Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metoda wysokoprzepustowej hybrydyzacji in situ do charakteryzacji wzorców ekspresji mRNA w dolnym odcinku dróg moczowo-płciowych płodu myszy

12.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2912

⸱

19 sierpnia 2011

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Comparative Biosciences, School of Veterinary Medicine, University of Wisconsin-Madison

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy wydajną, wysokoprzepustową metodę hybrydyzacji in situ (ISH) służącą do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w przekrojach rozwijającej się tkanki prostaty zarodka myszy. Metodę tę można łatwo dostosować do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w innych tkankach myszy lub w tkankach innych gatunków.

Streszczenie

Rozwój dolnych dróg moczowo-płciowych (LUT) jest złożonym procesem. Złożoność ta przejawia się podczas formowania prostaty z płodowej cewki moczowej samca, co zależy od sygnałów androgenowych i oddziaływań nabłonkowo-mezenchymalnych1,2. Zrozumienie mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za rozwój prostaty może ujawnić mechanizmy wzrostu, które zostają niewłaściwie reaktywowane w późniejszym życiu, prowadząc do chorób prostaty, takich jak łagodny przerost prostaty i rak prostaty.

Rozwijający się układ moczowo-płciowy (LUT) jest anatomicznie złożony. W momencie rozpoczęcia pączkowania prostaty w 16,5 dniu po zapłodnieniu (dpc) obecnych jest liczne typy komórek. Naczynia krwionośne, nerwy i mięśnie gładkie znajdują się w obrębie zrębu mezenchymalnego3. Zręb ten otacza wielowarstwowe nabłonek i daje początek płodowej prostacie poprzez paracrynne sygnały zależne od receptora androgenowego4. Tożsamość stromalnych genów reagujących na receptor androgenowy, niezbędnych do rozwoju prostaty, oraz mechanizm, w którym nabłonek przewodowy prostaty formuje się w odpowiedzi na te geny, nie są w pełni poznane. Zdolność do precyzyjnej identyfikacji typów komórek i lokalizacji ekspresji konkretnych czynników w ich obrębie jest niezbędna do dalszego zrozumienia rozwoju prostaty. Hybrydyzacja in situ (ISH) pozwala na lokalizację mRNA w obrębie tkanki. Zatem metoda ta może być wykorzystana do identyfikacji wzorca i czasu ekspresji cząsteczek sygnałowych oraz ich receptorów, co pozwala na wyjaśnienie potencjalnych regulatorów rozwoju prostaty.

W niniejszej pracy opisujemy wysokoprzepustową technikę ISH służącą do identyfikacji wzorców ekspresji mRNA w płodowej cewce moczowej (LUT) myszy z wykorzystaniem przekrojów wykonanych mikrotomem wibracyjnym. Metoda ta oferuje szereg zalet w porównaniu z innymi protokołami ISH. Przeprowadzanie ISH na cienkich przekrojach przyklejonych do szkiełka jest technicznie trudne; krioprzekroje często charakteryzują się niską jakością strukturalną, natomiast zarówno krioprzekroje, jak i przekroje parafinowe często skutkują słabą rozdzielczością sygnału. Wykonywanie ISH na całych preparatach tkankowych może prowadzić do uwięzienia sondy. W przeciwieństwie do nich, nasza wysokoprzepustowa technika wykorzystuje grube przekroje, które ukazują szczegółową architekturę tkanki. Modyfikowane probówki do wirówek umożliwiają łatwą manipulację przekrojami podczas procedury ISH. Z pojedynczego LUT w 17,5dpc można przesiewowo zbadać maksymalnie 4 transkrypty mRNA, wykrywając do 24 transkrypty mRNA w jednym cyklu, co redukuje koszty i maksymalizuje wydajność. Metoda ta pozwala na identyczne przetwarzanie wielu grup badawczych jako jednej jednostki, co eliminuje wszelkie błędy systematyczne w interpretacji danych. Co najważniejsze dla badaczy prostaty, metoda ta umożliwia określenie lokalizacji przestrzennej i czasowej transkryptów mRNA o niskiej i wysokiej obfitości w płodowej cewce moczowej myszy, z której powstaje sieci przewodowa prostaty.

