Przygotowanie mięśnia kremastra myszy do obrazowania intravitalnego mikrokrążenia

Podsumowanie

Opisano przygotowanie tkanki do wizualizacji i manipulacji eksperymentalnej żywego mikrokrążenia. U znieczulonych samców myszy przygotowano cienki, silnie unaczyniony mięsień kremaster do mikroskopii przyżyciowej w celu badania sieci mikronaczyniowych, w tym tętniczek, kapilar i żyłek. Metoda ta może być łatwo dostosowana do szczurów i chomików.

Streszczenie

W całym organizmie utrzymanie homeostazy wymaga stałej dostawy tlenu i składników odżywczych, przy jednoczesnym usuwaniu produktów przemiany materii. Równowaga ta jest osiągana dzięki przepływowi krwi w mikrokrążeniu, które obejmuje najmniejsze odgałęzienia sieci naczyniowej we wszystkich tkankach i narządach. Tętniczki odchodzą od tętnic, tworząc sieci kontrolujące rozkład i ilość utlenowanej krwi napływającej do licznych naczyń włosowatych, ściśle powiązanych z komórkami miąższu. Kapilary zapewniają dużą powierzchnię wymiany dyfuzyjnej między komórkami tkanki a krwią. Żyłki zbierają odpływ z naczyń włosowatych i zbiegają się, transportując odtlenowaną krew z powrotem w kierunku serca. Obserwacja tych procesów w czasie rzeczywistym wymaga zastosowania podejścia eksperymentalnego umożliwiającego wizualizację i manipulację żywym mikrokrążeniem.

Mięsień żyrakowy szczurów był pierwotnie wykorzystywany jako model do badania stanu zapalnego z użyciem histologii i mikroskopii elektronowej po śmierci^1,2. Pierwszy raport in vivo dotyczący odsłoniętego, nienaruszonego mięśnia żyrakowego szczura badał odpowiedzi mikro naczyniowe na leki naczyniokurczące i naczyniorozkurczające przy użyciu światła odbitego³. Jednakże krzywizna mięśnia oraz brak skupionego oświetlenia ograniczały użyteczność tego preparatu. Przełom polegał na rozcięciu mięśnia, oddzieleniu go od jądra i rozłożeniu promieniście w formie płaskiego płata do transiluminacji pod mikroskopem złożonym⁴. Choć wykazano, że jest to cenny preparat do badania fizjologii mikrokrążenia u szczurów⁵ i chomików⁶, mięsień żyrakowy myszy⁷ okazał się szczególnie użyteczny w analizie szlaków komórkowych zaangażowanych w regulację funkcji mikronaczyniowej^8-11 oraz w obrazowaniu w czasie rzeczywistym sygnalizacji międzykomórkowej¹².

Mięsień dźwigacz jądra powstaje z mięśnia skośnego wewnętrznego oraz mięśnia poprzecznego brzucha w czasie zstępowania jąder przez kanał pachwinowy¹³. Służy on do podtrzymywania (gr. cremaster = podwieszka) i utrzymywania temperatury jąder. Jak opisano w niniejszej pracy, mięsień dźwigacz jądra jest przygotowywany w formie cienkiego, płaskiego płata, co zapewnia doskonałą rozdzielczość optyczną. Przy zachowaniu stabilnej temperatury ciała i poziomu znieczulenia myszy, przygotowanie chirurgiczne polega na uwolnieniu mięśnia z otaczających go tkanek oraz od jąder, rozprostowaniu go na przezroczystym podeście z gumy silastykowej i zabezpieczeniu krawędzi szpilkami entomologicznymi przy jednoczesnym ciągłym nawadnianiu roztworem soli fizjologicznej. Niniejszy protokół wykorzystuje myszy transgeniczne wykazujące ekspresję GCaMP2 w komórkach śródbłonka tętniczek. GCaMP2 jest genetycznie zakodowaną fluorescencyjną cząsteczką wskaźnika wapnia¹². Obrazowanie szerokopolowe oraz kamera CCD z wzmacniaczem obrazu umożliwiają badanie sygnalizacji wapniowej w śródbłonku tętniczek in vivo.

