Modelowanie neuronalnej sygnalizacji immunologicznej epizodycznej i przewlekłej migreny za pomocą rozprzestrzeniającej się depresji in vitro

Aya D. Pusic; Yelena Y. Grinberg; Heidi M. Mitchell; Richard P. Kraig

doi:10.3791/2910

Artykuł metodologiczny

Modelowanie neuronalnej sygnalizacji immunologicznej epizodycznej i przewlekłej migreny za pomocą rozprzestrzeniającej się depresji in vitro

23.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2910

⸱

13 czerwca 2011

Aya D. Pusic^*¹ , Yelena Y. Grinberg^*¹ , Heidi M. Mitchell² , Richard P. Kraig¹

¹Department of Neurology and Committee on Neurobiology, The University of Chicago Medical Center, ²Department of Neurology, The University of Chicago Medical Center

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Migrena i jej przemiana w przewlekłą migrenę to ogromne obciążenie zdrowotne, które wymaga poprawy metod leczenia. Staramy się określić, w jaki sposób neuronalna sygnalizacja immunologiczna moduluje podatność na migrenę, modelując in vitro przy użyciu rozprzestrzeniającej się depresji w kulturach warstw hipokampa, jako sposób na opracowanie nowych celów terapeutycznych.

Streszczenie

Migrena i jej przemiana w przewlekłą migrenę to obciążenia zdrowotne, które wymagają poprawy metod leczenia. Staramy się określić, w jaki sposób neuronalna sygnalizacja immunologiczna moduluje podatność na migrenę, modelowaną in vitro przy użyciu rozprzestrzeniającej się depresji (SD), jako sposób na opracowanie nowych celów terapeutycznych dla epizodycznej i przewlekłej migreny. SD jest prawdopodobną przyczyną aury migrenowej i bólu migrenowego. Jest to napadowa utrata funkcji neuronalnych wywołana początkowo zwiększoną aktywnością neuronalną, która powoli rozprzestrzenia się w podatnych obszarach mózgu. Normalne funkcjonowanie mózgu jest niezwykle wrażliwe na zbieżną sygnalizację immunologiczną niskiego poziomu i opiera się na niej. Tak więc neuronalna sygnalizacja immunologiczna prawdopodobnie wpływa na aktywność elektryczną SD, a tym samym na migrenę. Badania percepcji bólu SD u całych zwierząt są najeżone trudnościami, ale całe zwierzęta są dobrze przystosowane do badania aspektów biologii systemowej migreny, ponieważ SD aktywuje trójdzielne szlaki nocyceptywne. Jednak same badania na całych zwierzętach nie mogą być wykorzystane do rozszyfrowania mechanizmów obwodów komórkowych i nerwowych SD. Zamiast tego konieczne są preparaty in vitro, w których można kontrolować warunki środowiskowe. W tym miejscu ważne jest, aby zdać sobie sprawę z ograniczeń ostrych plastrów i wyraźnych zalet kultur plastrów hipokampa. Ostre wycinki mózgu nie mogą ujawnić subtelnych zmian w sygnalizacji immunologicznej, ponieważ samo przygotowanie wycinków wyzwala: zmiany prozapalne, które trwają kilka dni, zachowanie padaczkowe spowodowane wysokim poziomem ciśnienia tlenu potrzebnego do ożywienia wycinków i nieodwracalne uszkodzenie komórek w beztlenowych środkach plasterków.

