Metoda wysokoprzepustowej hybrydyzacji in situ do charakteryzacji wzorców ekspresji mRNA w dolnym odcinku dróg moczowo-płciowych płodu myszy

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy wydajną, wysokoprzepustową metodę hybrydyzacji in situ (ISH) służącą do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w przekrojach rozwijającej się tkanki prostaty zarodka myszy. Metodę tę można łatwo dostosować do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w innych tkankach myszy lub w tkankach innych gatunków.

Streszczenie

Rozwój dolnych dróg moczowo-płciowych (LUT) jest złożonym procesem. Złożoność ta przejawia się podczas formowania prostaty z płodowej cewki moczowej samca, co zależy od sygnałów androgenowych i oddziaływań nabłonkowo-mezenchymalnych^1,2. Zrozumienie mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za rozwój prostaty może ujawnić mechanizmy wzrostu, które zostają niewłaściwie reaktywowane w późniejszym życiu, prowadząc do chorób prostaty, takich jak łagodny przerost prostaty i rak prostaty.

Rozwijający się układ moczowo-płciowy (LUT) jest anatomicznie złożony. W momencie rozpoczęcia pączkowania prostaty w 16,5 dniu po zapłodnieniu (dpc) obecnych jest liczne typy komórek. Naczynia krwionośne, nerwy i mięśnie gładkie znajdują się w obrębie zrębu mezenchymalnego³. Zręb ten otacza wielowarstwowe nabłonek i daje początek płodowej prostacie poprzez paracrynne sygnały zależne od receptora androgenowego⁴. Tożsamość stromalnych genów reagujących na receptor androgenowy, niezbędnych do rozwoju prostaty, oraz mechanizm, w którym nabłonek przewodowy prostaty formuje się w odpowiedzi na te geny, nie są w pełni poznane. Zdolność do precyzyjnej identyfikacji typów komórek i lokalizacji ekspresji konkretnych czynników w ich obrębie jest niezbędna do dalszego zrozumienia rozwoju prostaty. Hybrydyzacja in situ (ISH) pozwala na lokalizację mRNA w obrębie tkanki. Zatem metoda ta może być wykorzystana do identyfikacji wzorca i czasu ekspresji cząsteczek sygnałowych oraz ich receptorów, co pozwala na wyjaśnienie potencjalnych regulatorów rozwoju prostaty.

W niniejszej pracy opisujemy wysokoprzepustową technikę ISH służącą do identyfikacji wzorców ekspresji mRNA w płodowej cewce moczowej (LUT) myszy z wykorzystaniem przekrojów wykonanych mikrotomem wibracyjnym. Metoda ta oferuje szereg zalet w porównaniu z innymi protokołami ISH. Przeprowadzanie ISH na cienkich przekrojach przyklejonych do szkiełka jest technicznie trudne; krioprzekroje często charakteryzują się niską jakością strukturalną, natomiast zarówno krioprzekroje, jak i przekroje parafinowe często skutkują słabą rozdzielczością sygnału. Wykonywanie ISH na całych preparatach tkankowych może prowadzić do uwięzienia sondy. W przeciwieństwie do nich, nasza wysokoprzepustowa technika wykorzystuje grube przekroje, które ukazują szczegółową architekturę tkanki. Modyfikowane probówki do wirówek umożliwiają łatwą manipulację przekrojami podczas procedury ISH. Z pojedynczego LUT w 17,5dpc można przesiewowo zbadać maksymalnie 4 transkrypty mRNA, wykrywając do 24 transkrypty mRNA w jednym cyklu, co redukuje koszty i maksymalizuje wydajność. Metoda ta pozwala na identyczne przetwarzanie wielu grup badawczych jako jednej jednostki, co eliminuje wszelkie błędy systematyczne w interpretacji danych. Co najważniejsze dla badaczy prostaty, metoda ta umożliwia określenie lokalizacji przestrzennej i czasowej transkryptów mRNA o niskiej i wysokiej obfitości w płodowej cewce moczowej myszy, z której powstaje sieci przewodowa prostaty.