Protokół

1. Synteza ryboprony znakowanej Digoksygeniną-1-UTP z matrycy otrzymanej metodą PCR

  1. Aby zsyntetyzować specyficzną dla genu sondę rybo-probę, należy skorzystać z bazy Entrez Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) w celu uzyskania referencyjnej sekwencji cDNA genu (RefSeq). Do zaprojektowania specyficznych dla genu starterów PCR przeciwko regionowi 3’ sekwencji cDNA należy użyć programu Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)5. Zalecane parametry doboru starterów PCR są opisane w innym miejscu (http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html).
  2. Należy użyć programu MegaBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=1090)6, aby ocenić specyficzność wybranej sekwencji DNA. Sekwencję DNA uznaje się za specyficzną, gdy przy progu EXPECT wynoszącym 0.01 nie wykazuje ona dopasowania do innych sekwencji w bazie danych RefSeq.
  3. Należy przeprowadzić amplifikację PCR matrycy rybo-proby. Składniki reakcji PCR oraz warunki termocyklingu powinny być zoptymalizowane dla każdego zestawu starterów. Typowa reakcja o objętości 50 μl zawiera: 1X bufor, 2mM MgCl2, 0.2mM dNTPs, 1X roztwór Q, 1μg cDNA, 2.5U polimerazy Taq DNA, 0.25μm startery oraz wodę H2O wolną od nukleaz. Typowy protokół termocyklingu obejmuje wstępną denaturację w 94°C przez 2min, a następnie 40 cykli: 94°C przez 30sec, 57°C przez 30sec, 72°C przez 1min oraz końcową elongację w 72°C przez 10min. cDNA użyte w reakcjach PCR jest syntetyzowane z mRNA układu urogenitalnego myszy.
  4. Produkt PCR należy rozdzielić za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, oczyścić za pomocą zestawu Gel Extraction Kit i określić ilość oczyszczonych produktów metodą spektrofotometrii. Oczekiwana wydajność to 1.2 - 3.6μg.
  5. Produkt PCR należy poddać transkrypcji w celu otrzymania znakowanej rybo-proby. Reakcja transkrypcji (40 μl) zawiera: 40ng oczyszczonego produktu PCR, 1X mieszankę do znakowania nukleotydów zawierającą digoksygeninę 1-UTP, 1X bufor do transkrypcji, 5U inhibitora RNazy, 80U polimerazy RNA T7 oraz wodę H2O wolną od nukleaz. Inkubować przez 3-4hr w 37°C i mieszać próbki co 30min.
  6. Do oczyszczania rybo-prob należy użyć zestawu Qiagen RNEASY Mini zgodnie z instrukcją oczyszczania RNA z trawieniem DNazy na kolumnie. Ilość rybo-prob należy oznaczyć spektrofotometrycznie. Oczekiwana wydajność to 4-20 μg. Jakość sond należy ocenić, rozdzielając ich alikwot za pomocą elektroforezy w 1.5% niedenaturującym żelu agarozowym. Wysokiej jakości sondy migrują jako wyraźne prążki z minimalnym rozmyciem.
  7. Aby upewnić się, że rybo-proba specyficznie rozpoznaje swój cel, w pierwszym eksperymencie ISH należy uwzględnić tkankę kontrolną dodatnią. W tej tkance kontrolnej wzorzec mRNA będący celem rybo-proby powinien być znany.

2. Przygotowanie ostrza mikrotomu wibrującego (na podstawie wcześniej opisanego protokołu)7

  1. Przygotować 4% roztwór agarozy niskotopliwej w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Roztwór podgrzewać w mikrofalówce do rozpuszczenia agarozy, a następnie utrzymywać go w temperaturze 62°C.
  2. Przygotować polistyrenową formę pierścieniową, usuwając membranę z wkładki do dołka płytki hodowlanej Millicell o średnicy 12 mm; polistyrenowy pierścień zachować jako formę do agarozy. Przed każdym użyciem moczyć pierścienie przez noc w roztworze inhibitora RNazy.
  3. Aby zapewnić gładką powierzchnię cięcia, usunąć inhibitor korozji i inne dodatki z powierzchni ostrza Wilkinson poprzez płukanie następującymi rozpuszczalnikami w stężeniu 10%: eterem ropa naftowej, ksylenem, chloroformem, metanolem oraz wodą MilliQ. Rozdzielić podwójne ostrze wzdłuż na dwa pojedyncze ostrza.
  4. Przymocować ostrza Wilkinson do ostrza mikrotomu za pomocą kleju Loctite. Ostrze mikrotomu nie służy do cięcia, lecz zwiększa sztywność ostrza Wilkinson. Ostrze mikrotomu należy przyciąć nożycami metalowymi do długości ostrza Wilkinson, a po przyklejeniu powinno ono być przesunięte o 3 – 4 mm od krawędzi tnącej ostrza Wilkinson.