Natomiast badamy sygnalizację immunologiczną w dojrzałych kulturach wycinków hipokampa, ponieważ kultury te są ściśle równoległe do swoich odpowiedników in vivo z dojrzałą funkcją trisynaptyczną; wykazują poziomy astrocytów w stanie spoczynku, mikrogleju i cytokin; a SD jest łatwo indukowane w preparacie nieznieczulonym. Co więcej, plastry są długotrwałe, a SD może być indukowane przez kolejne dni bez urazów, co czyni ten preparat jedynym jak dotąd środkiem zdolnym do modelowania neuroimmunologicznych konsekwencji przewlekłej SD, a tym samym być może przewlekłej migreny. Używamy technik elektrofizjologicznych i nieinwazyjnego obrazowania do pomiaru funkcji komórek neuronalnych i obwodów zbieżnych z SD. Zmienne ekspresji genów odporności neuronalnej są mierzone za pomocą badań przesiewowych qPCR, matryc qPCR i, co ważne, stosowania preamplifikacji cDNA do wykrywania celów o bardzo niskim poziomie, takich jak interferon gamma, przy użyciu próbkowania całych, regionalnych lub specyficznych komórek (za pomocą mikroskopii laserowej). Sygnalizacja kaskadowa cytokin jest dalej oceniana za pomocą multipleksowanych celów związanych z fosfoproteinami z ekspresją genów i zmianami fosfoproteinowymi potwierdzonymi za pomocą barwienia immunologicznego specyficznego dla komórki. Strategie farmakologiczne i siRNA są stosowane do naśladowania i modulowania sygnalizacji immunologicznej SD.

Protokół

Kilka punktów jest warto podkreślić dla pomyślnego badania sygnałowania związanego z odpornością w przekrojach mózgu. Po pierwsze, bodźce inicjujące muszą synchronicznie depolaryzować wystarczającą objętość szarej substancji mózgu, aby rozpocząć SD. Oznacza to, że wymagana jest konfiguracja interfejsu (tj. tylko płyn ekspozycji poniżej i gazowy wymiana na powierzchni wkładu kultury przekroju) ^1,2. Po drugie, ostre przekroje mózgu utrzymują SD, ale trauma z ich przygotowania, jak również stosowanie 95% tlenowej aerowany roztwór Ringera powoduje zmiany prozapalne i zachowanie epileptyczne odpowiednio, co może zmienić funkcję obwodu neuronowego i homeostazę odpornościową.³ Po trzecie, podczas gdy kultury przekrojów hipokampu przezwyciężają te ostre ograniczenia przekrojów, ważne jest, aby pamiętać, że kultury przekrojów powinny być utrzymywane przez odpowiednie okresy przed użyciem (tj. więcej niż 10 dni in vitro) aby mikroglea i astrocyty stały się spoczynkowe.^3-5 Wreszcie, SD powinno być indukowane przy użyciu sterylnych i aseptycznych technik. Techniki opisane poniżej są zaprojektowane, aby spełnić to zapotrzebowanie.