Protokół

1. Synteza ribosondy znakowanej Digoksygeniną-11-UTP z matrycy otrzymanej metodą PCR

1. Aby zsyntetyzować specyficzną dla genu sondę rybo- (riboprobe), należy skorzystać z bazy Entrez Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez), aby uzyskać referencyjną sekwencję cDNA genu (RefSeq). Do zaprojektowania specyficznych dla genu starterów PCR przeciwko regionowi 3’ sekwencji cDNA należy użyć programu Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)⁵. Zalecane parametry doboru starterów PCR opisano w innym miejscu (http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html).
2. Użyj programu MegaBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=10090)⁶, aby ocenić swoistość wybranej sekwencji DNA. Sekwencja DNA jest uznawana za swoistą, gdy przy progu EXPECT wynoszącym 0,01 nie wykazuje ona dopasowania do innych sekwencji w bazie danych RefSeq.
3. Przeprowadź amplifikację PCR matrycy sondy rybo-. Składniki reakcji PCR oraz warunki termocyklery powinny zostać zoptymalizowane dla każdego zestawu starterów. Typowa reakcja o objętości 50 μl zawiera: bufor 1X, 2mM MgCl₂, 0,2mM dNTP, roztwór Q 1X, 1μg cDNA, 2,5U polimerazy Taq DNA, 0,25μm starterów oraz wodę H₂O wolną od nukleaz. Typowy protokół termocyklery obejmuje wstępną denaturację w 94°C przez 2min, a następnie 40 cykli: 94°C przez 30sec, 57°C przez 30sec, 72°C przez 1min oraz końcową elongację w 72°C przez 10min. cDNA wykorzystywany w reakcjach PCR jest syntetyzowany z mRNA układu urogenitalnego myszy.
4. Rozdziel produkt PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, oczyść go za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu (Gel Extraction Kit) i określ ilość oczyszczonych produktów metodą spektrofotometrii. Oczekiwana wydajność wynosi 1,2 - 3,6μg.
5. Przeprowadź transkrypcję produktu PCR na znakowaną sondę rybo-. Reakcja transkrypcji (40 μl) zawiera: 400ng oczyszczonego produktu PCR, 1X mieszankę do znakowania nukleotydów zawierającą digoksigeninę 11-UTP, bufor do transkrypcji 1X, 5U inhibitora RNazy, 80U polimerazy T7 RNA oraz wodę H₂O wolną od nukleaz. Inkubuj przez 3-4hr w 37°C i mieszaj próbki co 30min.
6. Użyj zestawu Qiagen RNEASY Mini do oczyszczania sond rybo- zgodnie z instrukcjami dotyczącymi oczyszczania RNA z trawieniem DNazą na kolumnie. Oznacz ilość sond rybo- metodą spektrofotometrii. Oczekiwana wydajność wynosi 4-20 μg. Oceń jakość sondy, rozdzielając alikwot metodą elektroforezy w 1,5% niedenaturującym żelu agarozowym. Sondy wysokiej jakości migrują jako wyraźne prążki z minimalnym rozmyciem.
7. Aby upewnić się, że sonda rybo- specyficznie rozpoznaje swój cel, należy do pierwszego eksperymentu ISH dołączyć tkankę jako kontrolę pozytywną. Wzór mRNA docelowego dla danej sondy rybo- powinien być znany w tej kontrolnej tkance pozytywnej.

2. Przygotowanie ostrza mikrotomu wibracyjnego (na podstawie wcześniej opisanego protokołu)⁷

1. Przygotować 4% roztwór niskotopiącej agarozy w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Podgrzać roztwór w kuchence mikrofalowej do rozpuszczenia agarozy i utrzymywać temperaturę roztworu na poziomie 62°C.
2. Przygotować formę z pierścienia polistyrenowego, usuwając membranę z wkładu do studzienki płytki hodowlanej Millicell o średnicy 12mm i zachowując pierścień polistyrenowy do użytku jako forma do agarozy. Przed każdym użyciem moczyć pierścienie przez noc w roztworze inhibitora RNazy.
3. Aby zapewnić gładką powierzchnię cięcia, usunąć inhibitor korozji i inne dodatki z powierzchni ostrza Wilkinson poprzez płukanie następującymi rozpuszczalnikami w stężeniu 100%: eterem naftowym, ksylenem, chloroformem, metanolem i wodą MilliQ. Rozdzielić podwójne ostrze wzdłuż na dwa pojedyncze ostrza.
4. Przymocować ostrza Wilkinson do ostrza mikrotomu za pomocą kleju Loctite. Ostrze mikrotomu nie służy do cięcia; nadaje ono sztywność ostrzu Wilkinson. Ostrze mikrotomu należy przyciąć do długości ostrza Wilkinson za pomocą nożyc metalowych, a po przyklejeniu powinno być przesunięte o 3 – 4mm od krawędzi tnącej ostrza Wilkinson.