3. Disekcja, przechowywanie i przygotowanie tkanek układu moczowo-płciowego do skrawania

  1. Przygotuj roztwór PBSTw (PBS zawierający 0,1% Tween™ 20 i 0,2mM azotku sodu, przefiltrowany przez jednostkę filtrującą Stericup® 0,22μm). Roztwór można przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze 25°C.
  2. Inkubuj świeżo wypreparowany LUT myszy (pęcherz moczowy, cewkę miedniczną oraz powiązane struktury pochodzące z przewodów Wolffa i Mϋllera) przez noc w temperaturze 4°C w PBS zawierającym 4% utrwalacza paraformaldehydu.
  3. Odwodnij tkanki, przemywając je przez 10min w temperaturze 25°C w serii stopniowanych roztworów metanol/PBSTw (1:3, 1:1, 3:1 v/v). Przechowuj próbki w temperaturze –20°C w 10% metanolu przez co najmniej noc. Zarchiwizowane tkanki można przechowywać przez minimum 2 lata.
  4. Przygotuj tkanki do krojenia poprzez rehydratację zarchiwizowanych tkanek. Przemywaj przez 10min w temperaturze 25°C w serii stopniowanych roztworów metanol/PBSTw (3:1, 1:1, 1:3 v/v).
  5. Wypreparuj i usuń około dwóch trzecich pęcherza moczowego, pozostawiając większość obszaru trójkąta pęcherza przytwierdzoną do cewki moczowej.

4. Osadzanie tkanki moczowo-płciowej w agarozie

  1. Umieścić formę pierścieniową z polistyrenu płaską powierzchnią dołu na zwykłym szklanym szkiełku mikroskopowym o temperaturze 25°C.
  2. Wypełnić formę pierścieniową roztworem agarozy o temperaturze 62°C i chłodzić przez około 2min.
  3. Wyjąć tkankę LUT z PBSTw i osuszyć za pomocą chłonnej serwetki.
  4. Przenieść tkankę do roztworu agarozy.
  5. Za pomocą pęsety zorientować tkankę LUT w agarozie tak, aby znajdowała się w połowie wysokości formy pierścieniowej, a następnie inkubować tkankę w temperaturze 4°C do momentu zestalenia się agarozy.
  6. Jeśli tkanka całkowicie opadnie podczas procesu krzepnięcia agarozy, można ją wyciąć z agaru i zatopić ponownie. W razie potrzeby dostosować czas chłodzenia agarozy podczas ponownego zatapiania.

5. Przecinanie tkanek układu moczowo-płciowego za pomocą mikrotomu wibracyjnego (na podstawie wcześniej opisanego protokołu)7

  1. Zamontuj wzmocnione ostrze Wilkinson w wibrotomie i ustaw kąt ostrza na 35°. Napełnij luksusową kąpiel dla próbek roztworem PBS i obłóż kąpieli kruszoną lodą.
  2. Wyjmij zestaloną wkładkę agarową z formy pierścieniowej i osusz dolną powierzchnię chłonną ściereczką. Sprawdź, czy tkanka jest prawidłowo zorientowana. Orientację tkanki można skorygować, używając żyletki do ścięcia pod kątem płaskiej krawędzi wkładki agarowej.
  3. Przyklej wkładkę agarową do dysku montażowego wibrotomu za pomocą kleju Loctite, jak pokazano na Ryc. 1A.
  4. Włóż dysk montażowy z próbką do wibrotomu.
  5. Ustaw grubość przekroju mikrotomu na 50μm, prędkość na 2 oraz amplitudę ostrza na 4 i rozpocznij wycinanie sekcji tkankowych.
  6. Używając pęsety tępej, przenieś każdą sekcję tkanki (Ryc. 1B) do dołka 24-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej 0,5mL schłodzonego PBSTw.
  7. Aby przygotować próbki do hybrydyzacji in situ, usuń większość agaru wokół każdej sekcji tkankowej (pozostały agar rozpuści się podczas procedury ISH) i usuń wszelkie zanieczyszczenia. Przechowuj sekcje do 48h w temperaturze 4°C w PBSTw.