1. Depresja rozprzestrzeniająca się w kulturach przekrojów

Przygotowanie i utrzymanie kultury.
1. Kultury przekrojów są przygotowywane i utrzymywane w pożywce opartej na surowicy koniowej lub w pożywce bez surowicy (SFM)^6,7 jak opisano wcześniej⁸ z niewielkimi modyfikacjami pożywki. Parametry inkubacji to 36°C, 5% CO₂, 95% wilgotność-równowaga powietrza.
  1. Znalazłem, że kultury mogą być przełączone na SFM po 18 dniach in vitro i utrzymywane do co najmniej 35 dni in vitro poprzez zastosowanie naszej wcześniej zdefiniowanej SFM, która zawiera dodatkowe wapń i magnez.
  2. Dodatkowo, antybiotyki i przeciwgrzybicy są dodawane, aby zapobiec zakażeniom związanym z wielokrotnymi epizodami rejestracji.
  3. Ta długoterminowa (lub rejestrująca) formuła pożywki zawiera (na 100 ml): pożywka Neurobosal, 97 ml; Gem-21, 2,0 ml; Glutamax (200 mM), 0,5 ml; Gentamycin (10 mg/mL), 10 μL; D-glukoza (45%), 680 μL; kwas askorbinowy (0,5 M), 100 μL; Fungizone, (250 mg/mL), 400 μL; NaCl (5,0 M), 820 μL, Mg₂Cl₂ (1,0 M), 80 μL; CaCl₂ (1,0 M), 160-240 μL.
  4. Kultury są używane do SD od 21-35 dni in vitro.
2. Weryfikacja żywotności.^3,6,7
  1. Kultury są przesiewane na obecność wskaźników śmierci neuronów piramidalnych przed użyciem.
    1. W 18 dniu in vitro wkłady są inkubowane przez 20 min w pożywce (w normalnych warunkach inkubacji) zawierającej 5 μM Sytox Green, marker, który staje się fluorescencyjny, gdy wiąże się z DNA (tj. penetrując do martwych komórek).
    2. Wkłady są następnie przeniesione z powrotem do poprzedniej pożywki i badane metodą mikroskopu fluorescencyjnego (504 ekscytacja i 523 emisja) pod kątem wskaźników uszkodzenia warstwy neuronów piramidalnych CA3 lub CA1.
      1. Przekrojów z więcej niż 20 komórek lub z ustaloną poziomem fluorescencji większym niż 250 IU wykluczono z dalszego użycia.
Wytwarzanie materiałów.
1. Elektrody gruntowe są wykonywane z rur szklanych (2,0 mm OD / 1,16 mm ID) przeciętych na długość 4,5 mm i krótko polerowanych ogniskowo na obu końcach.
  1. Wykonujemy około 20 elektrod na raz, które mogą trwać ponad rok.
  2. Zaparzamy 100 ml 1M KCl do wrzenia i dodajemy z mieszaniem 3,5 g agaru i 0,5 g EDTA (etionodiaminatetraoctowa kwas disodowy dihydrat) aby uzyskać klarowny żółty roztwór.
  3. Używamy krótkiego odcinka elastycznego wężyka zamocowanego na każdej szklanej rurze, aby wciągnąć ciepły roztwór KCl/agar do rurek szklanych, a także na krótki odcinek do elastycznego wężyka.
    1. Zwolnić ssanie i pozwolić, aby KCl/agar powoli kapał z otwartego końca rury szklanej; następnie przytrzymaj otwarty koniec rury szklanej o kawałku lodu.
    2. Ostatnia operacja spowoduje, że agar żeluje na końcu elektrody i nie żeluje po cofnięciu się z powrotem do rury szklanej.
  4. Gdy agar żeluje w zimnej wodzie, elastyczny wężyk można usunąć bez zmiany pozycji agaru umieszczonego w rurach szklanych.
  5. Umieść 0,5 ml 1 M KCl do każdej komórki rurkowego stolika do wirówek o pojemności 1,5 ml. Następnie umieść jeden koniec każdej wypełnionej KCl/agar rury szklanej w pojedynczych komórkach.