Protokół

1. Podkładka dla myszy, piedestał mięśniowy, klin pod ciało i roztwór do superfuzji

1. Podkładka dla myszy: Przezroczysta prostokątna płyta z pleksiglasu (szerokość 6", długość 8", grubość 3/16") wykonana tak, aby pasowała do stolika mikroskopu. Na tej „podkładce dla myszy” unieruchamia się znieczuloną mysz podczas chirurgicznego przygotowania mięśnia kremaster.
2. Podstawka pod mięsień: Przezroczysta silastykowa gumowa podstawka jest przygotowywana z Sylgard 184, który należy zmieszać zgodnie z instrukcją producenta°zgodnie z instrukcją. Wygodną formą jest jednorazowa szalka Petri o grubości 15 mm i średnicy 50 mm. Blok Sylgardu jest przycinany do pożądanego kształtu za pomocą żyletki (patrz Rycina 1C.). Do przymocowania bloku Sylgardu do płytki dla myszy używa się cienkiej warstwy bezbarwnego, wodoodpornego kleju silikonowego. Przydatne wskazówki: Po wlaniu Sylgardu do szalki Petri, odgazowanie w komorze próżniowej przez godzinę usuwa pęcherzyki powietrza i poprawia przejrzystość. Po odgazowaniu czas utwardzania Sylgardu ulega skróceniu poprzez umieszczenie szalki w piecu laboratoryjnym w temperaturze 50 °C przez kilka godzin.
3. Klin pod ciało i platforma grzewcza: Klin (2" x 4" x 15°) umieszczony pod myszą i oparty o postument pochyla ciało zwierzęcia do przodu, co ułatwia wyciągnięcie mięśnia kremastra nad postument od strony jego przyczepu. Zastosowanie aluminiowej platformy na powierzchni zapewnia przewodzenie ciepła. Platforma jest ogrzewana przez rezystory podłączone do zasilacza prądu stałego (Rycina 1A). Kalibracja temperatury platformy do ˜40 °C utrzymuje temperaturę przełyku na poziomie ˜37 °CW przeciwnym razie wykorzystuje się ciepło promieniujące z lampy.
4. Szpilki. W celu unieruchomienia mięśnia kremastra na podstawce przygotowuje się szpilki z igieł entomologicznych o średnicy 0,15 mm, zgiętych w kształt litery „L”.
5. Fizjologiczny roztwór soli (PSS). Preparaty są stale superfuzowane (przemywane) PSS z buforem wodorowęglanowym, przygotowanym w wodzie ultrapurej (18,2 MΩ) H₂O. Roztwory zapasowe przygotowuje się w 20-krotnym stężeniu roboczym i sterylizuje za pomocą 0.2 μm filtrować. Roztwory zapasowe pozostają stabilne przez kilka tygodni podczas przechowywania w 4°CPrzygotowanie soli oddzielnie od wodorowęglanu i ich mieszanie z rozcieńczeniem w dniu eksperymentu zapobiega wytrącaniu się wodorowęglanu wapnia. Roztwór soli zapasowy składa się z (w mmol/L): 2638 NaCl, 94 KCl, 40 MgSO4₄, 23,4 CaCl₂Roztwór zapasu wodorowęglanów zawiera 360 NaHCO3₃W dniu przeprowadzenia eksperymentu odpowiednie roztwory doprowadza się do objętości końcowej (zazwyczaj 2 l dla danego eksperymentu) w kolbie miarowej, a następnie umieszcza w łaźni wodnej o temperaturze ok.37°CRównoważenie PSS z 5% CO2₂ / 95% N₂ przez około 15 minut przy użyciu dyspergera gazowego, co pozwala dostosować pH do poziomu około 7,4 i zapobiega precypitacji. Przez PSS stale przepływa 5% CO2₂ / 95% N₂ przez cały czas trwania eksperymentów. Końcowy skład roztworu roboczego (w mmol/L) to: 132 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgSO4₄, 2 CaCl2₂, 18 NaHCO3₃.