6. Przygotowanie koszyka z próbkami do hybrydyzacji in situ

  1. Odciąć dno probówki do mikrocentryfugi na poziomie oznaczenia 10μL.
  2. Podgrzewać odciętą krawędź probówki w płomieniu, aż plastik zmięknie, a następnie mocno docisnąć probówkę do środka kwadratu z siatki poliestrowej o boku 0.5in.
  3. Odciąć nadmiar siatki i użyć podgrzanej igły o rozmiarze 18 G, aby przebić dwa otwory w każdej zakrętce probówki w celu zakończenia przygotowania koszyczków (Ryc. 1C).
  4. Zdjąć pokrywkę z płytki 24-dołkowej i wywiercić otwór o średnicy 12mm, wyśrodkowany nad każdym dołkiem. Używać pokrywki do przenoszenia koszyczków z próbkami pomiędzy poszczególnymi etapami przemywania w protokole ISH (Ryc. 1D).

7. Przygotowanie proszku z embrionów do hybrydyzacji in situ (na podstawie wcześniej opisanego protokołu)8

  1. Pobrać tkankę zarodków myszy od osobników na tym samym etapie rozwoju, co analizowane przekroje tkankowe, i przechowywać w temperaturze –80°C. Zamrożoną tkankę umieścić w ceramicznym moździerzu, zanurzyć w ciekłym azocie i za pomocą tłuczka rozetrzeć tkankę na drobny proszek.
  2. Połączyć proszek z zarodków z 4 objętościami acetonu i zhomogenizować za pomocą kilku pociągnięć homogenizatora Dounce.
  3. Przenieść homogenat do szklanej fiolki z zakrętką o pojemności 15mL i przeprowadzić ekstrakcję przez noc w temperaturze 4°C.
  4. Odwirować proszek z zarodków przy 50rpm przez 10min w temperaturze 4°C. Odmienić i usunąć supernatant zawierający lipidy. Resuspendować pellet tkankowy w 4 objętościach świeżego acetonu i ekstrahować przez 2hr w temperaturze 4°C.
  5. Odwirować proszek z zarodków przy 500rpm przez 10min w temperaturze 4°C. Odmienić i usunąć supernatant.
  6. Wysuszyć pellet na powietrzu na papierze filtracyjnym Whatman nr 2. Rozetrzeć pellet, aby uzyskać drobny proszek, i przechowywać w szczelnie zamkniętej szklanej fiolce w temperaturze 4°C. Przykreszona wydajność wynosi 50 mg proszku na 1 g masy mokrej zarodka.

8. Hybrydyzacja In Situ Dzień 1

  1. Podgrzej roztwór do prehybrydyzacji (50% formamid, 5x SSC, 1% odczynu blokującego, 10μg/mL tRNA drożdżowej, 10μg/mL heparyny, przechowywać w -20°C) do 60,5°C. Roztwór ten można przygotować wcześniej i przechowywać w -20°C.
  2. Przygotuj wilgotną komorę hybrydyzacyjną, wlewając do małego plastikowego pojemnika do przechowywania około 0,5 cala wody z kranu. Przykryj pojemnik i podgrzej do 60,5°C.
  3. Do otworów płytki hodowlanej 24-dołkowej dodaj 2mL PBSTw. Umieść koszyczki na próbki w otworach pokrywki płytki 24-dołkowej i przenieś przekroje tkanek do koszyczków (stosowano do 10 przekrojów na koszyczek).
  4. Inkubuj przekroje tkanek przez 30min w 25°C w 6% H2O2. Tę oraz wszystkie kolejne inkubacje należy prowadzić przy łagodnym wstrząsaniu na wytrząsarce orbitalnej, chyba że wskazano inaczej. Wszystkie inkubacje i płukania wykonuje się w płytkach 24-dołkowych, stosując całkowitą objętość roztworu 2mL/dołek.
  5. Płucz przekroje tkanek 4 x 5min w 25°C w PBSTw.
  6. Inkubuj przekroje tkanek przez 12min w 25°C w PBSTw zawierającym 5μg/mL proteinazy K.
  7. Płucz przekroje tkanek 1 x 5min w 25°C w PBSTw.
  8. Przeprowadź postfiksację przekrojów tkanek przez 20min w 25°C w PBS zawierającym 4% paraformaldehydu i 0,2% glutaraldehydu.
  9. Płucz przekroje tkanek 2 x 5min w 25°C w PBSTw.
  10. Dodaj 2mL/dołek uprzednio podgrzanego buforu do prehybrydyzacji i inkubuj przekroje tkanek w wilgotnej komorze hybrydyzacyjnej przez co najmniej 1h w 60,5°C.
  11. Do buforu do prehybrydyzacji w każdym dołku dodaj 0,65μg znakowanej sondy ryboprobe i inkubuj przekroje tkanek przez noc w wilgotnej komorze hybrydyzacyjnej w 60,5°C.