Dyskusja

SD to napadowe zaburzenie mózgu, którego cechy są wysoce konserwatywne u wszystkich gatunków i regionów mózgu zbadanych do tej pory. SD jest powszechnie badane w korze nowej. Jednak złożoność obwodów neuronalnych tej struktury (w porównaniu z hipokampem), a także niezdolność do utrzymania kory nowej przy życiu in vitro ze spoczynkowymi funkcjami immunologicznymi przez dłuższy czas, sprawiają, że jest ona mniej przydatna jako preparat in vitro do definiowania długoterminowych konsekwencji podatności na SD. W przeciwieństwie do tego, hipokamp jest nie tylko strukturą mózgu, która jest najbardziej wrażliwa na SD, jest to również struktura architektoniczna o bardziej uproszczonej strukturze i funkcji obwodu nerwowego, która dobrze nadaje się do zdefiniowania środków neuroimmunologicznych, za pomocą których aktywność neuronalna może modulować podatność na SD.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS-19108), National Institute of Child Health and Disease (PO1-HD09402), Migraine Research Foundation i White Foundation. Pani Marcia P. Kraig pomagała w przygotowaniu i utrzymaniu systemów hodowli.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Basal Medium Eagle	Invitrogen	21010
Earle's Balanced Salt Solution	Sigma	E2888
Serum dla koni	Invitrogen	26050-088
Glutamax	Invitrogen	35050
Gentamycyna	Invitrogen	15710-064
Fungizone	Invitrogen	15295
D-glucose	Sigma	G8769
Tabela 1. Przygotowanie i utrzymanie hodowli: Podłoże dla surowicy konia
[nagłówek]
Neurobaseal	Invitrogen	21103
Gem-21 Neuroplex	Gemini Bioproducts	400-160-010
Glutamax	Invitrogen	35050
Gentamycyna	Invitrogen	15710-064
D-glukoza	Sigma	G8769
Kwas askorbinowy	Sigma	A4544
Fungizone	Invitrogen	15295
Chlorek sodu	Sigma	S6546
Chlorek magnezu	Sigma	M1028
Chlorek wapnia	Sigma	21115
Tabela 2. Przygotowanie i utrzymanie hodowli: Pożywka bez surowicy
[nagłówek]
Wkładki do hodowli tkankowych Millicell-CM (30 mm)	Thermo Fisher	PICM0-3050
6-dołkowe naczynia	hodowlane FalconThermo Fisher	08-772-1B
Sytox Green	Invitrogen	S7020
Tabela 3. Produkcja materiałów: Elektrody uziemiające
[header]
Szklane rurki kapilarne	AM Systems, Inc.		2mm x 1,16mm, 4 cale
KCl	Sigma	P5405
Agar	Fisher Scientific	A360
EDTA	Sigma	5134
Rurki	Masterflex	95809-34
1,5 mL Stojak na probówki wirówkowe	Fisher Scientific
Srebrny drut	Medwire	AG15X
Hemostat	Fine Scientific Tools	13018-14
Płyta szmerglowa	Walgreens
Fiolka scyntylacyjna	Fisher Scientific
Elastyczny klej uszczelniający	Amazing Goop
Bleach	Clorox
Tabela 4. Produkcja materiałów: Elektrody uziemiające
[nagłówek]
Filament borokrzemianowy	Sutter Instruments	BF150-86-10	1,5 x 0,86 mm
Micr– ściągacz do okularów	Narashige	PE-2
Okular mikrometr optyczny	Zeiss
Stage mikrometr optyczny	Mikroskop zeiss
Mikroskop złożony	Szkiełka mikroskopowe Zeiss
	Surgipath	00210
1-wymiarowy micr– manipulator lektora	Narashige	MO-10
3-wymiarowy micr– manipulator lektrodowy	Narashige	MM-3
Szpachlówka samoprzylepna	Scotch
100 mm Pojemniki Nalgene	Fisher Scientific
Tabela 5. Produkcja materiałów: Elektrody rejestrujące
[header]
Drut platynowo-irydowy pokryty teflonem	Systemy AM	7780	125 μ m goły, 200 μ Kleszcze powlekane m
	Thermo Fisher	13-812-38
Hemostat	Fine Scientific Tools	13018-14
Drut o grubości 30	Tensolite
	Tools	UTC 100
Lut	Bernzomatic		, bezołowiowy, srebrny łożysko
Skoncentrowany HCl	Fisher Scientific	A144-212
Pipeta Pasteura	Fisher Scientific	13-678-30
Wodoodporne epoksydowe	JB Weld
	Newark Electronics
Tabela 6. Produkcja materiałów: Elektrody stymulujące
[nagłówek]
Naczynie hodowlane Falcon 35 mm	Becton Dickinson Labware
Rurki szklane z filamentem	Sutter Instrument Co.	BF100-58-10	1,0 mm, 12 mm długości