3. Disekcja, przechowywanie i przygotowanie tkanek układu moczowo-płciowego do skrawania

1. Przygotować roztwór PBSTw (PBS zawierający 0,1% Tween™ 20 i 0,2mM azotku sodu, przefiltrowany przez jednostkę filtrującą Stericup® 0,22μm). Roztwór można przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze 25° C.
2. Inkubować świeżo wypreparowany LUT myszy (pęcherz, cewkę miedniczną oraz powiązane struktury pochodzące z przewodów Wolffa i Müllera) przez noc w temperaturze 4°C w PBS zawierającym 4% paraformaldehydu jako utrwalacza.
3. Odwodnić tkanki, przemywając je przez 10min w temperaturze 25°C w serii roztworów metanolu/PBSTw o stopniowanym stężeniu (1:3, 1:1, 3:1 v/v). Próbki przechowywać w temperaturze –20°C w 100% metanolu przez co najmniej jedną noc. Zarchiwizowane tkanki można przechowywać przez co najmniej 2 lata.
4. Przygotować tkanki do krojenia poprzez rehydratację zarchiwizowanych tkanek. Przemywać przez 10min w temperaturze 25°C w serii roztworów metanolu/PBSTw o stopniowanym stężeniu (3:1, 1:1, 1:3 v/v).
5. Wyciąć i usunąć około dwóch trzecich pęcherza, pozostawiając większość regionu trójkąta pęcherza przytwierdzoną do cewki moczowej.

4. Osadzanie tkanki urogenitalnej w agarozie

1. Umieść formę pierścieniową z polistyrenu płaską powierzchnią do dołu na zwykłym szklanym preparacie mikroskopowym o temperaturze 25°C.
2. Wypełnij formę pierścieniową roztworem agarozy o temperaturze 62°C i chłódź przez około 2min.
3. Wyjmij tkankę LUT z PBSTw i osusz ją, przykładając chłonną ściereczkę.
4. Przenieś tkankę do roztworu agarozy.
5. Za pomocą pęsety ustaw tkankę LUT w agarozie tak, aby była zawieszona w połowie wysokości formy pierścieniowej, a następnie inkubuj tkankę w temperaturze 4°C aż do całkowitego zastygnięcia agarozy.
6. Jeśli tkanka całkowicie opadnie podczas procesu tężenia agarozy, można ją wyciąć z agarozy i zatopić ponownie. W razie potrzeby dostosuj czas chłodzenia agarozy podczas ponownego zatapiania.

5. Krojenie tkanki moczowo-płciowej za pomocą mikrotomu wibracyjnego (na podstawie wcześniej opisanego protokołu)⁷

1. Zamocuj wzmocnione ostrze Wilkinson w wibrotomie i ustaw kąt ostrza na 35°. Napełnij luksusową kąpiel dla próbek roztworem PBS i otocz kąpiel dla próbek mokrym lodem.
2. Wyjmij utwardzony korek agarowy z formy pierścieniowej i osusz dolną powierzchnię chłonną ściereczką. Sprawdź, czy tkanka jest zorientowana prawidłowo. Orientację tkanek można skorygować, używając żyletki do ścięcia krawędzi korka agarowego pod skosem.
3. Przyklej korek agarowy do dysku montażowego wibratomu za pomocą kleju Loctite, jak pokazano na Ryc. 1A.
4. Włóż dysk montażowy z próbką do wibratomu.
5. Ustaw grubość cięcia mikrotomu na 50μm, prędkość na 2 oraz amplitudę ostrza na 4 i rozpocznij wycinanie sekcji tkanki.
6. Używając pęsetytępej, przenieś każdą sekcję tkanki (Ryc. 1B) do dołka 24-dołkowej płytki hodowlanej zawierającego lodowaty 0,5mL PBSTw.
7. Aby przygotować próbki do hybrydyzacji in situ, usuń większość agaru wokół każdej sekcji tkanki (pozostały agar stopi się podczas procedury ISH) i usuń wszystkie zanieczyszczenia. Przechowuj sekcje do 48h w temperaturze 4°C w PBSTw.

