędzie z dala od kąpieli z etanolem. Poziom etanolu w kąpielach powinien być wyższy niż poziom wody w kąpieli wodnej, aby zapewnić wypalenie i usunięcie wszystkich przeniesionych komórek. Wodę należy wymieniać co 4–6 cykli przenoszenia komórek.
4. Wprowadź sterylną końcówkę wielopinową do płytki 96-dołkowej po rozmrożeniu, delikatnie zamieszaj i przenieś komórki na podłożo Nunc Omni Tray z agarem YPD z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku. Hoduj kolonie do momentu osiągnięcia przez nie maksymalnego rozmiaru w 30°C (2-3d). W celu oszczędności płytek najbardziej efektywnym rozwiązaniem jest konsolidacja czterech płytek 96-dołkowych na jednej tacy Omni-tray zawierającej ok. 384 szczepy.
5. Po wzroście kolonii należy odnotować brakujące lub wolno rosnące szczepy, a następnie ponownie nanieść je w ilości ok. 2x większej masy komórkowej niż w przypadku pozostałych szczepów.
6. Praca w środowisku mikrobiologicznym (z użyciem płomienia i sterylnych naczyń laboratoryjnych); zalanie płytki 5–10 ml pożywki, inkubacja przez 5 min i resuspensja kolonii za pomocą rozrzewniaka. Przelanie cieczy wraz z komórkami do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml oraz dodanie glicerolu do stężenia 15% lub DMSO do stężenia 7% (obj./obj.).
7. Zmierz OD₆₀₀ z puli i dostosować (poprzez rozcieńczenie lub wirowanie) do końcowego stężenia 50 OD₆₀₀/ml w podłożu zawierającym 15% glicerolu lub 7% DMSO.
8. Przenieść do obiektu (alikwotować do) 40 μl objętości w probówkach paskowych do PCR i zamrozić w temperaturze -80°C.

3. Wzrost populacji eksperymentalnej

Procedura ta została przedstawiona na Rysunku 1.

1. Rozmrozić alikwoty pul na lodzie (w probówkach do PCR). W przypadku niekorzystania z robotyki należy przejść do kroku 5.
2. Należy niezwłocznie (delikatnie!) rozcieńczyć pulę w pożywce z wybranym lekiem lub w wybranych warunkach, szczepiąc przy wartości OD₆₀₀ wynoszącej 0,0625 w całkowitej objętości 700 μl na płytce 48-dołkowej. Na płytce należy uwzględnić co najmniej jedną odpowiednią kontrolę rozpuszczalnika. W przypadku eksperymentów obejmujących więcej niż 5 generacji wzrostu (tj. więcej niż 1 dołek), sąsiednie dołki należy wypełnić pożywką lub wybranym warunkiem, ale BEZ komórek.
3. Uszczelnić za pomocą plastikowej folii uszczelniającej do płytek; jeśli warunki wymagają wzrostu tlenowego (np. niefermentowalne źródła węgla), należy użyć igły o rozmiarze 21 G do wykonania otworów w membranie uszczelniającej w kierunku krawędzi każdego dołka.
4. Inkubować w spektrofotometrze, wytrząsając przy 30°C z zastosowaniem eksperymentalnie określonego schematu wytrząsania (np. wytrząsanie przez 14 min na najwyższym ustawieniu (lub w wytrząsarce z kontrolą temperatury), odczyt studzienek, wznowienie wytrząsania). Część zawiesiny komórkowej może zostać pobrana przez robota i zachowana na płycie chłodzącej na pokładzie robota w zdefiniowanych przez użytkownika punktach czasowych generacji, zazwyczaj po 5, 10, 15 i 20 generacjach wzrostu. (http://med.stanford.edu/sgtc/technology/access.html, w celu uzyskania szczegółowych informacji należy skontaktować się z C. Nislow lub G. Giaever).
5. W przypadku ręcznej hodowli komórek, zaszczepić 50 ml kultury przy początkowej wartości OD₆₀₀ o wartości 0,002 w kolbie hodowlanej o pojemności 250 ml. Inkubować z wstrząsaniem przy 30°C przy 250 obr./min aż do osiągnięcia przez komórki końcowej gęstości optycznej (OD)₆₀₀ wynoszącej 2,0 (dla Saccharomyces lub Candida) przez ok. 10 generacji wzrostu. Dodatkowe generacje wzrostu można uzyskać, rozcieńczając komórki przy OD600 wynoszącej 2,0 z powrotem do poziomu 0,02 w nowej kolbie.
6. Zebrać przy gęstości co najmniej ˜2 OD₆₀₀ jednostki komórek dla każdej próbki/punktu czasowego do probówek do mikrocentryfugi Safe-Lock.