9. Hybrydyzacja in situ dzień 2

  1. Przygotować następujące roztwory do etapów płukania po hybrydyzacji: Roztwór 1 (50% formamid, 5x SSC, 1% SDS), Roztwór 2 (10mM Tris-HCL pH 7.5, 0.5M NaCl, 0.1% Tween™ 20, 0.2mM azotek sodu, filtrowany przez filtr 0.2μm) oraz Roztwór 3 (2x SSC, 50% formamid). Roztwory te można przygotować wcześniej. Roztwory 1 i 3 przechowuje się w temperaturze -20°C, a Roztwór 2 w temperaturze 25°C. Okres przydatności roztworów wynosi co najmniej 3 miesiące.
  2. Przespłukać przekroje tkankowe 3 razy przez 30 min w temperaturze 60.5°C uprzednio ogrzanym Roztworem 1. Podczas płukania należy używać komory nawilżonej.
  3. Przespłukać przekroje tkankowe 1 raz przez 10 min w temperaturze 60.5°C uprzednio ogrzanym roztworem z Roztworu 1 i Roztworu 2 (1:1 v/v). Podczas płukania należy używać komory nawilżonej.
  4. Przespłukać przekroje tkankowe 4 razy przez 10 min w temperaturze 25°C Roztworem 2.
  5. Inkubować przekroje tkankowe przez 15 min w temperaturze 37°C w Roztworze 2 zawierającym 0.25μg/mL RNazy.
  6. Przespłukać przekroje tkankowe 1 raz przez 10 min w temperaturze 25°C Roztworem 2 (bez RNazy).
  7. Przespłukać przekroje tkankowe 1 raz przez 10 min w temperaturze 25°C Roztworem 3, a następnie płukać 2 razy przez 1 h w temperaturze 60.5°C Roztworem 3. Podczas płukania w temperaturze 60.5°C należy używać komory nawilżonej.
  8. Przygotować następujące roztwory do detekcji immunohistochemicznej ryb sond znakowanych DIG: Bufor blokujący tkanki (TB; 1X TBS, 10% surowicy owczej, 1% odczynnika blokującego, 1% BSA, 0.1% Tween™ 20, filtrowany przez filtr 0.2μm), Bufor do rozcieńczania przeciwciał (AD; 1xTBS, 5% surowicy owczej, 1% odczynnika blokującego, 1% BSA, 0.1% Tween™ 20, 0.2mM azotku sodu, filtrowany przez filtr 0.2™m), Bufor do absorpcji przeciwciał (AA; 1xTBS, 5% surowicy owczej, 1% odczynnika blokującego, 1% BSA, 6mg/mL sproszkowanego zarodka) oraz TBSTw (1xTBS, 0.1% Tween™ 20, 0.2mM azotku sodu, filtrowany przez filtr 0.2μm). Roztwory te można przygotować wcześniej. TBSTw przechowuje się w temperaturze 25°C, a wszystkie pozostałe roztwory w temperaturze -20°C.
  9. Płukać 3 razy przez 10 min w temperaturze 25°C przy użyciu TBSTw.
  10. Inkubować przekroje tkankowe przez co najmniej 2 h w temperaturze 25°C w buforze TB.
  11. Podczas inkubacji tkanek w buforze TB, dodać 1.1μL przeciwciała anty-DIG na każde 200μL buforu AA do każdej studzienki. Inkubować bufor AA z przeciwciałem przez co najmniej 2 h w temperaturze 4°C, a następnie wirować przy 10 0 rpm przez 1 min. Odpić nadsącz z buforu AA i dodać go do 2mL buforu AD.
  12. Wyjąć przekroje tkankowe z buforu TB i inkubować je przez noc w komorze nawilżonej w temperaturze 4°C w buforze AD zawierającym przeciwciała.

