Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model wewnątrznaczyniowego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) w udarze niedokrwiennym u myszy z prowadzeniem za pomocą laserowej dopplerometrii przepływu

51.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2879

⸱

8 maja 2011

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, University of Florida, 2Department of Anatomical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Model intraluminalnego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) jest najczęściej stosowanym modelem wśród eksperymentalnych modeli udaru niedokrwiennego. W niniejszym materiale szczegółowo zaprezentujemy cały model z wykorzystaniem laserowej flowmetrii dopplerowskiej oraz przedstawimy reprezentatywne wyniki.

Streszczenie

Udar mózgu jest trzecią najczęstszą przyczyną zgonów i wiodącą przyczyną niepełnosprawności na świecie, a szacowany koszt jego leczenia w Stanach Zjednoczonych w 2009 roku wyniósł blisko 70 miliardów dolarów1,2. Model intraluminalnego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) został opracowany przez Koizumi4 w 1986 roku w celu symulacji tej istotnej patologii ludzkiej u szczura. Modyfikację metody MCAO zaprezentował później Longa3. Obie techniki są powszechnie stosowane do identyfikacji mechanizmów molekularnych uszkodzeń mózgu wynikających z udaru niedokrwiennego oraz potencjalnych metod terapeutycznych5. Ta względnie nieinwazyjna metoda u szczurów została rozszerzona na myszy, aby umożliwić wykorzystanie szczepów transgenicznych i nokautowych6,7. W celu modelowania ogniskowego niedokrwienia mózgu, szew intraluminalny wprowadza się przez tętnicę szyjną wewnętrzną, aby zamknąć podstawę MCA. Usunięcie szwu po określonym czasie symuluje spontaniczną reperfuzję, jednak szew może zostać również pozostawiony na stałe. W niniejszym materiale wideo w sposób krok po kroku zaprezentowane zostaną dwa główne podejścia do przeprowadzania procedury intraluminalnego MCAO u myszy, a także wskazane zostaną potencjalne wady i pułapki. Niedokrwiona tkanka mózgowa zostanie następnie zabarwiona chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazoliu (TTC) w celu oceny zakresu zawału mózgu8.

Protokół

Protokół ten został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Florydy i jest zgodny z „Zasadami Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi” (publikacja NIH nr 86-23, wydaniez roku 1985).

1. Materiały

  1. Zwierzęta: Samce myszy C57BL/6 (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, USA) o masie 20–26 gramów w chwili operacji.
  2. Znieczulenie:
    1. Aparat do znieczulenia: system do znieczulenia inhalacyjnego VetEquip (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA).
    2. Środek znieczulający do inhalacji: izofluran (Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL).
  3. Narzędzia chirurgiczne: nożyczki irydowe SuperCut, proste (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA); mikro-nożyczki Vannasa, proste (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA); pęsety Dumonta (cienka końcówka, końcówki wygięte pod kątem 45°, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA); urządzenie do koagulacji bipolarnej (High Frequency Desiccator 900, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA); mikro-klips naczyniowy (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
  4. Materiały chirurgiczne: sterylne patyczki bawełniane; chusteczki; gazy chirurgiczne; szew (nić jedwabna 7-0, Ethicon, Inc., Somerville, NJ, USA); klej tkankowy (Vetbond, 3M Company, St Paul, MN, USA); środki do odkażania pola operacyjnego: Betadine, 70% etanol oraz sterylna 0,9% sól fizjologiczna; maść do oczu (Puralube Vet Ointment, Pharmaderm, Melville, NY, USA).
  5. Przygotowanie nici do okluzji dla MCAO:
    1. Filament do okluzji tętnicy środkowej mózgu (MCA): monofilamentowa chirurgiczna nić nylonowa 7-0 (Ethicon, Inc., Somerville, NJ, USA).
    2. Źródło ciepła do stępienia końcówki nici (Thermal Cautery Unit, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL).
    3. Krzemionkowy kauczuk w płynie (klej Silicone RTV, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA).
  6. Mikroskop chirurgiczny/do sekcji (Leica Stereo Microscope MZ6).
    1. Oświetlacz światłowodowy (Fiber Optic illuminator FO1–150, TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA).
  7. Laserowa dopplerowska pomiar przepływu (PeriFlux System 5000, Perimed, Sztokholm, Szwecja).
    1. Elastyczna mikrokońcówka (MT B500-0 Straight Microtip, Perimed, Sztokholm, Szwecja)
  8. Parametry temperatury:
    1. Monitor temperatury rektalnej (BAT-12, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL).
    2. Koc grzewczy (T/PUMP, TP600, Gaymar, NY, USA).
  9. Barwienie i ilościowy pomiar objętości zawału:
    1. 2% roztwór chlorku 2,3,5-trifenylotetrazolu (2% TTC, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA).
    2. Krojanka do mózgów myszy (Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, USA).
    3. Aparat cyfrowy (V1253, Kodak Co., Rochester, NY, USA).
    4. Oprogramowanie Image J (ImageJ 1.42q software, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA).