Uwaga: Zawsze należy pobrać próbkę komórek początkowych (tzn. „punkt czasowy T0”), aby ocenić początkową reprezentację szczepów w każdej nowo utworzonej puli, dodając 1-2 OD₆₀₀ puli bezpośrednio z alikwotów mrożonych do probówki 1,5 ml i przetwarzając zgodnie z opisem poniżej.

4. Ekstrakcja genomowego DNA, PCR oraz hybrydyzacja mikromacierzy lub sekwencjonowanie

1. Oczyścić genomiczne DNA z ˜2 OD₆₀₀ komórek za pomocą zestawu Zymo Research YeaStar zgodnie z instrukcjami producenta (Protokół I w przypadku DNA drożdży) lub inną odpowiednią metodą specyficzną dla badanego organizmu (dobrze sprawdza się standardowa ekstrakcja fenol/chloroform z następującym po niej wytrącaniem alkoholem dla różnych mikroorganizmów). W przypadku użycia zestawu YeaStar, elui DNA w 300 μL 0,1X TE zamiast 60 μL 1X TE określonych w protokole. Genomiczne DNA można przechowywać w temperaturze -80°C w nieskończoność.
2. Przygotować dwie reakcje PCR dla każdej próbki, jedną dla uptagów i jedną dla downtagów, stosując następujące warunki reakcji: 33 μl ddH₂O, 6 μl 10X buforu PCR bez MgCl₂, 3 μl 50 mM MgCl₂, 1,2 μl 10 mM dNTP, 1,2 μl 50 μM mieszaniny starterów Up lub Down, 0,6 μl 5 U/μl polimerazy Taq, ˜0,1 μg genomicznego DNA w 15 μl. Objętość całkowita wynosi 60 μl. Przeprowadzić termocykl w następujących warunkach: 94°C 3 min, 30 cykli: 94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s; następnie 72°C 3 min i przechowywanie w 4°C. Sprawdzić uzyskane produkty PCR na żelu; dla amplikonów używanych do hybrydyzacji oczekiwany jest produkt 60 bp dla obu reakcji PCR, a dla amplikonów do sekwencjonowania kodów kreskowych 130 bp. Produkty PCR można następnie przechowywać w -80°C w nies코ńczoność.
3. Podgrzać piec do hybrydyzacji do temperatury 42°C, a następnie przygotować łaźnię wodną z wrzącą wodą oraz pojemnik z lodem zawierający zawiesinę lodu i wody.
4. Nawilżyć macierze, powoli wypełniając je 120 μl 1X buforu do hybrydyzacji.
5. Inkubować w buforze do hybrydyzacji w temperaturze 42°C przy 20 rpm przez 10 minut.