2. Znieczulenie i przygotowanie do operacji

1. Po uzyskaniu zgody Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt wykorzystuje się samce myszy w wieku co najmniej 12 tygodni. Mysz jest znieczulana pentobarbitalem sodowym (60 mg/kg) poprzez wstrzyknięcie domięśniowe (i.p.). Do unieruchomienia myszy podczas pierwszej iniekcji przydatna jest rurka ograniczająca. W trakcie procedur chirurgicznych i protokołów eksperymentalnych znieczulenie podtrzymuje się za pomocą dawek uzupełniających (10-20% dawki początkowej, i.p.) w razie potrzeby (co 30-60 minut; wskazuje na to reakcja wycofania po uciśnięciu palca u stopy lub ogona). Wskazówka: Rozcieńczenie pentobarbitalu do stężenia 10 mg/ml w sterylnym roztworze soli fizjologicznej przed wstrzyknięciem zmniejsza ryzyko przedawkowania.
2. Znieczulenie upośledza regulację temperatury, dlatego mysz musi być utrzymywana w cieple natychmiast po pierwszej iniekcji. Skuteczne jest umieszczenie myszy w metalowym transporterze (wentylowanym koszyku aluminiowym) na płycie grzewczej (skalibrowanej na ˜37 °C). Alternatywnie można użyć lampy grzewczej, dbając o jej umieszczenie w odpowiedniej odległości od myszy. Stan myszy należy monitorować co 5-10 minut, aż do osiągnięcia odpowiedniego poziomu znieczulenia (brak reakcji wycofania po uciśnięciu palca u stopy lub ogona). Po 15-20 minutach może być wymagana dawka uzupełniająca. Najlepiej zachować cierpliwość i ostrożność, aby uniknąć przedawkowania, zwłaszcza w przypadku zwierząt otyłych lub starszych.
3. Włosy z dolnej części brzucha, dolnej części pleców, moszny i nóg usuwa się poprzez ostrożne ogolenie odpowiednich obszarów. Należy zwrócić szczególną uwagę, aby nie uszkodzić moszny i jąder, co w przeciwnym razie spowodowałoby uraz mięśnia opuszkowego. Luźne włosy należy usunąć świeżym gazikiem nasączonym alkoholem.
4. Jeśli pęcherz jest pełny, będzie wyczuwalny przez ścianę brzucha jako mała winogrona. Opróżnij pęcherz, wywierając delikatny nacisk, aby zapobiec oddawaniu moczu przez mysz na preparat mięśnia opuszkowego podczas eksperymentów. Do zbierania moczu efektywną gąbką jest chusteczka Kimwipe.
5. Ułóż mysz na plecach, opierając ją o klin, tak aby nogi obejmowały postument. Sznur jedwabny (4-0 lub 5-0) przywiązany do każdej stopy służy jako wiązadło do zabezpieczenia myszy kroczem przy postumencie. Kawałek taśmy luźno położony na klatce piersiowej i przymocowany do klina utrzymuje ogólną pozycję ciała. Procedury chirurgiczne wykonuje się przy użyciu stereomikroskopu, korzystając z nożyczek do mikrodysekcji i pęsety kątowej.