10. Hybrydyzacja in situ – dzień 3.

  1. Przygotować roztwór do rozwoju barwnika NTMT (10mM Tris-HCL pH 9.5, 100mM NaCl, 50mM MgCl2, 0.2mM azydku sodu, filtrowany przez membranę 0.2μm). Roztwór ten można przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze 25°C. Bezpośrednio przed użyciem dodać 2mM lewamisolu i 0.1% Tween™ 20.
  2. Usunąć roztwór przeciwciał (bufor AD + przeciwciało) z dołków i przechowywać go w temperaturze 4°C. Można go wykorzystać ponownie do dwóch kolejnych razy.
  3. Przemyć tkanki 8 X 10 min w temperaturze 25°C przy użyciu TBSTw zawierającego 2mM lewamisolu.
  4. Ostrożnie przenieść tkanki z koszyków do szalki Petriego zawierającej TBSTw. Użyć pęsety do usunięcia widocznych zanieczyszczeń. Przenieść tkanki do czystych probówek do mikrowirówki.
  5. Przemyć tkanki 1 X 10 min w temperaturze 25°C przy użyciu 1mL NTMT.
  6. Usunąć NTMT i dodać do każdej probówki 1mL mieszaniny zawierającej 50% NTMT (z 2mM lewamisolu) i 50% BM Purple, umieścić probówki w pudełku chroniącym przed światłem i inkubować w temperaturze 25°C. Czas rozwoju barwnika wynosi od kilku godzin do kilku dni. Jeśli barwnik rozwija się powoli, można zastosować 10% BM Purple.
  7. Monitorować rozwój barwnika i wymienić roztwór NTMT/BM Purple, jeśli pojawią się wytrącone kryształy lub jeśli kolor zmieni się z żółtego na fioletowy. Po pełnym rozwinięciu barwy (4-250 godzin), przemyć tkanki 2 X 5min w temperaturze 25°C przy użyciu 1mL/probówkę NTMT zawierającego 2mM lewamisolu.
  8. Inkubować tkanki przez noc w temperaturze 4°C w 1mL/probówkę PBS zawierającego 4% paraformaldehydu jako utrwalacza po-procesowego.
  9. Aby wybielić tkanki, inkubować je przez 30min w temperaturze 25°C w 1mL/probówkę PBSTw zawierającego 3% H2O2. Następnie przemyć tkanki 1 X 10min w temperaturze 25°C w 1mL/probówkę PBSTw i przechowywać w temperaturze 4°C w 1mL/probówkę PBS zawierającego 4% paraformaldehydu jako utrwalacza po-procesowego.
  10. Przekroje tkanek należy zamontować na szkiełkach przedmiotowych, przykryć szkiełkiem cover-slip i obrazować za pomocą mikroskopu złożonego.

1. Reprezentatywne wyniki:

Orientacja przestrzenna tkanki LUT w agarozie determinuje płaszczyznę cięcia tkanek. W przypadku przekrojów strzałkowych wycina się co najmniej dwie trzecie pęcherza, a pozostałą tkankę LUT zatapia się w agarze w taki sposób, aby linia środkowa cewki moczowej była równoległa do płaskiej powierzchni wkładki agarozowej (Rycina 1A). Niewielkie korekty płaszczyzny tkanki można wprowadzić poprzez ścięcie krawędzi płaskiej powierzchni wkładki agarozowej pod kątem. Reprezentatywny przekrój strzałkowy tkanki LUT samca w wieku 17,5 dpc, zorientowany w tej płaszczyźnie, przedstawiono na Rycynie 1B.

Koszyczki na próbki chronią delikatne skrawki tkanek przed zgubieniem oraz przed osadzaniem się kurzu i cząstek stałych podczas wielodniowej procedury ISH. Koszyczki przygotowuje się poprzez przetopienie siatki poliestrowej do odciętego końca probówki do wirówki o objętości 1,5mL (Rysunek 1C). W pokrywce każdego koszyczka wykonuje się niewielki otwór, aby ułatwić przepływ roztworu do wnętrza i na zewnątrz koszyczków. Koszyczki są zawieszane w roztworach ISH poprzez umieszczenie ich w otworach o średnicy 12mm wywierconych w pokrywkach płytek 24-dołkowych (Rysunek 1D). Zmodyfikowane pokrywki płytek podtrzymują koszyczki podczas ich przenoszenia między płytkami 24-dołkowymi w trakcie wymiany roztworów.