6. Przygotowanie koszyczka z próbką do hybrydyzacji in situ

1. Odetnij dno probówki do mikrocentryfugi na poziomie oznaczenia 100μL.
2. Podgrzewaj odciętą krawędź probówki w płomieniu, aż plastik zmięknie, a następnie mocno dociśnij probówkę do środka kwadratu z siatki poliestrowej o boku 0,5in.
3. Odetnij nadmiar siatki i za pomocą podgrzanej igły o rozmiarze 18 G wykonaj dwa otwory w każdej zakrętce probówki, aby zakończyć przygotowanie koszyczków (Rys. 1C).
4. Zdejmij pokrywkę z płytki 24-dołkowej i wywierć otwór o średnicy 12mm, wycentrowany nad każdym dołkiem. Używaj pokrywki do przenoszenia koszyczków z próbkami pomiędzy poszczególnymi etapami płukania w protokole ISH (Rys. 1D).

7. Przygotowanie proszku z zarodków do hybrydyzacji in situ (na podstawie wcześniej opisanego protokołu)⁸

1. Pobrać tkankę zarodka myszy od osobników znajdujących się w tym samym stadium rozwoju co analizowane przekroje tkanek i przechowywać w temperaturze –80°C. Zamrożoną tkankę umieścić w ceramicznym moździerzu, zanurzyć w ciekłym azocie i za pomocą tłuczka rozetrzeć tkankę na drobny proszek.
>
2. Połączyć proszek z zarodka z 4 objętościami acetonu i zhomogenizować, wykonując kilka pociągnięć homogenizatorem Dounce'a.
3. Przenieść homogenat do szklanej fiolki z nakrętką o pojemności 15mL i przeprowadzić ekstrakcję przez noc w temperaturze 4°C.
4. Odwirować proszek z zarodka w 5000rpm przez 10min w temperaturze 4°C, aby uzyskać pellet. Odseparować i usunąć supernatant zawierający lipidy. Resuspendować pellet tkankowy w 4 objętościach świeżego acetonu i ekstrahować przez 2hr w temperaturze 4°C.
5. Odwirować proszek z zarodka w 5000rpm przez 10min w temperaturze 4°C, aby uzyskać pellet. Odseparować i usunąć supernatant.
6. Wysuszyć pellet na powietrzu na papierze filtracyjnym Whatman nr 2. Rozetrzeć pellet, aby uzyskać drobny proszek i przechowywać w szczelnie zamkniętej szklanej fiolce w temperaturze 4°C. Przybliżona wydajność wynosi 50 mg proszku na 1 g mokrej masy zarodka.

8. Hybrydyzacja In Situ – Dzień 1

1. Podgrzać roztwór do prehybrydyzacji (50% formamid, 5x SSC, 1% odczynnika blokującego, 10μg/mL tRNA drożdżowej, 10μg/mL heparyny, przechowywać w -20°C) do 60.5°C. Roztwór ten można przygotować wcześniej i przechowywać w -20°C.
2. Przygotować wilgotną komorę hybrydyzacyjną, wypełniając mały plastikowy pojemnik do przechowywania wodą z kranu do poziomu około 0.5 in. Przykryć pojemnik i podgrzać do 60.5°C.
3. Do dołków płytki hodowlanej 24-dołkowej dodać 2mL PBSTw. Umieścić koszyczki do próbek w otworach pokrywy płytki 24-dołkowej i przenieść skrawki tkanek do koszyczków (stosowano do 10 skrawków na koszyczek).
4. Inkubować skrawki tkanek przez 30min w 25°C w 6% H₂O₂. Tę oraz wszystkie kolejne inkubacje należy przeprowadzać przy łagodnym wytrząsaniu na wytrząsarce orbitalnej, chyba że wskazano inaczej. Wszystkie inkubacje i płukania przeprowadza się w płytkach 24-dołkowych, stosując całkowitą objętość roztworu 2mL/dołek.
5. Płukać skrawki tkanek 4 x 5min w 25°C w PBSTw.
6. Inkubować skrawki tkanek przez 12min w 25°C w PBSTw zawierającym 5μg/mL proteinazy K.
7. Płukać skrawki tkanek 1 x 5min w 25°C w PBSTw.
8. Przeprowadzić postfiksację skrawków tkanek przez 20min w 25°C w PBS zawierającym 4% paraformaldehydu i 0.2% glutaraldehydu.
9. Płukać skrawki tkanek 2 x 5min w 25°C w PBSTw.
10. Dodać 2mL/dołek uprzednio podgrzanego buforu do prehybrydyzacji i inkubować skrawki tkanek w wilgotnej komorze hybrydyzacyjnej przez co najmniej 1hr w 60.5°C.
11. Do buforu do prehybrydyzacji w każdym dołku dodać 0.65μg znakowanej sondy rybowej i inkubować skrawki tkanek przez noc w wilgotnej komorze hybrydyzacyjnej w 60.5°C.