3. Chirurgiczne przygotowanie otwartego mięśnia kremaster

1. Przez wierzchołek worka mosznowego (lewy lub prawy) wprowadza się szpilkę i mocuje ją w podeście, aby napiąć skórę. Nad polem operacyjnym rozpoczyna się superfuzję roztworem PSS (34-35 °C), którą kontynuuje się przez cały czas trwania sekcji, aby utrzymać odsłoniętą tkankę w cieple i wilgoci. Knot (wykonany z Kimwipe), którego jeden koniec znajduje się obok worka mosznowego, a drugi przy linii próżniowej, odprowadza odpływający PSS. Kropla uszczelniacza silikonowego przyklejona do płyty z pleksiglasu i całkowicie otaczająca klin oraz podest służy jako „fosy” do zbierania każdego PSS, który nie zostanie odessany, stanowiąc skuteczną ostrożność w celu zapobiegania wyciekowi PSS na mikroskop.
2. Wykonuje się nacięcie wzdłuż brzusznej powierzchni worka mosznowego. Jeśli jądro zostało wciągnięte przez mięsień opuszkowy do jamy brzusznej, delikatny nacisk na dolną część brzucha kieruje jądro do worka. Należy w tym momencie zidentyfikować powierzchnię mięśnia opuszkowego pokrywającego jądro. Tkankę łączną pomiędzy skórą moszny a mięśniem opuszkowym ostrożnie usuwa się, aby uwolnić mięsień opuszkowy z otaczających go tkanek.
3. Skórę moszny delikatnie odsuwa się za proksymalną krawędź podstawy i mocuje po obu stronach szpilkami. Następnie z zewnętrznej powierzchni mięśnia opuszkowego usuwa się tkankę łączną. Ciągła superfuzja podczas sekcji nawadnia tkankę łączną, co ułatwia jej widoczność i usunięcie.
4. Szpilkę wprowadzoną przez wierzchołek mięśnia opuszkowego wykorzystuje się do jego napięcia wzdłuż. Wykonuje się nacięcie podłużne przez brzuszna powierzchnię mięśnia, zachowując szczególną ostrożność, aby zminimalizować uszkodzenie naczyń krwionośnych. Dynamika przepływu krwi w pobliżu obwodu preparatu ulega zmianie w wyniku tego uszkodzenia tkanek¹⁴. Dlatego, aby zminimalizować te wpływy na gromadzenie danych, do obrazowania i badań fizjologicznych wykorzystuje się naczynia krwionośne znajdujące się blisko centrum preparatu.
5. Mięsień opuszkowy jest połączony cienką więzadłem z najduszką znajdującą się pod jądrem. Odsuniecie jądra na jedną stronę odsłania to więzadło, które ostrożnie oddziela się od najduszki. W pobliżu wierzchołka mięśnia opuszkowego znajduje się mała tętnica i żyła łączące go z najduszką. Okluzyjne zamknięcie tych naczyń między pincetami i ich rozdzielenie minimalizuje krwawienie. Jądro, najduszka, tętnica i żyła jądrzowa zostają podwiązane proksymalnie (szew jedwabny 4-0 lub 5-0), przecięte i usunięte (orchiektomia) wraz z powiązaną tkanką tłuszczową pachwinową. Alternatywnie jądro można delikatnie przesunąć z powrotem do jamy brzusznej i utrzymać za pomocą kawałka waty lub Kimwipe. Orchiektomia służy uniknięciu możliwego urazu tkanek podczas wpychania jąder z powrotem do jamy brzusznej. Nie stwierdzono zauważalnych różnic w jakości preparatu mikrokrążenia mięśnia opuszkowego (patrz Sekcja 3.8) przy zastosowaniu którejkolwiek z tych procedur^7,15.
6. Z zewnętrznej powierzchni mięśnia opuszkowego usuwa się pozostałą tkankę łączną, a następnie rozkłada się go promieniście na powierzchni podstawy. Krawędzie mocuje się szpilkami (patrz Sekcja 1.4) w 5-6 miejscach, aby utworzyć płaski płat mięśnia prążkowanego z nienaruszoną mikrokrążeniem.
7. Gotowy preparat przenosi się na stolik mikroskopu intravitalnego, poddaje ciągłej superfuzji (3-5 ml/min, 34 °C) i equilibracji przez 30 minut.
8. Integralność preparatu z mięśnia opuszkowego ocenia się według kilku kryteriów. Spontaniczny ton naczynioruchowy przy minimalnym urazie chirurgicznym jest wskazywany przez szybki przepływ w arteriolach i brak adherentnych leukocytów w wenulach. Najbardziej czułym wskaźnikiem responsywnego preparatu jest skurcz arteriol po zwiększeniu zawartości tlenu w roztworze do superfuzji przez 5-10 minut. Odbywa się to poprzez equilibrację z 21% O₂ (wobec 5% O₂; patrz Sekcja 1.5; wszystko z 5% CO₂, reszta N₂). Obecność leukocytów w arteriolach, brak erytrocytów przepływających przez kapilary i/lub gromadzenie się leukocytów w wenulach i otaczających tkankach są oznakami uszkodzenia tkanek i stanu zapalnego.

4. Obrazowanie intravitalne mikrokrążenia mięśnia kremaster

1. Obrazowanie intravitalne jest przeprowadzane przy użyciu specjalistycznego mikroskopu opartego na platformie Olympus MVX10 Stereo Zoom. Korpus mikroskopu MVX10 jest zamontowany na hybrydowym statywie MVX10 wyposażonym w oświetlenie przechodzące (lampy halogenowej) do obrazowania w polu jasnym (Köhlera) oraz w oświetlenie epifokalne (lampy rtęciowej) do obrazowania fluorescencyjnego. Przy zastosowaniu oświetlenia epifokalnego GCaMP2 jest wzbudzany przy 472/30 nm, a emisja jest zbierana przy 520/35 nm. Obrazy są pozyskiwane przez obiektyw MV PLAPO 2XC (apertura numeryczna = 0.50; Olympus) przy użyciu wzmocnionej kamery cyfrowej XR/Mega-10 (Stanford Photonics, Inc.; SPI) za pomocą oprogramowania Piper Control Software (SPI) na komputerze osobistym. W tym systemie obserwowany obszar widzenia (FOV) może być zmienny w zakresie od 53 μm X 442 μm do 2 mm X 18 mm.
2. Po zakończeniu eksperymentów z obrazowaniem intravitalnym zależączona mysz jest poddawana eutanazji poprzez przedawkowanie pentobarbitalu, a następnie zwichnięcie szyi.

5. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Podkładka dla myszy do obrazowania intravitalnego preparatu mięśnia kremaster myszy. A) Klin pod ciało z platformą aluminiową (izolowaną żółtym tworzywem sztucznym) widziany od dołu. Grzałki przymocowane do spodu platformy zapewniają ciepło przewodzone. B) Platforma grzewcza spoczywa na plastikowym klinie. C) Klin pod ciało umieszczony jest na płycie z pleksiglasu do przeprowadzenia zabiegu chirurgicznego i późniejszego przeniesienia na stolik mikroskopu intravitalnego. Podstawa z Sylgardu zaznaczona jest czerwoną strzałką. Wokół całego preparatu znajduje się koralik wodoodpornego silikonu, aby zatrzymać wszelkie roztwory, które mogą wyciec podczas procedury intravitalnej, zapobiegając ich skapywaniu na mikroskop.

Rycina 2. Dostosowany mikroskop MacroZoom do obrazowania szerokopolowego. A) Korpus mikroskopu MVX10 (Olympus) z kamerą ICCD XR/Mega-10 (Stanford Photonics) zamontowaną w porcie trynocularnym. B) Widok z bliska korpusu mikroskopu. (a) regulacja zoomu (0,63 do 6,3X); (b) koło filtrów; (c) podwajacz obrazu (NA = 0,50 przy 25-krotnym powiększeniu optycznym). C) Kondensator podpomiałowy do oświetlenia w polu jasnym (Köhlera) (NA kondensatora = 0,5, odległość robocza = 27 mm).

Rycina 3. Gotowa preparacja mięśnia kremaster myszy. Zznieczulona mysz w pozycji grzbietowej na ciepłej, pokrytej tworzywem aluminiowej platformie (żółta). Pozycja ciała została zabezpieczona taśmą. Mięsień kremaster jest rozłożony promieniście na przezroczystym postumencie z gumy silastykowej i przytwierdzony szpilkami na brzegach. Roztwór perfuzyjny jest podawany na końcu proksymalnym za pomocą plastikowego dozownika (biała strzałka). Linia próżniowa (biały grot strzałki) odprowadza roztwór poprzez knot z chusteczki Kimwipe. Przedstawiono dwie mikropipety z końcówkami umieszczonymi w tkance. Elektroda referencyjna (srebrny drut) jest przymocowana do dolnej krawędzi mięśnia kremaster.

Rysunek 4. Ilustracja zakresu powiększenia dla wizualizacji sieci tęczniczych wykazujących ekspresję GCaMP2 w śródbłonku. A) obraz fluorescencyjny i B) obraz w polu jasnym wykonany przy powiększeniu optycznym 3,2X, co daje całkowite powiększenie = 42X na monitorze wideo. [Pole widzenia (FOV) = 4 375 x 3,470 μm]. Pasek skali = 500 μmPraca przy takim powiększeniu ułatwia umieszczenie mikropipet w wybranych miejscach. C) Obraz fluorescencyjny i D) obraz w świetle przechodzącym wykonane przy powiększeniu optycznym 6,4X dla całkowitego powiększenia = 83X (pole widzenia = 2 20 x 1,759 μm). Pasek skali = 200 μm. E) obraz fluorescencyjny i F) obraz w polu jasnym wykonane przy powiększeniu optycznym 12,6X dla powiększenia całkowitego = 165X (FOV = 1 10 x 885 μm). Pasek skali = 100 μmG) Z podwajaczem obrazu, powiększenie optyczne = 25,2X. Odcinek skali = 50 μm.

Dyskusja

Opisujemy tutaj preparat otwartego mięśnia kremastra u myszy do obserwacji mikrokrążenia. in vivoProcedura ta została opracowana na podstawie metody „otwartego” przygotowania mięśnia kremaster, po raz pierwszy opisanej u szczura⁴Dzięki praktyce cała procedura chirurgiczna może zostać przeprowadzona w czasie krótszym niż 1 godzina. Wszechstronność tej preparacji umożliwia zastosowanie wielu manipulacji eksperymentalnych; metoda ta jest łatwo adaptowalna zarówno do chomików, jak i szczurów, co pozwala na badanie różnorodnych modeli eksperymentalnych w podobny sposób. Preparacja jest ograniczona do samców; pomiary należy wykonywać w kierunku centrum tkanki, unikając obszarów uszkodzonych w pobliżu krawędzi mięśnia.¹⁴Należy również uznać, że rozkłady ciśnienia i przepływu ulegają zmianie w przypadku przecięcia naczyń łączących mięśnia opuszkowo-żylnego¹⁶mikronaczynia pozostają reaktywne i odpowiednie do powtarzalnego gromadzenia danych. Głównym ograniczeniem w obrazowaniu mikrokrążenia w mięśniu kremaster jest narastanie tkanki łącznej w miarę dojrzewania i wzrostu zwierząt, szczególnie u szczurów, ale także u chomików. Ponadto, wraz z przybieraniem na wadze przez zwierzęta, trudniej staje się kontrolować znieczulenie, ponieważ pentobarbital jest lipofilny i może być absorbowany przez tkankę tłuszczową. Najlepszym sposobem postępowania jest zachowanie cierpliwości przy jednoczesnym zapewnieniu, aby zwierzę°temperatura ciała jest utrzymywana na poziomie ~37°C °C podczas ciągłego przemywania odsłoniętej tkanki roztworem PSS.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorek sodu	Fisher Scientific	S642-212
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	P9541
Siarczan magnezu	Sigma-Aldrich	M2643
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	C1016
Wodorowęglan sodu	Fisher Scientific	S233
Roztwór Nembutalu sodowego	Lundbeck Inc	NDC 67386-501-55	Znany również jako pentobarbital sodu
Kontroler temperatury	Warner Instruments	TC-344B	Alternatywa: regulowany zasilacz 12V DC
Zestaw grzewczy platformy Series 20 RH-2	Warner Instruments	64-0274	Wymaga niestandardowej płyty aluminiowej
Kamera Mega-10	Stanford Photonics Inc	XR/Mega-10
MVX10	Olympus Corporation
Obiektyw MV PLAPO 2XC	Olympus Corporation
Statyw hybrydowy MVX10	Leeds	LBX-Hybrid
Oprogramowanie sterujące Piper	Stanford Photonics Inc		Program do kamery Mega-10
Stereomikroskop	Nikon Instruments	SMZ645
Wodoodporny silikonowy uszczelniacz (przezroczysty)	GE Healthcare	47970-72643-LW5000	Inne przezroczyste uszczelniacze silikonowe również będą odpowiednie
Szalka Petriego 60 x 15mm	Fisher Scientific	08-757-13A
Sylgard	Dow Corning	184
Nożyczki do mikrosekcji	Fine Science Tools	15003-08
Pinceta Dumont	Fine Science Tools	#5/45
Membrana GP Millipore Express PLUS	EMD Millipore	SCGPT05RE
Szpile entomologiczne Minutiens	Austerlitz	Rozmiar M 0.15 mm
Kompaktowy trymer do zwierząt	Wahl Clipper Corp.	Model 9966	Czyścić po każdym użyciu