Ograniczenie nieswoistego barwienia tła podczas długich okresów inkubacji niezbędnych do wykrycia mRNA o niskiej liczności stanowi wyzwanie. Dodanie 0,2mM azotku sodu do buforów do próbek oraz ich późniejsze filtrowanie przez filtry 0,2μm wydawało się ograniczać barwienie tła (Rysunek 2). Stosując opisaną tutaj metodę, nie zaobserwowano widocznych różnic w barwieniu tła po inkubowaniu próbek w roztworze do ujawniania barwy przez przedłużone okresy czasu (Rysunek 3).

Równowaga statyczna; zestaw z szalką Petriego, końcówkami do pipet i statywem na probówki; schemat doświadczenia.
Rycina 1. Przygotowanie przekroju tkankowego dolnego odcinka dróg moczowo-płciowych (LUT) myszy oraz koszyczka do probówki do mikrowirówki do ISH. Dolny odcinek dróg moczowo-płciowych (obejmujący część pęcherza moczowego, cewkę miedniczną oraz powiązane struktury pochodzące z przewodów Wolffa i Müllera) zostaje zatopiony w cylindrycznym bloku 4% niskotopliwej agarozy. (A) Blok zostaje przyklejony do dysku montażowego na preparat i (B) pocięty na 50μm przekroje wykonane za pomocą mikrotomu wibracyjnego. (C) Przekrój LUT przenosi się do koszyka probówki do mikrocentryfugi, przygotowanego poprzez wykonanie otworu w zakrętce probówki i przytwierdzenie siatki poliestrowej do przeciętego dolnego końca probówki. (D) Probówkę do mikrocentryfugi umieszcza się w otworach o średnicy 12 mm wywierconych w pokrywie płytki 24-dołkowej, tak aby przekroje tkanek były zawieszone w roztworze buforowym podczas protokołu ISH. Groty strzałek wskazują tkankę LUT w czopie agarozowym.

Porównanie histologiczne przekrojów tkanek; A: bufor NaAz filtrowany, B: niefiltrowany, strzałki wskazują zmiany.
Rysunek 2. Wprowadzenie 0,2 mM azotku sodu do 0.22μm filtrowanie roztworów poprawia jakość tkanki i zmniejsza barwienie tła. Dolne drogi moczowo-płciowe (LUTs) samców myszy w 17,5 dniu okresu prenatalnego (dpc) przekrojono w płaszczyźnie strzałkowej na grubość 50μmPrzekroje tkanek wybarwiono metodą ISH, wykorzystując sondę skierowaną przeciwko homologowi 1 genu twist. Bufory stosowane w metodzie ISH były albo (A) 0.22μm przefiltrowane i uzupełnione 0,2 mM azotkiem sodu (NaAz) lub (B) nieprzefiltrowane i nieuzupełnione NaAz. Groty strzałek wskazują barwienie tła. Obrazy wykonano przy tym samym powiększeniu. Wyniki przedstawiają reprezentatywne wzory barwienia dla n = 3 myszy z różnych miotów.