Kwadraty bawełniane	Walgreens
Kleszcze	Thermo Fisher	13-812-38
Rurki	Masterflex	95809-34
Folia z polichlorku winylu	Fisher Scientific	01810	18 cali x 1000 stóp
# 9 żyletka z pojedynczą krawędzią	Smith
Tabela 7. Produkcja materiałów: Nagrywanie naczyń
[nagłówek]
Komora zapisu	Medical Systems Corp.	PDMI-2	Komora zapisu
Bipolarna kontrola temperatury	Medical Systems Corp.	TC-202
Kombinowana elektroda pH	Mikroelektrody Inc.	MI-413
	Beckman	250	Zasilany bateryjnie
termopara Mini Type-T	Termometr	serii
	Cole-Palmer	8528-10
Grzałka liniowa	Warner Instruments	SH278
Stół Gibraltor	Mikroskop
	Leica	DMIRE2
Stół antywibracyjny	Producent techniczny’ s Corp	63-541
Narzędzie do kauteryzacji	Gemini		Zasilany bateryjnie
Micr– mikromanipulatory elektryczne	Narashige	WR60	Lewy i prawy
Zasilacz stabilizowany	Systemy UPS MGE	Elipsa 1200	+/- 5 V (łącznie 120)
System wzmacniacza Axoprobe	Instrumenty Axon	1-A
Filtr aktywny	Urządzenia częstotliwościowe	Model 900
Axoscope Digidata	Axoscope	1322-A
Oprogramowanie Axoscope	Axoscope	v. 9
Systemy komputerowe	Dell	Precision T5400
Origin8	OriginLab Corp	v. 8.1
Jednostka izolacyjna stymulatora	Bak Electronics, Inc.	BSI-II
Magnesy pozycyjne 1/2 cala	Dexter	PMO90-3
3-calowe magnesy pozycyjne	Dexter	PMC-800T
Wiele X-Blocks	Narishige	X-12	Do pozycjonowania przegubów kulowych
Zawory	Hamilton	HVD-3	Do średniego dostarczania
Pompa strzykawkowa	Razel	A99
Digital oscyloskop			Agilant
kamer cyfrowych	Quant EM	512-SC
Oprogramowanie MetaMorph	Urządzenia molekularne	v. 7.5.04
Obiektyw mikroskopu ostrość z Pi foc	Physik Instrumente	E-662.LR
Inteligentna migawka	Lambda SC
Mikroskopia fluorescencyjna o podwójnej długości fali	Applied Scientific Instruments	Polychrome II
Pompy perystaltyczne	Masterflex	77120-62
Aspirator	Aparat		PDMI komponent
Tabela 8. Konfiguracja elektrofizjologiczna
[nagłówek]
1 M Chlorek	magnezuSigma	057K8620
1 M Chlorek Manganu	Sigma	018K6107
1 M Chlorek wapnia	Sigma	GA10984
AlexaFluor594 Isolectin-IB₄	Invitrogen	I21413
Neurobasal	Invitrogen	21103
Film z polichlorku winylu	Fisher Scientific	01810
MetaMorph	Molecular Devices	v. 7.5.04
Mikroskop odwrócony	Leica	DMIRE2
Kamera	QuantEM	512SC
Światło UV	Kubler	CODIX
Bipolarny regulator temperatury Medical	Systems Corp	TC-202
Inteligentna migawka	Lambda SC
Sytox Green	Invitrogen	S7020
Falcon 35 mm naczynia hodowlane	Becton Dickinson Labware
Rurki z włókna szklanego	Sutter Instrument Co.	BF100-58-10	Rurka o długości 1,0 mm, 12 mm
Masterflex		95809-34
Komora nagraniowa	Medical Systems Corp.	PDMI-2	Komora zapisu
Bipolarna kontrola temperatury	Medical Systems Corp.	TC-202
Kombinowana elektroda pH	Mikroelektrody Inc.	MI-413
Stół Gibraltor	Stół
Producent	techniczny’ s Corp	63-541
Tabela 9. Vital Imaging in Hippocampal Slice Cultures
[header]
RNAlater	Ambion	AM7021
Probówki mikrowirówkowe 1,5 ml bez RNaz/DNaz	USA Scientific	1615-5500
Nóż diamentowy	Narzędzia do nauki precyzyjnej	10100-00
Pędzel z cienką końcówką	Ted Pella	11806
TRIzol	Invitrogen	15596-026
Wirówka	Eppendorf	5451C
Vortex-genie	VWR	G-560
Tabela 10. Przygotowanie do PCR: Slice Culture Harvest
[header]
Wirówka chloroform	Sigma	C-2432
	Eppendorf	5451C	w chłodni
Etanol, 200 dowód dla biologii molekularnej	Sigma	E7023
RNeasy Micro kit	Qiagen	74004
Tabela 11. PCR Przygotowanie: Ekstrakcja RNA
[nagłówek]
Nanodrop 2000	Thermo Fisher	ND-2000
Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy	Sigma	M-1254
drabinka ssRNA	NEB	N032S
Octan sodu	Sigma	S-9513
EDTA	Sigma	E5134
Roztwór bromku etydyny	Bio-Rad	161-0433
OWL easycast poziome systemy mini-żelowe	Thermo Fisher	B1
Źródło prądu do elektroforezy	Bio-Rad	PowerPac HC
Ultrapure Agaroza	GibcoBRL	15510-019