9. Hybrydyzacja in situ dzień 2

1. Przygotować następujące roztwory do etapów płukania po hybrydyzacji: Roztwór 1 (50% formamid, 5x SSC, 1% SDS), Roztwór 2 (10mM Tris-HCL pH 7.5, 0.5M NaCl, 0.1% Tween™ 20, 0.2mM azotku sodu, filtrowany przez filtr 0.22μm) oraz Roztwór 3 (2x SSC, 50% formamid). Roztwory te można przygotować z wyprzedzeniem. Roztwory 1 i 3 przechowuje się w temperaturze -20°C, a Roztwór 2 w temperaturze 25°C. Okres trwałości roztworów wynosi co najmniej 3 miesiące.
2. Płukać skrawki tkanek 3 x 30min w temperaturze 60.5°C uprzednio ogrzanym Roztworem 1. Podczas płukania należy używać komory wilgotnościowej.
3. Płukać skrawki tkanek 1 x 10min w temperaturze 60.5°C uprzednio ogrzanym roztworem z Roztworu 1 i Roztworu 2 (1:1 v/v). Podczas płukania należy używać komory wilgotnościowej.
4. Płukać skrawki tkanek 4 x 10min w temperaturze 25°C Roztworem 2.
5. Inkubować skrawki tkanek przez 15min w temperaturze 37°C w Roztworze 2 zawierającym 0.25μg/mL RNazy.
6. Płukać skrawki tkanek 1 x 10min w temperaturze 25°C Roztworem 2 (bez RNazy).
7. Płukać skrawki tkanek 1 x 10min w temperaturze 25°C Roztworem 3, a następnie płukać 2 x 1h w temperaturze 60.5°C Roztworem 3. Podczas płukania w 60.5°C należy używać komory wilgotnościowej.
8. Przygotować następujące roztwory do detekcji immunohistochemicznej ryboprobek znakowanych DIG: Bufor blokujący tkankę (TB, 1X TBS, 10% surowicy owczej, 1% odczynnika blokującego, 1% BSA, 0.1% Tween™ 20, filtrowany przez filtr 0.22μm), Bufor do rozcieńczania przeciwciał (AD, 1xTBS, 5% surowicy owczej, 1% odczynnika blokującego, 1% BSA, 0.1% Tween™ 20, 0.2mM azotku sodu, filtrowany przez filtr 0.22™m), Bufor do absorpcji przeciwciał (AA, 1xTBS, 5% surowicy owczej, 1% odczynnika blokującego, 1% BSA, 6mg/mL proszku z zarodków) oraz TBSTw (1xTBS, 0.1% Tween™ 20, 0.2mM azotku sodu, filtrowany przez filtr 0.22μm). Roztwory te można przygotować z wyprzedzeniem. TBSTw przechowuje się w temperaturze 25°C, a wszystkie pozostałe roztwory w temperaturze -20°C.
9. Płukać 3 x 10 min w temperaturze 25°C roztworem TBSTw.
10. Inkubować skrawki tkanek przez co najmniej 2h w temperaturze 25°C w buforze TB.
11. Podczas inkubacji tkanek w buforze TB, dodać 1.1μL przeciwciała anty-DIG na każde 200μL buforu AA do każdego dołka. Inkubować mieszaninę buforu AA i przeciwciała przez co najmniej 2h w temperaturze 4°C, a następnie wirować przy 10,000rpm przez 1min. Odpiłować nadsącz buforu AA i dodać go do 2mL buforu AD.
12. Wyjąć skrawki tkanek z buforu TB i inkubować je przez noc w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4°C w buforze AD zawierającym przeciwciała.