Wyniki hybrydyzacji in situ; ekspresja genów Esrrg, Baz2a, Wnt10a; schemat; rozwój embrionalny.
Rysunek 3. Intensywność barwienia tła nie wydaje się zwiększać przy przedłużonym czasie utrwalania koloru. Dolne drogi moczowo-płciowe (LUTs) samca myszy w 17,5 dniu ciąży (17.5dpc) przekrojono w płaszczyźnie strzałkowej do grubości 50μmPrzekroje barwiono metodą ISH poprzez inkubację w roztworze barwiącym z chromogenem przez (A) 9,5 h, używając sondy rozpoznającej wysoką obfitość transkryptu receptora estrogenowego gamma (Esrrg), (B) przez 43,5 h przy użyciu sondy rozpoznającej transkrypty o średniej obfitości dla domeny bromodomeny sąsiadującej z domeną palca cynkowego 2A (Baz2a), lub (C) przez 236 h przy użyciu sondy rozpoznającej rzadki transkrypty z rodziny miejsc integracji MMTV typu wingless, członek 10a (Wnt10a). Obrazy zarejestrowano przy tym samym powiększeniu. Wyniki przedstawiają reprezentatywne wzorce barwienia dla n = 3 myszy z różnych miotów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Stosując opisaną tutaj metodę, możliwe jest wykrycie mRNA we wszystkich głównych typach komórek i przedziałach tkankowych płodowych męskich i żeńskich układów moczowo-płciowych (LUT) myszy, w tym w poduszkach mezenchymalnych, urothelium, mięśniach gładkich, pąkach prostaty, przewodzie wytryskowym oraz w pochwie. Przekroje o grubości 50μm stosowane w tym protokole mają tę zaletę, że są wystarczająco grube, aby rozpoznać architekturę tkanki (np. naczynia krwionośne), a jednocześnie na tyle cienkie, aby uniknąć pułapkowania...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować dr. Lan Yi z Cancer Institute of New Jersey za pomoc techniczną przy przygotowywaniu koszyczków tkankowych. Praca ta była finansowana z grantów National Institutes of Health nr DK083425 oraz DK070219.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało anty-digoksigeninowe, fragmenty FabGrupa Roche11214667001
Odczynnik blokującyGrupa Roche11096176001
Podłoże BM Purple AP, wytrącające sięGrupa Roche11442074001
Albumina surowicy bydlęcejFisher ScientificBP1600-100
Płytka do hodowli komórkowej, 24 dołkiCorning3524
Digoksygenina 11-UTPGrupa Roche1277073910
dNTPGrupa Roche11969064001
Dwukrotna żyletkaWilkinson SwordModel klasyczny
Eliminase – preparat do usuwania RNazDecon Laboratories1102
FormamidSigma-AldrichF5786-1L
Zestaw do oczyszczania DNA z żeluQiagen28704
Glutaraldehyd, roztwór 25% w H2O2OSigma-AldrichG6257-100ML
Heparyna, sól sodowaSigma-AldrichH3393
Nadtlenek wodoru, roztwór 30% w H2O2OFisher ScientificBP2633-500
LewamizolSigma-AldrichL9756
Szybkowiążący klej błyskawiczny Loctite 404Henkel Corp46551
Chlorek magnezuFisher ScientificM33-500
Kwas maleinowySigma-AldrichM0375-500G
Probówki do mikrowirówki, 1,5 mlBiologix Research CompanyBP337-100
Wkład do płytki hodowlanej MillicellEMD MilliporePICM01250
Żywica do rozcierania molekularnegoG-Biosciences786-138PR
Paraformaldehyd, 4% roztwór w soli fizjologicznej buforowanej fosforanemAffymetrix19943
bufor fosforanowy (PBS), bez Ca & MgMP BiomedicalsICN1760420
Siatka poliestrowa, 33 mikrony, 12" x 24"Small Parts, Inc.CMY-0033-D
roztwór proteinazy K, 20 mg/mlAmrescoE195-5ML
Kolumny QIAshredderQiagen79654
roztwór QQiagenDostarczono polimerazę DNA Taq
RNazaSigma-AldrichR6513
inhibitor RNazyGrupa Roche03335399001
RNeasy mini kitQiagen74104
zestaw RNEASY mini kitQiagen74104
RQ1 DNaza wolna od RNazPromega Corp.M6101
agaroza niskotopliwa SeaPlaqueLonza Inc.50101
Surowica owczaSigma-AldrichS2263-500mL
Jednostka filtrująca Stericup, 0,22 µmμm, polietersulfon, 500 mlEMD MilliporeSCGPU05RE
Azydek sodu, ziarnistyFisher ScientificS227I-100
Chlorek soduFisher ScientificBP358-212
Dodecylosiarczan soduFisher ScientificS529-500
SSC, roztwór 20XResearch Products International Corp.S24022-4000.0
System do syntezy pierwszej nici SuperScript IIIInvitrogen18080-051
polimeraza RNA T7Grupa Roche10881767001
polimeraza DNA TaqQiagen201203
Tris-HClFisher ScientificBP153-1
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
Wibromikrotom z zaawansowaną wanną do próbekLeica MicrosystemsVT1000A
tRNA drożdżyGrupa Roche109495

Bibliografia

  1. Cunha, G. R. The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice. Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).
  2. Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).
  3. Price, D. Comparative aspects of development and structure in the prostate. National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).
  4. Cunha, G. R. Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).
  5. Rozen, S. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).
  6. Zhang, Z. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).
  7. Vezina, C. M. Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate. Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).
  8. Wilkinson, D. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przekroje wykonane za pomocą mikrotomu wibracyjnegoprzekroje grubesynteza sond Riboniestandardowe koszyczki do próbekdetekcja BM Purplelokalizacja czasowo-przestrzenna
Metoda wysokoprzepustowej hybrydyzacji in situ do charakteryzacji wzorców ekspresji mRNA w dolnym odcinku dróg moczowo-płciowych płodu myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.