2. Kroki przedszablonowe

  1. Przed zabiegiem myszy są utrzymywane w cyklu światło/ciemność 12:12 z wolnym dostępem do wody i paszy dla gryzoni.
  2. Sznury do MCAO przygotowuje się poprzez stępienie 1-2mm końcówki sznura za pomocą ciepła oraz pokrycie 3-4mm trzonu sznura od jego końcówki płynną gumą silikonową i pozostawienie jej do wyschnięcia (7-0; średnica końcówki 0,20-0,25mm; długość powłoki 3-4mm; długość sznura 11-13mm). Na wszystkich wyżej wymienionych etapach należy zachować sterylność.
  3. Po zważeniu myszy indukuje się znieczulenie 4% izofluranem w komorze indukcyjnej, a następnie utrzymuje je podczas procedury za pomocą 1,5-2% izofluranu w mieszaninie gazów 30% O2 i 70% N2O podawanej przez maskę nosową.
  4. Mysz umieszcza się w pozycji brzusznej na gaziku położonym na powierzchni operacyjnej z kontrolą temperatury (koc termiczny); wygolono sierść z głowy.
  5. Do obu ocz nakłada się nawilżającą maść oftalmiczną i zamyka powieki, aby zapobiec wysychaniu oczu podczas procesu chirurgicznego.
  6. Wykonuje się nacięcie w linii środkowej (1 cm) na skórze nad sklepieniem czaszki od górnej linii karku do nasionu, a skórę odsuwa się bocznie, aby przymocować elastyczną mikrosondę (MT B500-0 Straight Microtip; średnica 0,5mm). Mikrosonda jest umieszczana prostopadle do powierzchni prawej części ciemieniowej czaszki (1 mm za bregmą i 5 mm bocznie od bregmy), aby monitorować przepływ krwi w obszarze MCA za pomocą laserowej flowmetrii dopplerowskiej.
  7. Przed obróceniem zwierzęcia do pozycji grzbietowej należy upewnić się, że elastyczna mikrosonda jest mocno przymocowana do czaszki. Szyję zwierzęcia umieszcza się na miękkiej podkładce, a nos w stożku nosowym aparatu do znieczulania. Pozwoli to na zachowanie odpowiedniej przestrzeni dla elastycznej mikrosondy.
  8. Wprowadza się rektalną sondę temperatury, aby utrzymać stałą temperaturę głęboką zwierzęcia na poziomie 37±0,5°C.
  9. Obie przednie i tylne łapy są przyklejane taśmą do powierzchni platformy operacyjnej, a ogon jest przyklejany do rurki rektalnej.

3. Operacja okluzji MCA:

  1. Pod mikroskopem operacyjnym, delikatnie unosząc luźną skórę, wykonuje się nożyczkami cięcie w linii środkowej szyi pomiędzy manubrium a żuchwą.
  2. Podlegające im parzyste ślinianki podżuchwowe są rozdzielane tępym sposobem, przy czym lewa ślinianka pozostaje in situ. Prawą śliniankę podżuchwową odsuwa się w kierunku kranialnym i mocuje wraz z mięśniem mostkowo-obojczykowo-sutkowym.
  3. Odsłonięta część mięśnia łopatkowo-gardłowego pokrywająca pochewkę szyjną jest ostrożnie rozdzielana za pomocą pęset.
  4. Prawą tętnicę wspólną szyjną (CCA) ostrożnie oddziela się i izoluje od nerwu błędnego oraz jego pochewki (znajdującej się bocznie od CCA).
  5. W tym punkcie rozdzielają się dwie metody chirurgiczne, najczęściej stosowane do wykonania okluzji MCA:

Metoda Koizumiego4

  1. Wokół prawego CCA przygotowuje się trzy luźne szwy okalające (jedwab 7-0).
  2. Identyfikuje się, izoluje i kauteryzuje tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA) (2-3mm dystalnie od rozgałęzienia). Następnie można ją przeciąć mikronożyczkami. Aby uniknąć przypadkowych uszkodzeń obwodowych w miejscu kauteryzacji, moc należy ustawić na 1 za pomocą pokrętła mocy. Jest to stałe ustawienie dla wszystkich kauteryzacji.
  3. Odpowiednie napięcie przykłada się do najbardziej proksymalnego szwu okalającego na CCA, aby zatamować przepływ krwi (podwiązanie trwałe). Zablokowanie przepływu weryfikuje się poprzez spadek wartości bazowej perfuzji korowej o ~50%.
  4. Następnie, tuż przed rozgałęzieniem CCA, umieszcza się zacisk naczyniowy, aby uniknąć przepływu wstecznego w czasie arteriotomii.
  5. Za pomocą mikronożyczek wykonuje się arteriotomię na CCA pomiędzy proksymalnym szwem podwiązanym a zaciskiem naczyniowym (bliżej miejsca podwiązania).
  6. Przez arteriotomię wprowadza się nylonową nić 7-0 z powłoką silikonową i tępym końcem, przesuwając ją aż do miejsca z zaciskiem naczyniowym. Pozostałe dwa luźne szwy okalające delikatnie zaciśka się wokół CCA pomiędzy arteriotomią a zaciskiem naczyniowym, aby zapobiec wyciekowi krwi wstecz przez CCA, uważając, by nie urazić ściany tętnicy; następnie usuwa się zacisk naczyniowy.

Metoda Longa3

  1. Tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA) identyfikuje się, wypreparowuje w możliwie największym stopniu (w pobliżu jej rozgałęzienia na tętnicę językową i tętnicę szczękową), koaguluje (przy mocy ustawionej na 1) i przecina mikro-nożyczkami.
  2. Dwa luźne szwy obwodowe (jedwab 7-0) przygotowuje się wokół bliższego odcinka tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA), tuż powyżej rozwidlenia tętnicy szyjnej wspólnej (CCA).
  3. Tętnicę szyjną wspólną (CCA) zamyka się tymczasowo za pomocą klipsa naczyniowego. Okluzyjność przepływu weryfikuje się poprzez spadek bazowych wartości perfuzji kory o ~50%.
  4. Następnie tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA) zamyka się tymczasowo klipsem naczyniowym powyżej dwóch luźnych szwów obwodowych, aby uniknąć przepływu wstecznego podczas arteriotomii.
  5. Arteriotomię wykonuje się mikro-nożyczkami w odsuniętej tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA) blisko kikutu.
  6. Nylonową nić 7-0 z powłoką silikonową, której końcówka została stępiona termicznie, wprowadza się przez arteriotomię w ECA i przesuwa, aż dotrze do założonego klipsa naczyniowego w ICA. Dwa luźne szwy obwodowe w bliższym odcinku ICA delikatnie zaciśka się wokół tętnicy szyjnej wewnętrznej, aby zapobiec refluksowi krwi przez ICA, dbając o to, by nie uszkodzić ściany tętnicy; następnie usuwa się klips naczyniowy.

Dalsza część procedury jest w dużej mierze zbieżna:

  1. Sznur zamykający jest powoli przesuwany przez tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA) w kierunku podstawy czaszki, aż do momentu wyczucia lekkiego oporu. Równoczesny spadek wartości przepływu krwi w mózgu do poziomu ok. 80% w stosunku do wartości bazowej jest potwierdzany za pomocą laserowej dopplerometrii przepływów. Dwie szwy kołnierzykowe są następnie zaciśnięte wokół wprowadzonego filamentu.
  2. W eksperymentach nad przejściowym niedokrwieniem mózgu sznur zamykający jest delikatnie wycofywany po 45 minutach. Ten punkt czasowy może być zmieniany w zależności od celów badawczych.
  3. Po wycofaniu filamentu miejsce arteriotomii zostaje zamknięte, aby zapobiec krwawieniu pooperacyjnemu. W metodzie Koizumi polega to na pewnym zaciśnięciu szwów kołnierzykowych wokół CCA. W technice Longi miejsce arteriotomii u podstawy ECA jest kauteryzowane, a następnie szwy kołnierzykowe w proksymalnej części ICA są poluzowywane i usuwane w celu przywrócenia przepływu w tętnicy szyjnej.
  4. Aby zamknąć nacięcie, gruczoł podżuchwowy oraz mięsień SCM są ułożone nad polem operacyjnym. Brzegi rany w obszarach szyjnych i skalpu są następnie zbliżone za pomocą kleju tkankowego. Alternatywnie, do zamknięcia rany można użyć szwu wchłanialnego lub metalowych zszywek, zwłaszcza gdy planowane jest długoterminowe przeżycie zwierzęcia.
  5. Po zamknięciu nacięcia zwierzę otrzymuje podskórnie 1 ml ciepłej soli fizjologicznej w celu uzupełnienia objętości płynów. Należy podać odpowiednią dawkę leków przeciwbólowych (np. buprenorfinę w dawce 0.05-0.1 mg/kg), aby zminimalizować ból i dyskomfort zwierzęcia w okresie rekonwalescencji. Zwierzę zostaje zabrane z bloku operacyjnego i umieszczone w ciepłej klatce/strefie rekonwalescencji, aby zapobiec hipotermii, z zapewnionym swobodnym i łatwym dostępem do miękkiego pokarmu i wody.

4. Pooperacyjna ocena neurologiczna

Po całkowitym odzyskaniu przytomności przez zwierzę, deficyty neurologiczne można ocenić za pomocą prostej skali (skali pięciostopniowej) w następujący sposób3:

  1. brak obserwowalnych deficytów
  2. brak wyprostowania przeciwstawnej przedniej łapy (łagodny ogniskowy deficyt neurologiczny)
  3. kręcenie się w kierunku przeciwstawnym do miejsca zawału (umiarkowany ogniskowy deficyt neurologiczny)
  4. upadanie w kierunku przeciwstawnym do miejsca zawału (ciężki ogniskowy deficyt neurologiczny)
  5. obniżony poziom świadomości bez ruchów spontanicznych

5. Barwienie i ilościowy pomiar objętości obszaru zawału mózgu

  1. Po 24 godzinach reperfuzji MCA, przeżywającą mysz ważymy, poddajemy głębokiej anestezji przy użyciu 4% izofluranu i uśmiercamy zgodnie z zatwierdzonym protokołem.
  2. Mózg ostrożnie wyjmujemy i umieszczamy w matrycy do krojenia mózgu myszy, a następnie cały mózg przedni tniemy w przekrojach koronarnych w odstępach 2 mm.
  3. Przekroje zanurzamy w 2% TTC w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) w temperaturze 37 °C na 20 minut. Po barwieniu TTC obszar zawału widoczny jest jako biała (niezabarwiona) tkanka sąsiadująca z ceglastoczerwoną (żywą) tkanką (Rycina 1).
  4. Przekroje seryjne fotografujemy za pomocą aparatu cyfrowego, a obszar zawału mierzymy w programie Image J.
  5. Dla każdego przekroju mierzymy obszar zawału (biały, niezabarwiony), obszar półkuli ipsilateralnej (biały i ceglastoczerwony, zabarwiony) oraz obszar półkuli kontralateralnej (ceglastoczerwony, zabarwiony). Objętość obliczamy poprzez zsumowanie reprezentatywnych powierzchni we wszystkich przekrojach i pomnożenie wyniku przez grubość plastra. Po korekcie o obrzęk, objętość zawału oblicza się następująco9:
    Skorygowana objętość zawału (CIV), % = [objętość półkuli kontralateralnej - (objętość półkuli ipsilateralnej - objętość zawału)]/objętość półkuli kontralateralnej x 100

6. Reprezentatywne wyniki

Po zamknięciu i ponownym otwarciu tętnicy środkowej mózgu (MCA) poprzez lewą wspólną tętnicę szyjną (CCA) w celu wywołania przejściowego niedokrwienia mózgu, zwierzęta są uśmiercane, a ich mózgi, pocięte w przekrojach czołowych, są barwione TTC w celu oceny objętości zawału (Rycina 1).