10. Hybrydyzacja In Situ Dzień 3

1. Przygotować roztwór do rozwoju barwy NTMT (100mM Tris-HCL pH 9.5, 100mM NaCl, 50mM MgCl₂, 0.2mM azydku sodu, filtrowany przez filtr 0.22μm). Roztwór ten można przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze 25°C. Bezpośrednio przed użyciem dodać 2mM lewamisolu i 0.1% Tween™ 20.
2. Usunąć roztwór przeciwciał (bufor AD + przeciwciało) z dołków i przechowywać go w temperaturze 4°C. Można go wykorzystać ponownie do dwóch razy.
3. Przemyć tkanki 8 X 10 min w temperaturze 25°C roztworem TBSTw zawierającym 2mM lewamisolu.
4. Ostrożnie przenieść tkanki z koszyczków do szalki Petriego zawierającej TBSTw. Za pomocą pincety usunąć widoczne zanieczyszczenia. Przenieść tkanki do czystych probówek do mikrowirówki.
5. Przemyć tkanki 1 X 10 min w temperaturze 25°C za pomocą 1mL NTMT.
6. Usunąć NTMT i dodać do każdej probówki 1mL mieszaniny składającej się w 50% z NTMT (zawierającego 2mM lewamisolu) i w 50% z BM Purple; umieścić probówki w pudełku chroniącym przed światłem i inkubować w temperaturze 25°C. Czas rozwoju barwy wynosi od kilku godzin do kilku dni. Jeśli barwa rozwija się powoli, można zastosować 100% BM Purple.
7. Monitorować rozwój barwy i wymienić roztwór NTMT/BM Purple, jeśli pojawią się w nim osady kryształów lub jeśli zmieni on kolor z żółtego na fioletowy. Po pełnym rozwoju barwy (4-250 godzin), przemyć tkanki 2 X 5min w temperaturze 25°C za pomocą 1mL/probówkę NTMT zawierającego 2mM lewamisolu.
8. Inkubować tkanki przez noc w temperaturze 4°C w 1mL/probówkę PBS zawierającego 4% paraformaldehydu jako utrwalacza potranskrypcyjnego.
9. Aby odbarwić tkanki, inkubować je przez 30min w temperaturze 25°C w 1mL/probówkę PBSTw zawierającego 3% H₂O₂. Następnie przemyć tkanki 1 X 10min w temperaturze 25°C w 1mL/probówkę PBSTw i przechowywać w temperaturze 4°C w 1mL/probówkę PBS zawierającego 4% paraformaldehydu jako utrwalacza potranskrypcyjnego.
10. Przekroje tkanek należy zamontować na szkiełkach przedmiotowych, przykryć szkiełkami nakrywkowymi i obrazować za pomocą mikroskopu złożonego.

11. Reprezentatywne wyniki:

Orientacja przestrzenna tkanki dolnych dróg moczowych (LUT) w agarozie determinuje płaszczyznę przekrojów tkankowych. W przypadku przekrojów strzałkowych wycina się co najmniej dwie trzecie pęcherza moczowego, a pozostałą tkankę LUT zatapia się w agarze w taki sposób, aby linia środkowa cewki moczowej była równoległa do płaskiej powierzchni zatyczki agarozowej (Rysunek 1A). Niewielkie korekty płaszczyzny tkanki można wprowadzić poprzez ścięcie krawędzi płaskiej zatyczki agarozowej pod kątem. Reprezentatywny przekrój strzałkowy tkanki LUT samca w 17,5 dniu ciąży (dpc), zorientowany w tej płaszczyźnie, przedstawiono na Rysunku 1B.