6. Przygotować 90 μl mieszaniny do hybrydyzacji na próbkę, plus jedną dodatkową jako zapas, w następujący sposób: 75 μl 2X buforu do hybrydyzacji, 0,5 μl oligonukleotydu kontrolnego B213 (0,2 fm/μl), 12 μl mieszanych oligonukleotydów (12,5 pm/μl), 3 μl 50X roztworu Denhardta w probówkach 0,5 ml z zakrętką typu lock-top.
7. Dodać 30 μl PCR uptag oraz 30 μl PCR downtag do 120 μl mieszaniny do hybrydyzacji, aby uzyskać objętość całkowitą 150 μL. Gotować przez 2 minuty, a następnie schłodzić w lodo-wodzie przez co najmniej 2 minuty. Krótko wirować probówki przed użyciem.
8. Usunąć bufor przed hybrydyzacją z macierzy i dodać 90 μl mieszaniny hybrydyzacyjnej/PCR. Aby zapobiec parowaniu, przykryć uszczelki macierzy Tough-Spotem. Hybrydyzować przez 16 godzin w 42°C przy 20 rpm.
9. Przygotować na świeżo 600 μl mieszaniny do znakowania biotyną na próbkę plus jedną dodatkową w następujący sposób: 180 μl 20X SSPE, 12 μl 50X roztworu Denhardta, 6 μl 1% Tween 20 (vol/vol), 1 μl 1 mg/ml streptawidyny-fykoerytryny, 401 μl ddH₂O. Wszystkie próbki streptawidyny-PE przechowywać w ciemności. Rozdzielić po 600 μl do probówek 2 ml. Usunąć Tough-Spoty z chipów.
10. Powoli usunąć mieszaninę do hybrydyzacji z macierzy za pomocą pipety i wypełnić mikromacierze 120 μl Wash A. Przygotować stację płynową Affymetrix.
11. Przemyć macierze za pomocą stacji płynowej Affymetrix zgodnie z instrukcjami producenta, stosując protokół „Gene-Flex_Sv3_450” z następującymi modyfikacjami: jeden dodatkowy etap z Wash A (1 cykl, 2 mieszania) przed barwieniem, temperatura Wash B 42°C zamiast 40°C, barwienie w 42°C zamiast 25°C. Można również przeprowadzić przemywanie po hybrydyzacji, barwienie biotyną i przemywanie po barwieniu ręcznie (patrz str. 396 w referencji 15). Po operacjach płynowych uruchomić protokół „SHUTDOWN_450” stacji płynowej.
12. Po przemywaniu upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby dodać 90 μl Wash A i powoli pipetować, aż pęcherzyki znikną. Jeśli na powierzchni macierzy znajdują się jakiekolwiek ślady lub plamy, oczyścić okno szklane izopropanolem i tkaniną niepozostawiającą kłaczków. Nałożyć świeże Tough-Spoty na uszczelki/septy i umieścić macierze w skanerze.
13. Skanować w skanerze Affymetrix GeneArray przy długości fali emisji 560 nm.