Schemat przekroju poprzecznego nasion podkreślający różnice fizjologiczne dla badań rolniczych.
Rycina 1. Seryjne koronalne przekroje mózgu (2 mm) barwione TTC od myszy poddanych okluzji MCA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Model MCAO jest uznanym modelem odtwarzającym niedokrwienie mózgu u gryzoni. Model ten został po raz pierwszy zastosowany u szczurów, a następnie zaadaptowany dla myszy. Zaletą tej techniki jest brak konieczności wykonywania kraniektomii, co pozwala wyeliminować wpływ manipulacji chirurgicznych na przepuszczalność bariery krew-mózg oraz ciśnienie wewnątrzczaszkowe. Niemniej jednak wiele zmiennych, takich jak różnice między szczepami10, rozmiar końcówki szwy11, czas trwania okluzji6, tempe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Samce myszy C57BL/6ZwierzęHarlan Laboratories20-26 g
Mikroskop stereoskopowyMikroskopLeica Microsystemszoom 6.3:1
Światłowodowy iluminatorIluminatorTechniQuip Corp., Livermore, CA, USAFO1–-150
IzofluranZnieczulenieBaxter Internationl Inc.1001936060
Nożyczki tęczówkowe SuperCut, prosteNarzędzie chirurgiczneWorld Precision Instruments, Inc.14218
Mikronożyczki Vannasa, prosteNarzędzie chirurgiczneWorld Precision Instruments, Inc.14003
Pinceta Dumonta z cienką końcówkąNarzędzie chirurgiczneWorld Precision Instruments, Inc.503290
Klip naczyniowyNarzędzie chirurgiczneWorld Precision Instruments, Inc.14120
Wysokoczęstotliwościowy osuszacz 900Narzędzie chirurgiczneWorld Precision Instruments, Inc.500397
Szycie chirurgiczne mononylonowe 7-0SzycieEthicon Inc.1647GSzycie do okluzji
Szycie chirurgiczne jedwabne 7-0SzycieEthicon Inc.7733GSzycie do ligacji
Klej silikonowy RTVGuma silikonowaWorld Precision Instruments, Inc.1571
VetbondKlej tkankowy3M70200746587
Maść do oczu Puralube VetMaść do oczuPharmaderm Animal Health
Wodorochlorek buprenorfinyLeki przeciwbóloweHospira Inc.NDC 0409-2012-32
Urządzenie do kauteryzacji termicznejWorld Precision Instruments, Inc.501292
System PeriFlux 5000Flowmetria TCDPerimed
BAT-12Termometr rektalnyWorld Precision Instruments, Inc.BAT-12R
T/PUMP, TP600Koc grzewczyGaymar Industries
chlorek 2,3,5-trifenylotetrazoliowyOdczynnikSigma-AldrichT8877
Szatkownica do macierzy mózgu myszySzatkownica do mózguZivic InstrumentsBSMAS001-1

Bibliografia

  1. Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders. Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 1407-1431 (1989).
  2. Lloyd-Jones, D. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, e21-e181 (2009).
  3. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 84-91 (1989).
  4. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. I. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
  5. Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurol Res. 19, 641-648 (1997).
  6. Fujii, M. Strain-related differences in susceptibility to transient forebrain ischemia in SV-129 and C57black/6 mice. Stroke; a journal of cerebral circulation. 28, 1805-1810 (1997).
  7. Bederson, J. B. Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 17, 1304-1308 (1986).
  8. Qi, X., Hosoi, T., Okuma, Y., Kaneko, M., Nomura, Y. Sodium 4-phenylbutyrate protects against cerebral ischemic injury. Mol Pharmacol. 66, 899-908 (2004).
  9. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13, 683-692 (1993).
  10. Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice. Neurosurgery. 56, 196-200 (2005).
  11. Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke; a journal of cerebral circulation. 35, 1720-1725 (2004).
  12. Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism? Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

okluzyjne szyciezawa m zgubarwienie TTCdeficyty neurologicznemodel mysiocena reperfuzji
Model wewnątrznaczyniowego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) w udarze niedokrwiennym u myszy z prowadzeniem za pomocą laserowej dopplerometrii przepływu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.