Koszyki na próbki chronią delikatne skrawki tkanek przed zagubieniem oraz przed osadzaniem się kurzu i cząstek stałych podczas wielodniowej procedury ISH. Koszyki na próbki przygotowuje się poprzez przytopienie siatki poliestrowej do uciętego końca probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL (Rysunek 1C). W pokrywce każdego koszyka wykonuje się mały otwór, aby ułatwić przepływ roztworu do wnętrza i na zewnątrz koszyków. Koszyki na próbki zawiesza się w roztworach ISH, umieszczając je w otworach o średnicy 12 mm wywierconych w pokrywkach płytek 24-dołkowych (Rysunek 1D). Zmodyfikowane pokrywki płytek stabilizują koszyki podczas ich przenoszenia między płytkami 24-dołkowymi w trakcie wymiany roztworów.

Ograniczenie niespecyficznego barwienia tła podczas długich okresów inkubacji wymaganych do detekcji mRNA o niskiej liczności jest dużym wyzwaniem. Dodanie 0,2mM azotku sodu do buforów do próbek i ich późniejsza filtracja przez filtry 0,22μm wydawały się ograniczać barwienie tła (Rycina 2). Przy zastosowaniu opisanej tutaj metody nie zaobserwowano widocznych różnic w barwieniu tła, gdy próbki były inkubowane w roztworze wywoływania barwy przez dłuższe okresy czasu (Rycina 3).

Rycina 1. Przygotowanie przekroju tkanki dolnych dróg moczowo-płciowych (LUT) myszy oraz koszyczka do probówki do mikrocentrifugi do techniki ISH. Odcinek LUT (zawierający część pęcherza, cewkę miedniczną i powiązane struktury pochodne przewodów Wolffa i Müllera) jest zatopiony w cylindrycznym czopie 4% niskotopliwego agarosy. (A) Czop zostaje przyklejony do dysku montażowego do próbek i (B) pocięty na sekcje o grubości 50μm za pomocą wibrotomu. (C) Przekrój LUT zostaje przeniesiony do koszyczka w probówce do mikrocentrifugi, który przygotowano poprzez wykonanie otworu w nakrętce probówki i stopienie siatki poliestrowej z odciętym dolnym końcem probówki. (D) Probówka do mikrocentrifugi zostaje włożona w otwory o średnicy 12mm wywiercone w pokrywce płytki 24-dołkowej, dzięki czemu sekcje tkanek są zawieszone w roztworze buforowym podczas protokołu ISH. Groty strzałek wskazują tkankę LUT w czopie agarozowym.

Rycina 2. Wprowadzenie 0,2mM azotku sodu do roztworów filtrowanych przez membranę 0,22μm poprawia jakość tkanki i zmniejsza barwienie tła. Dolne drogi moczowo-płciowe (LUTs) samca myszy w 17,5 dpc zostały pocięte w płaszczyźnie strzałkowej na plastry o grubości 50μm. Przekroje tkankowe wybarwiono metodą ISH za pomocą sondy skierowanej przeciwko twist homolog 1. Bufory użyte do ISH były albo (A) filtrowane przez membranę 0,22μm i uzupełnione o 0,2mM azotku sodu (NaAz), albo (B) niefiltrowane i bez dodatku NaAz. Głowice strzałek wskazują barwienie tła. Obrazy wykonano przy tym samym powiększeniu. Wyniki przedstawiają reprezentatywne wzorce barwienia dla n = 3 myszy z różnych miotów.

Rysunek 3. Intensywność barwienia tła nie wydaje się wzrastać wraz z wydłużeniem czasu ujawniania barwy. Dolne drogi moczowo-płciowe (LUTs) samca myszy w 17,5 dpc zostały pocięte w płaszczyźnie strzałkowej na sekcje o grubości 50μm. Sekcje poddano barwieniu metodą ISH poprzez inkubację w roztworze barwiącym chromogenem przez (A) 9,5h przy użyciu sondy rozpoznającej wysoką obfitość transkrypcyjną receptora gamma związanego z estrogenem (Esrrg), (B) przez 43,5h przy użyciu sondy rozpoznającej średnią obfitość transkrypcyjną domeny bromodomeny sąsiadującej z domeną palca cynkowego, 2A (Baz2a) lub (C) przez 236h przy użyciu sondy rozpoznającej niską obfitość transkrypcyjną rodziny miejsc integracji MMTV typu wingless, członka 10a (Wnt10a). Obrazy wykonano przy tym samym powiększeniu. Wyniki przedstawiają reprezentatywne wzorce barwienia dla n = 3 myszy z różnych miotów.