Kuchenka mikrofalowa	Samsung
RNaza Away	Molecular Bioproducts	7000
Tabela 12. Przygotowanie do PCR: Kwantyfikacja RNA
[nagłówek]
Termocykler iCycler	Bio-Rad	iCycler Oprogramowanie
	systemowe iCyclerBio-Rad	v. 3.1
Płytki iCycler iQ PCR, 96 dołków	Bio-Rad	2239441
Paski z płaską nakrętką - optycznie przezroczyste. Pasek z 8 nakrętkami	Bio-Rad	TCS0803
iScript zestaw do syntezy cDNA	Bio-Rad	170-8890
iQ SYBR Green supermix	Bio-Rad	170-8880
Ultraczysta agaroza	GibcoBRL	15510-019
10x bufor TAE	GibcoBRL	15558-026
Kuchenka mikrofalowa	Samsung	SJ0390W
RNase Away	Molecular Bioproducts	7000
Roztwór bromku etydyny	Bio-Rad	161-0433
OWL easycast poziome systemy mini-żelowe	Thermo Fisher	B1
Źródło prądu do elektroforezy	Bio-Rad	PowerPac HC
Sekwencja			nazw
TNF-α F	5’ - ACC ACG CTC TTC TGT CTA CTG A- 3’
TNF-&alfa; R	5’ - KTG ATG, AGA, GGG, AGC, CCA, TTT, G- 3’
Rpl13a F	5’ - TTG CTT ACC TGG GGC GTC T- 3’
Rpl13a R	5’ - CTT TTT CCT TCC GTT TCT CCT CT C- 3’
Tabela 13. Działania PCR: optymalizacja starterów qPCR i wstępne badania przesiewowe
[header]
RT² Profiler PCR array	SABiosciences	PARN-021
RT² Zestaw do syntezy cDNA Nano preAMP	SABiosciences	C-06
RT² Mieszanka starterów syntezy cDNA Nano preAMP	SABiosciences	PBR-3021
RT² SYBR Zielony/ fluoresceina qPCR master mix	SABiosciences	PA-011
RT² Test startera qPCR dla szczura IFN-λ	SABiosciences	PPR45050C
Pilektor wielokanałowy	Corning
25 ml Zbiornik Bio-pure z rozdzielaczem	Zróżnicowany biotech	REBP-2000
iCycler termocykler	Bio-Rad	iCycler Moduł optyczny Oprogramowanie
systemowe iCycler	Bio-Rad v	. 3.1
Tabela 14. płytki macierzy qPCR i sygnalizacja niskiego poziomu
[nagłówek]
Wirówka	Fisher Scientific	Micro 7
Zestaw do lizy komórek	Bio-Rad	171-304011
Białko BSA	Bio-Rad	500-0007
Zestaw do oznaczania białek BCA	Thermo Scientific	23225
Taśma uszczelniająca	Bio-Rad	2239444
96-dołkowy czytnik płytek	Perkin Elmer	1420-licznik wieloetykietowy
Test Phospho 6-plex Lizaty	Bio-Rad	X7000000502
Kulki sprzężone Phospho 6-plex	Bio-Rad	X700000050
Tabela 15. Multiplex Phosphoprotein Assay
[nagłówek]
Accell 5x siRNA Buffer	Thermo Scientific	B-002000-UB-100
Accell siRNA Delivery Medium	Thermo Scientific	B-005000-100
Accell Cyclophilin Pool-Rat	Thermo Scientific	D-001920-30-05
Tabela 16. siRNA
[nagłówek]
16% paraformaldehydu	Alfa Aesar	43368
Lizyna	Sigma	L-6001
Fosforan sodu	Fisher Scientific	S374-1
Periodynian sodu	Sigma	S-1878
Azydek sodu	Sigma	S-2002
Cryostat	Leica	CM3050 S
Tissue-Tek	Ted Pella Inc.	27050
Pędzel z cienką końcówką	Ted Pella	11806
Szkiełka do chusteczek	Surgipath	00210
Słoiki z kopliny	Fisher	08-815
Nadtlenek wodoru (30%)	Sigma	H1009
SFX wzmacniacz sygnału	Invitrogen	A31631
Kozia surowica	Colorado Serum Company	CS 0920
Triton X-100	Sigma	T-8787
Anty-NFκ β przeciwciało	Santa Cruz	SC-109
Koza anty-królik IgG Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11012
Yo-yo nuklearne przeciwbarwienie	Invitrogen	Y-3601
ProLong anti-fade	Invitrogen	P7481
Tabela 17. Potwierdzenie proteomiczne za pomocą Immunohistochemia
[nagłówek]
Antycyklofilina B	R& D Systems	MAB5410
3,3-diaminobenzydyna	Sigma	D8001
Łaźnia wodna	Pharmacia Biotech	56-1165-33	Gebrü der HAAKE GmbH
Wodorotlenek amonu	J.T.Baker	9721-03
Azotan srebra	Sigma	S-0139
Tiosiarczan sodu (pentahydrat)	J.T.Baker	3949-01	& Nsp;
0,2% chlorek złota	Sigma	G-4022
Kwas szczawiowy	Sigma	O-0376
Kamera CCD CoolSnap fx	Oprogramowanie Fotometria
Oprogramowanie MetaMorph	Molecular Devices	v. 7.5.04
Mikroskop odwrócony	Leica	DM IRBE
Filtry o neutralnej gęstości	Chroma		0,5-3,0 zakres jednostek gęstości optycznej
Tabela 18. Potwierdzenie proteomiczne za pomocą immunohistochemii wzmocnionej srebrem