5. Analiza macierzy (patrz Rysunek 2 w celu zobaczenia przykładu uzyskanego przy użyciu kolekcji knockoutów Candida albicans)

1. Maskowanie wartości odstających: Ponieważ macierz Affymetrix TAG4 zawiera 5 replik każdego komplementu kodu kreskowego rozproszonych losowo, każda sonda kodu kreskowego, która odbiega od replik, może zostać zamaskowana i odrzucona. Aby to osiągnąć, dla każdego elementu macierzy, który wydaje się być wartością odstającą na podstawie jego sygnału w porównaniu z 4 innymi replikami tego elementu, nasze oprogramowanie najpierw analizuje 5 elementów otaczających podejrzaną wartość odstającą, tworząc macierz 25 elementów z podejrzanym elementem w centrum. Jeśli >13/25 sond w tym regionie różni się od ich indywidualnej średniej przyciętej z replik (średniej z trzech środkowych replik, z wyłączeniem replik najwyższej i najniższej) o więcej niż 10%, sonda ta zostaje odrzucona z dalszej analizy. Ponieważ takie wartości odstające są najczęściej wynikiem niespójności podczas przemywania po hybrydyzacji, rozszerzamy lub „dopełniamy” region zawierający podejrzane sondy. Dopełnij takie sondy, uwzględniając wszystkie sondy w promieniu 5 sond, zdefiniowanym jako ((x₁-x₂)² + (y₁-y₂)²)^½ < 6, gdzie x₁, x₂, y₁ i y₂ to współrzędne x i y dla dwóch elementów. Na koniec odrzuć elementy, dla których stosunek odchylenia standardowego (zawartego w pliku .cel dla macierzy Affymetrix) pikseli elementu do średniej wartości pikseli elementu jest zbyt wysoki. Po usunięciu wartości odstających oblicz średnią wartości intensywności dla wszystkich pozostałych replik.
2. Usuwanie nieużytecznych tagów: Tagi o niskich wartościach intensywności dadzą wyniki słabej jakości i muszą zostać usunięte. Próg wykluczenia dla tych sond o niskiej intensywności można obliczyć w następujący sposób:
   1. Dla każdej pary macierzy traktowanie-kontrola oblicz log₂((i_c-b_g)/(i_t-b_g)) dla każdego tagu, gdzie i_c to intensywność kontrolna, i_t to intensywność traktowania, a b_g to średnia intensywność nieprzypisanych sond tagów.
   2. Sparuj stosunki tagów typu uptag i downtag według szczepu, a dla każdej pary tagów przyjmij minimalną intensywność dla dwóch tagów w dwóch próbkach. Posortuj pary stosunków według tej minimalnej intensywności.
   3. Zastosuj okno przesuwne o rozmiarze 50 dla uszeregowanych par stosunków i oblicz korelację par stosunków uptag i downtag w obrębie okna. Oblicz również średnią minimalnych intensywności obliczonych w poprzednim kroku.
   4. Przesuń okno o 25 par i powtórz poprzedni krok, aż wszystkie pary zostaną przeanalizowane.
   5. Wykreśl średnią minimalną intensywność w funkcji korelacji uptag-downtag dla wszystkich okien.
   6. Na koniec wybierz próg intensywności; zazwyczaj stosujemy wartość intensywności, przy której korelacja po raz pierwszy osiąga 80% swojego poziomu maksymalnego. Oznacz i usuń z dalszej analizy wszystkie tagi poniżej tego progu.
3. Korekcja nasycenia: Ponieważ każdy element na mikromacierzy kodów kreskowych może ulec nasyceniu, sygnał na macierzy TAG4 nie jest liniowo powiązany z stężeniem tagu. Aby skorygować to nasycenie, należy postępować zgodnie z protokołem opisanym w referencji ¹⁶.
4. Normalizacja macierzy: Dla każdej macierzy znormalizuj osobno uptagi i downtagi. Aby przeprowadzić normalizację kwantylową, uszereguj wartości uzyskane z każdej macierzy dla uptagów i downtagów w kolejności rosnącej intensywności. Aby przeprowadzić normalizację do średniej dla każdego zestawu uptagów i downtagów, podziel przez średnią. Normalizacja do średniej wszystkich macierzy jest drugim krokiem następującym po przekształceniu surowych danych do średniej każdej macierzy.
5. Obliczanie wyników wrażliwości dla porównań kontrola-traktowanie: Aby wykorzystać stosunki log₂ jako miernik wrażliwości: Dla każdego szczepu oblicz log₂((μ_c-b_g)/(μ_t-b_g)), gdzie μ_c to średnia intensywność dla próbek kontrolnych, μ_t to średnia intensywność dla próbek traktowanych, a b_g to średnia intensywność nieprzypisanych sond. Szczepy z dodatnim stosunkiem log₂ są wrażliwe na traktowanie, a szczepy oporne mają ujemne stosunki log₂.

6. Ocena dostosowania szczepów drożdży z kodami kreskowymi za pomocą sekwencjonowania

1. Wyizoluj DNA z pul deletions zgodnie z opisem dla mikromacierzy.
2. Amplifikuj każdy kod kreskowy uptag 20-mer za pomocą starterów kompozytowych składających się z sekwencji wspólnych starterów do kodów kreskowych oraz sekwencji wymaganych do hybrydyzacji z ogniwem przepływowym (flowcell) Illumina (patrz Tabela starterów Illumina oraz Rysunek 3 w celu uzyskania schematu amplikonu). Startery te można stosować po odsoleniu, bez dodatkowej puryfikacji. PCR przeprowadza się w objętości 100μL, używając Invitrogen Platinum PCR Supermix (Cat. No. 11306-016) w następujących warunkach: 95°C/3 min; 25 cykli: 94°C/30 sek, 55°C/30 sek, 68°C/30 sek; a następnie 68°C/10 min.
3. Oczyść produkt PCR (˜130bp) za pomocą Qiagen MinElute 96 UF PCR Purification Kit (Cat. No. 28051).
4. Po puryfikacji PCR określ ilość DNA za pomocą Invitrogen Quant-iT dsDNA BR Assay Kit (Cat No. Q32853). Nie należy polegać na odczytach 260/280!
5. Znormalizuj stężenie DNA do 10μg/ml i połącz równe objętości znormalizowanego DNA.
6. Rozdziel połączone DNA na 12% żelu poliakryloamidowym TBE przez 3-4 godziny, w zależności od zastosowanego napięcia.
7. Barw żele bromkiem etydyny (Sybr Green również powinien być skuteczny) przez 30 minut.
8. Zlokalizuj interesujący pas na lightboxie UV do długich fal (stosując odpowiednią ochronę twarzy), wytnij go i wyizoluj DNA metodą rozdrabniania i namaczania (crush and soak)¹⁷, a następnie przeprowadź precypitację etanolem.
9. Potwierdź, że wyizolowano DNA o odpowiedniej wielkości (130bp) i że startery zostały usunięte, używając Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit (Cat No. 5067-4626).
10. Sekwencjonowanie próbek:
    1. Platforma Illumina GAIIx:
       1. Wygeneruj klastry na ogniwie przepływowym Single-Read, używając cBOT oraz Single-Read Cluster Generation Kit (Cat No. GD-300-1001). Dla Read 1, zmodyfikowane startery sekwencjonujące UP i DOWN-tag są łączone w stężeniu zapasowym 100uM i dodawane do probówki paskowej (0,6μL każdego startera sekwencjonującego 100uM w 120 μl HT1). Do generowania klastrów R1 stosuje się procedurę SR_Amp_Block_StripTubeHyb_v7.0.
       2. Sekwencjonowanie na Genome Analyzer IIx. Po 18 cyklach sekwencjonowania, moduł Paired-end jest używany do usunięcia zsyntetyzowanej pierwszej nici i ponownej hybrydyzacji ogniwa przepływowego, używając Illumina R1 (poniżej). Klastry są regenerowane i sekwencjonowane przez 5 cykli w celu przechwycenia tagu indeksującego.
11. Sekwencja tagu indeksującego jest używana do przypisania sekwencji do odpowiednich grup eksperymentalnych.
12. W ramach każdej grupy eksperymentalnej zliczane są sekwencje kodów kreskowych drożdży, aby uzyskać całkowitą liczbę odczytów dla każdego kodu kreskowego.
13. Liczby są normalizowane kwantylowo, aby każdy eksperyment miał taki sam rozkład liczbowy. Analogicznie do eksperymentów oceny kondycji (fitness) z użyciem mikromacierzy kodów kreskowych, oblicza się współczynniki defektu kondycji dla każdego szczepu i wyraża je jako stosunek log₂ (kontrola/traktowanie). Dodatnie wyniki defektu kondycji oznaczają spadek liczebności szczepu podczas leczenia lekiem i sugerują, że wersja typu dzikiego genu usuniętego w tym szczepie jest wymagana do odporności na ten lek lub inhibitor.

Uwaga: Rozważenie metody Bar-seq jako alternatywy dla hybrydyzacji na macierzach. Wraz ze spadkiem kosztów sekwencjonowania wysokoprzepustowego, wykorzystanie tej metody do odczytu liczebności znaczników staje się wykonalne, a w wielu przypadkach bardziej opłacalne ¹⁸. W ten sposób amplifikowany produkt PCR jest mierzony bezpośrednio jako „liczba odczytów” (counts), a nie jako intensywność sygnału po hybrydyzacji z macierzą. Eliminuje to wyniki fałszywie ujemne i dodatnie wynikające z kontaminacji krzyżowej znaczników, nasycenia sygnału lub problemów związanych z bardzo wysoką lub bardzo niską intensywnością sygnału. Ponadto, przed sekwencjonowaniem można połączyć wiele eksperymentów poprzez dodanie indeksu DNA o długości 4–8 zasad¹⁹. Ponieważ kody kreskowe drożdży mają 20 bp, pojedynczy odczyt dwuetapowy o długości 26–28 zasad obejmuje zarówno indeks multipleksacyjny, jak i unikalny kod kreskowy, co pozwala na ekstremalny multipleksing powyżej 100 próbek. W momencie pisania tego tekstu Bar-seq oferuje przewagę kosztową nad mikroarrayami z kodami kreskowymi, a ponadto Bar-seq jest z natury elastyczny, dzięki czemu wraz ze wzrostem liczby odczytów na przebieg poziom multipleksingu może zostać zwiększony w celu dalszej redukcji kosztów. Kilka sekwencjonerów o „średniej wydajności” od wszystkich głównych producentów platform dodatkowo upowszechni metodę Bar-seq, przez co sekwencjonowanie prawdopodobnie stanie się preferowanym sposobem odczytu.

Protokół ten został zwalidowany również na urządzeniu Illumina HiSeq2000.

Doskonała demonstracja zastosowania techniki Bar-seq w celu rozwiązania podstawowego pytania biologicznego dotyczącego kontroli wzrostu Saccharomyces cerevisiae została przedstawiona w niedawnej pracy Greshama et al.²⁰, którzy opisują kilka istotnych wytycznych dotyczących projektu eksperymentalnego oraz interpretacji wyników.

7. Walidacja danych z przesiewu pulowanego

Wyniki każdego przesiewu genomiki funkcjonalnej powinny zostać zweryfikowane z użyciem poszczególnych szczepów w hodowlach izolowanych. Ponieważ każdy eksperyment będzie się różnić pod względem liczby szczepów wrażliwych, wybór liczby szczepów kandydatów do potwierdzenia jest w pewnym stopniu arbitralny. Jako wytyczną przyjmuje się, że uszeregowanie najbardziej wrażliwych szczepów według stosunku log₂ lub wartości z-score i przetestowanie 25-50% najlepszych kandydatów (co zazwyczaj odpowiada 2-3 odchyleniom standardowym od średniej dla wszystkich szczepów w puli) stanowi dobry kompromis między kosztami a korzyściami. Potwierdzenia poszczególnych szczepów można przeprowadzić w dowolnej kolbie, jednak my wykonujemy te testy przez 5 generacji wzrostu w płytkach 96-dołkowych, stosując inoculum początkowe o wartości 0,06 OD₆₀₀ w 100 μl pożywki w spektrofotometrze z wytrząsaniem, dokonując pomiarów co 15 minut (zobacz rysunek 4).

8. Reprezentatywne wyniki

Po zakończeniu przesiewu całego genomu, znormalizowaniu macierzy i porównaniu zachowania każdego szczepu z traktowaniem kontrolnym (np. poprzez porównanie intensywności mikroarray lub liczby odczytów sekwencjonowania na szczep), dane najłatwiej jest przetwarzać w pliku Excel z genami uszeregowanymi według stosunków log2 kontrola/eksperyment. W ten sposób im większy ujemny stosunek log2, tym bardziej dany szczep jest wrażliwy na badaną warunek. Pliki Excel te można wykreślić za pomocą różnych pakietów oprogramowania graficznego. Najprostszym rozwiązaniem jest dla nas wykreślenie stosunków log2 na osi Y oraz nazw genów lub ORF na osi X. Na przykładzie przedstawionym na Rysunku 2a pokazano taki wykres dla traktowania klotrimazolem (znanym środkiem przeciwgrzybiczym). Wszystkie szczepy istotnie wrażliwe na traktowanie ze stosunkiem log2 wynoszącym 2 zostały zaznaczone na czerwono; zazwyczaj weryfikujemy wiele takich szczepów w indywidualnych testach wzrostu każdego mutanta w obecności tej samej koncentracji leku. W tym przykładzie zaznaczono 4 szczepy: NCP1, ERG2 oraz dwa niezależne allele ERG11, który jest znanym białkowym celem klotrimazolu. Każdy z tych 4 genów bierze bezpośredni udział w biosyntezie ergosterolu, odpowiednika cholesterolu u drożdży. Na przykład NCP1 koduje reduktazę NADP-cytochrom P450 zaangażowaną w biosyntezę ergosterolu, która jest powiązana i koordynacyjnie regulowana z Erg11. Ten przykład podkreśla fakt, że w tym bezstronnym przesiewie zidentyfikowano znany cel leku (Erg11), a także kilka innych kluczowych komponentów szlaku docelowego. Wreszcie, kilka genów zaznaczonych na czerwono reprezentuje geny, które mogą być zaangażowane w biosyntezę ergosterolu lub w odrębne procesy biologiczne. Jak wspomniano powyżej, każdy szczep wykryty jako wrażliwy w przesiewie pulownym powinien zostać zweryfikowany pod kątem wrażliwości w indywidualnym teście wzrostu. W przykładzie pokazanym na Rysunku 2b potwierdzono, że cztery szczepy są wrażliwe na klotrimazol na podstawie ich zmniejszonego wzrostu w stosunku do rodzicielskiego szczepu typu dzikiego, BWP17. Te indywidualne krzywe wzrostu podkreślają istotną cechę takich pulownych przesiewów gen-lek; mianowicie absolutna ranga danego szczepu nie musi odzwierciedlać jego dokładnego poziomu wrażliwości. Co więcej, Rysunek 2b pokazuje również wartość posiadania wielu alleli dla każdego genu — w tym przypadku dwa mutanty z delecją erg11 wykazują nieco różną wrażliwość. Korelowanie charakteru tych delecji ze stopniem wrażliwości może dostarczyć dodatkowych informacji na temat mechanizmu działania leku.

Rysunek 1. Schemat analizy wzrostu w kulturach mieszanych i detekcji kodów kreskowych. Kultury szczepi się rozmrożonymi alikwotami zmieszanych komórek (krok 1), a następnie hoduje przez pożądaną liczbę generacji (krok 2) w sposób zrobotyzowany (Opcja A) lub ręczny (Opcja B). Komórki są zbierane za pomocą wirowania (krok 3), a następnie z zebranych komórek izoluje się genomowe DNA (krok 4). Następnie niezależnie amplifikuje się sekwencje uptag i downtag (krok 5), które są następnie hybrydyzowane z macierzą (krok 6a) lub sekwencjonowane bezpośrednio (krok 6b).

Rycina 2. Przykładowe dane zebrane w określonych punktach protokołu. (A) Przykładowe dane z wyników przesiewowych (adaptowane z ¹³). Pulę mutantów z markerami hodowano przez 20 generacji w obecności klotrimazolu oraz DMSO (kontrola). Obliczono stosunek Log₂ (intensywność kontroli/intensywność traktowania) i przedstawiono go jako funkcję genu. Wysoce wrażliwe szczepy (czerwone) obejmowały znany cel klotrimazolu, ERG11p. Należy zauważyć, że ten test często ujawnia inne wrażliwe mutanty oprócz faktycznego celu związku. Zazwyczaj są to mutanty, które oddziałują syntetycznie z celem, stanowią część ogólnej odpowiedzi na stres/traktowanie lub są fałszywie dodatnimi wynikami, które nie potwierdzają się w dalszych badaniach. (B) Przykład danych potwierdzających (adaptowane z ¹³). Wyniki z testów wzrostu puli można zweryfikować, hodując szczep w osobnej kulturze i porównując go ze wzrostem typu dzikiego (czarny).

Rysunek 3. Struktura amplikonu wytworzonego z puli testów z kodami kreskowymi dla hybrydyzacji mikromacierzy lub sekwencjonowania kodów kreskowych. Amplikon wytworzony dla każdego mutanta w kolekcji zawiera sekwencje homologiczne do genomu w celu integracji (regiony niebieskie oznaczone jako ATG i TAA) oraz unikalne kody kreskowe (oznaczone jako AG i wskazane czarną kreską). W przypadku hybrydyzacji mikromacierzy niebieskie wspólne primery są wykorzystywane do amplifikacji sondy o długości 60 bp do hybrydyzacji mikromacierzy. W przypadku sekwencjonowania kodów kreskowych w reakcji PCR stosuje się wydłużone primery, składające się z sekwencji kodujących adapter Illumina (czerwony pasek), indeks o długości 6 zasad (zakreślenia) oraz niebieski wspólny primer w przypadku primera górnego (upstream), a ten sam kompozytowy primer (bez indeksu 6 zasad) w przypadku drugiego primera.

Rycina 4. Testy wzrostu poszczególnych szczepów w celu 1) wstępnego przesiania związków przeciwko drożdżom typu dzikiego w celu ustalenia odpowiedniej dawki do przesiewania całego genomu oraz 2) potwierdzenia wyników przesiewania całego genomu. (A) Płytkę 96-dołkową z płaskim dnem wypełnia się 100 μl zawiesiny komórkowej o gęstości optycznej (OD) wynoszącej 0,062. Każda studnia może zawierać ten sam szczep (do oznaczenia dawki) lub różne kombinacje szczepów i leków (do testów potwierdzających). 2 μl dodaje się związek (zazwyczaj rozpuszczony w DMSO), a następnie komórki hoduje przy stałym wytrząsaniu przez 16–20 h w temperaturze 30°CKońcowe stężenie DMSO nie powinno przekraczać 2%. W tym przykładzie w każdej studzience płytki krzywa wzrostu została przedstawiona kolorem czarnym, natomiast krzywa wzrostu kontrolna kolorem czerwonym. (B) Obraz o wyższej rozdzielczości kilku wstępnych analiz wykonanych z przykładowym lekiem, nałożonych jeden na drugi. W tej serii miareczkowania IC_10-15 otrzymuje się przy użyciu dawki fioletowej, która byłaby odpowiednia do profilowania delecji (HIP i HOP). Ze względu na nieliniowość przy wyższych gęstościach optycznych, wartości OD z czytnika Tecan (lub innego podobnego czytnika płytek) muszą zostać skalibrowane przy użyciu wartości uzyskanych za pomocą „tradycyjnej” kuwety o długości drogi optycznej 1 mm.

Dyskusja

W niniejszej pracy przedstawiliśmy protokół, który po niewielkich modyfikacjach można łatwo dostosować do szerokiego zakresu istniejących kolekcji mutantów z kodami kreskowymi różnych mikroorganizmów w celu stworzenia oznakowanych kolekcji mutantów. Podkreślamy, że choć opisaliśmy protokół oznakowanej mutagenezy transposonowej dla patogennego drożdżaka C. albicans, bardzo podobny protokół można dostosować do wielu rodzajów grzybów jednokomórkowych. Po zmodyfikowaniu protokół ten dobrze działa u bakterii ¹³, a obecnie w przygotowaniu są kolekcje dla szeregu dodatkowych genomów grzybowych i bakteryjnych. Obecnie badanie to stanowi jedyny kompleksowy, bezstronny screening w skali całego genomu pod kątem interakcji gen-mała cząsteczka. Szczególnie przekonującą cechą tego badania jest to, że nie jest wymagana żadna wcześniejsza wiedza na temat genu lub małej cząsteczki. Mimo zakresu i mocy tych analiz, ich przenoszalność do innych laboratoriów była w pewnym stopniu utrudniona przez początkowe nakłady kapitałowe oraz narzędzia informatyczne do analizy wyników. Przewidujemy, że wraz z wprowadzeniem odczytu sekwencjonowania nowej generacji w połączeniu z solidnymi narzędziami analitycznymi, ich zastosowanie wzrośnie.