Dyskusja

Stosując opisaną tutaj metodę, możliwe jest wykrycie mRNA we wszystkich głównych typach komórek i przedziałach tkankowych płodowych męskich i żeńskich układów moczowo-płciowych (LUT) myszy, w tym w poduszkach mezenchymalnych, urothelium, mięśniach gładkich, pąkach prostaty, przewodzie wytryskowym oraz w pochwie. Przekroje o grubości 50μm stosowane w tym protokole mają tę zaletę, że są wystarczająco grube, aby rozpoznać architekturę tkanki (np. naczynia krwionośne), a jednocześnie na tyle cienkie, aby uniknąć pułapkowania...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciało anty-digoksigeninowe, fragmenty Fab	Grupa Roche	11214667001
Odczynnik blokujący	Grupa Roche	11096176001
Podłoże BM Purple AP, wytrącające się	Grupa Roche	11442074001
Albumina surowicy bydlęcej	Fisher Scientific	BP1600-100
Płytka do hodowli komórkowej, 24 dołki	Corning	3524
Digoksygenina 11-UTP	Grupa Roche	1277073910
dNTP	Grupa Roche	11969064001
Dwukrotna żyletka	Wilkinson Sword	Model klasyczny
Eliminase – preparat do usuwania RNaz	Decon Laboratories	1102
Formamid	Sigma-Aldrich	F5786-1L
Zestaw do oczyszczania DNA z żelu	Qiagen	28704
Glutaraldehyd, roztwór 25% w H2O2O	Sigma-Aldrich	G6257-100ML
Heparyna, sól sodowa	Sigma-Aldrich	H3393
Nadtlenek wodoru, roztwór 30% w H2O2O	Fisher Scientific	BP2633-500
Lewamizol	Sigma-Aldrich	L9756
Szybkowiążący klej błyskawiczny Loctite 404	Henkel Corp	46551
Chlorek magnezu	Fisher Scientific	M33-500
Kwas maleinowy	Sigma-Aldrich	M0375-500G
Probówki do mikrowirówki, 1,5 ml	Biologix Research Company	BP337-100
Wkład do płytki hodowlanej Millicell	EMD Millipore	PICM01250
Żywica do rozcierania molekularnego	G-Biosciences	786-138PR
Paraformaldehyd, 4% roztwór w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem	Affymetrix	19943
bufor fosforanowy (PBS), bez Ca & Mg	MP Biomedicals	ICN1760420
Siatka poliestrowa, 33 mikrony, 12" x 24"	Small Parts, Inc.	CMY-0033-D
roztwór proteinazy K, 20 mg/ml	Amresco	E195-5ML
Kolumny QIAshredder	Qiagen	79654
roztwór Q	Qiagen	Dostarczono polimerazę DNA Taq
RNaza	Sigma-Aldrich	R6513
inhibitor RNazy	Grupa Roche	03335399001
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
zestaw RNEASY mini kit	Qiagen	74104
RQ1 DNaza wolna od RNaz	Promega Corp.	M6101
agaroza niskotopliwa SeaPlaque	Lonza Inc.	50101
Surowica owcza	Sigma-Aldrich	S2263-500mL
Jednostka filtrująca Stericup, 0,22 µmμm, polietersulfon, 500 ml	EMD Millipore	SCGPU05RE
Azydek sodu, ziarnisty	Fisher Scientific	S227I-100
Chlorek sodu	Fisher Scientific	BP358-212
Dodecylosiarczan sodu	Fisher Scientific	S529-500
SSC, roztwór 20X	Research Products International Corp.	S24022-4000.0
System do syntezy pierwszej nici SuperScript III	Invitrogen	18080-051
polimeraza RNA T7	Grupa Roche	10881767001
polimeraza DNA Taq	Qiagen	201203
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153-1
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
Wibromikrotom z zaawansowaną wanną do próbek	Leica Microsystems	VT1000A
tRNA drożdży	Grupa Roche	109495