Lutownica Cooper Rdzeń z żywicy gniazda bananowe Miernik pH DigiSense Physiotemp IT odwrócony Burleigh Technologie System Harvarda antywibracyjny Burleigh SJ0390W Moduł optyczny

Bibliografia

Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Calcium waves precede electrophysiological changes of spreading depression in hippocampal organ cultures. J Neurosci. 18 (9), 3416-3425 (1998).
Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents. J Neurosci. 25 (15), 3952-3961 (2005).
Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-αlpha. J Neurosci. 28 (47), 12199-12211 (2008).
Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18 (4), 319-331 (1996).
Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
Mitchell, H. M., White, D. M., Domowicz, M. S., Kraig, R. P. Cold pre-conditioning neuroprotection depends on TNF-αlpha and is enhanced by blockade of interleukin-11. J Neurochem DOI. , (2010).
Mitchell, H. M., White, D. M., Kraig, R. P. Strategies for study of neuroprotection from cold-preconditioning. J Vis Exp. (43), (2010).
Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo. J Cereb Blood Flow Metab. 17 (1), 26-43 (1997).
Grinberg, Y. Y., Milton, J. G., Kraig, R. P. Spreading depression sends microglia on Lévy flights. PLoS ONE. 6 (4), (2011).
Koroleva, V. I., Oitzl, M. S., Bures, J. Threshold of synaptically elicited cortical spreading depression: drug-induced changes in rats. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 60 (1), 55-64 (1985).
Gubern, C. Validation of housekeeping genes for quantitative real-time PCR in in-vivo and in-vitro models of cerebral ischaemia. BMC Mol Biol. 10, 57-57 (2009).
Tian, Y. F. The quantification of ADAMTS expression in an animal model of cerebral ischemia using real-time PCR. Acta Anaesthesiol Scand. 51 (2), 158-164 (2007).
Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29 (9), e45-e45 (2001).
Bustin, S. A. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
Pusic, A. D., Kraig, R. P. Inflammatory gene micro array profiling demonstrates "T-cell-like" activation after recurrent spreading depression - implications for migraine pathogenesis. Soc Neurosci abst. , (2010).
Quinn, B., Graybiel, A. M. A differentiated silver intensification procedure for the peroxidase-diaminobenzidine reaction. J Histochem Cytochem. 44 (1), 71-74 (1996).
Caggiano, A. O., Kraig, R. P. Eicosanoids and nitric oxide influence induction of reactive gliosis from spreading depression in microglia but not astrocytes. J Comp Neurol. 369 (1), 93-108 (1996).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kultury skrawk w hipokampa rejestracja elektrofizjologiczna screening qPCR detekcja cytokin ruch mikrogleju mikroskopia z laserow mikrodysekcj strategie siRNA multipleksowa analiza fosfoprotein

Modelowanie neuronalnej sygnalizacji immunologicznej epizodycznej i przewlekłej migreny za pomocą rozprzestrzeniającej się depresji in vitro

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Protokół

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły