Przedstawiono zmodyfikowany trójwymiarowy układ in vitro, w którym charakterystyka wzrostu kilku linii komórkowych nowotworu w zrekonstytuowanej błonie podstawnej koreluje z uśpionym lub proliferacyjnym zachowaniem komórek nowotworowych w wtórnym miejscu przerzutowym in vivo.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
System In Vitro do badania uśpienia nowotworów i przejścia w wzrost przerzutny
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nawroty raka piersi często następują po długim okresie utajenia, w którym nie występują objawy nowotworu, a przerzuty mogą nie stać się klinicznie widoczne aż do wielu lat po usunięciu guza pierwotnego i przeprowadzeniu terapii adjuwantowej. Prawdopodobnym wyjaśnieniem tego zjawiska jest fakt, że komórki nowotworowe zasiedliły miejsca przerzutowe, są oporne na konwencjonalne terapie i pozostają w stanie uśpienia przez długi czas 1-4.
Istnienie uśpionych komórek nowotworowych w miejscach wtórnych opisywano wcześniej jako spoczywające komórki samotne, które nie proliferują ani nie ulegają apoptozie 5-7. Co więcej, wykazano, że komórki samotne te oddzielają się od guza pierwotnego na wczesnym etapie progresji choroby 8-10 i przebywają w stanie zatrzymania wzrostu w szpiku kostnym, krwi oraz węzłach chłonnych pacjentów 1,4,11. Zrozumienie mechanizmów regulujących uśpienie lub przejście w stan proliferacyjny jest zatem kluczowe dla odkrycia nowych celów i interwencji zapobiegających nawrotowi choroby. Jednakże wyjaśnienie mechanizmów regulujących przejście z uśpienia nowotworowego do wzrostu przerzutowego było utrudnione ze względu na brak dostępnych systemów modelowych.
in vivo i ex vivo systemy modelowe służące do badania progresji przerzutowej komórek nowotworowych zostały opisane wcześniej 1,12-14. Jednakże systemy modelowe te nie dostarczyły w czasie rzeczywistym i w sposób wysokoprzepustowy wglądu w mechanizmy wyzwalające przejście pojedynczych uśpionych komórek nowotworowych do proliferacji jako choroby przerzutowej. Opracowaliśmy niedawno trójwymiarowy (3D) system in vitro do modelowania cech wzrostu in vivo komórek wykazujących albo uśpione (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46), albo proliferacyjne (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) zachowania przerzutowe in vivo. Wykazaliśmy, że komórki nowotworowe wykazujące uśpienie in vivo w miejscu przerzutu pozostają w stanie spoczynku podczas hodowli w trójwymiarowym (3D) ekstraktcie błony podstawnej (BME), podczas gdy komórki silnie przerzutowe in vivo łatwo proliferują w hodowli 3D po zmiennych, ale stosunkowo krótkich okresach spoczynku. Co istotne, wykorzystując system modelowy 3D in vitro, udowodniliśmy po raz pierwszy, że skład ECM odgrywa ważną rolę w regulowaniu tego, czy uśpione komórki nowotworowe przejdą w stan proliferacyjny, a następnie potwierdziliśmy to w badaniach in vivo15-17. Zatem system modelowy opisany w niniejszym raporcie zapewnia metodę in vitro do modelowania uśpienia nowotworu i badania przejścia do wzrostu proliferacyjnego indukowanego przez mikrośrodowisko.
Protokół
1. Hodowla i utrzymanie uśpionych i przerzutnych linii komórek nowotworowych
- Hodować uśpione komórki nowotworowe (D2OR/ MCF7/K7M2-AS.46) oraz komórki nowotworu przerzutowego (D2A1/ MDA-MB-231/ K7M2) w 10 cm płytkach hodowlanych zawierających DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) z wysoką zawartością glukozy, 10% FBS (płytkowa surowica bydlęca) oraz antybiotyki. Po osiągnięciu przez komórki 70-80% konfluencji przejść do następnych analiz.
2. Analiza proliferacji uśpionych (spoczynkowych) oraz przerzutowych (proliferujących) komórek nowotworowych hodowanych w systemie 3D-BME
Hodowla komórek uśpionych/metastatycznych w systemie 3D
- Odmrozić ekstrakt błony podstawnej (BME) Cultrex z obniżoną zawartością czynników wzrostu w lodówce w temperaturze 4°C na noc przed przeprowadzeniem analizy. Należy pamiętać, że BME należy przez cały czas przechowywać na lodzie.
- Następnego dnia umieścić płytkę 96-dołkową na tacy z lodem wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza. Pokryć każdy dołek 50-10μl lodowatego BME, używając dozownika ze strzykawką. Upewnić się, że w dołkach nie powstały pęcherzyki powietrza. Umieścić płytkę 96-dołkową pokrytą BME w inkubatorze z nawilżaniem, w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37°C na 30 minut.
- W międzyczasie odessać medium z komórek guza uśpionego i/lub przerzutowego (przygotowanych w sekcji 1). Przepłukać płytki hodowlane 10 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym, pH 7.4 (PBS). Odessać PBS i dodać do płytek hodowlanych 2ml trypsyny uprzednio ogrzanej do 37°C. Inkubować płytki w warunkach nawilżania, 5% CO2 w temperaturze 37°C przez 5 min.
- Przenieść komórki do probówki stożkowej 15 ml zawierającej 5ml DMEM z wysoką zawartością glukozy uzupełnionego o 10% FCS i antybiotyki, a następnie policzyć komórki.
- Odwirować całkowitą liczbę komórek przeznaczonych do hodowli w wirówce do hodowli tkankowych z prędkością 150g w temperaturze pokojowej przez 5 min. W naszych analizach przygotowujemy 2X103 komórek/dołek dla każdej linii komórkowej lub badanego punktu czasowego. Wartość ta może się jednak różnić w zależności od zastosowanych linii komórkowych.
- Ostrożnie odessać nadsącz. Należy pamiętać, że w większości przypadków osad nie jest widoczny, dlatego należy pozostawić niewielką ilość medium. Opukać palcami dno probówki stożkowej 15ml, aby upewnić się, że uzyskano zawiesinę pojedynczych komórek. Resuspendować osad w DMEM z niską zawartością glukozy z antybiotykami uzupełnionym o 2% FCS + 2% BME (medium analityczne). Należy dodać 10 μl medium analitycznego na każde 2x103 komórek. Kilkukrotnie triturować komórki pipetą 5ml, aby zapewnić utrzymanie zawiesiny pojedynczych komórek.
- Nanieść 10μl mieszaniny komórek na dołek na powierzchnię płytki 96-dołkowej pokrytej BME. W celu oceny tła (w sekcji 2.8) nanieść dodatkowo 10μl samego medium analitycznego na dołek płytki 96-dołkowej pokrytej BME. Inkubować przygotowane płytki 96-dołkowe w inkubatorze z nawilżaniem, w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37°C. Komórki należy dokarmiać medium analitycznym co 4 dni.
Test proliferacji:
- Test proliferacji komórek: do studzienek w wybranych punktach czasowych dodać 20 μl roztworu z zestawu Cell Titer 96 AQueous One Solution Cell Proliferation assay kit. Inkubować w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37°C przez 2h. Za pomocą czytnika płytek ELISA zmierzyć absorbancję przy 490nm. W celu oceny i odjęcia tła, dodać 20μl roztworu z zestawu Cell Titer 96 AQueous One Solution Cell Proliferation assay kit do studzienek uprzednio powleczonych BME i zawierających jedynie pożywkę do testu. Za pomocą czytnika płytek ELISA zmierzyć absorbancję przy 490 nm.
3. Barwienie immunofluorescencyjne cząsteczek sygnałowych w uśpionych (spoczywających) komórkach nowotworowych i/lub przerzutowych (proliferujących) komórkach nowotworowych
Kultywowanie komórek uśpionych/metastatycznych w systemie 3D do barwienia immunofluorescencyjnego
*Poniższy protokół jest modyfikacją protokołu hodowli 3D opublikowanego przez Debnatha J et al 18.
- Przygotować BME zgodnie z opisem w sekcji 2.1. Następnego dnia: umieścić system szkiełek 8-komorowych na tacy z lodem wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza. Pokryć każdą studnię 50µl schłodzonego BME, używając pipety 20μl. Upewnić się, że BME jest rozłożone równomiernie i że w studniach nie powstały pęcherzyki powietrza. Umieścić pokryte BME szkiełka 8-komorowe w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 w temperaturze 37°C na 20 min.
- Zebrać komórki uśpione i/lub przerzutowe z sekcji 1 i przygotować do hodowli zgodnie z opisem w sekcjach 2.3- 2.4. Zebrać całkowitą liczbę komórek do hodowli do 15 ml probówki stożkowej. Przygotowujemy 5 x103 komórek / studnię dla każdej linii komórkowej i badanego punktu czasowego. Odwirować komórki w wirówce do hodowli tkankowych z prędkością 150g w temperaturze pokojowej przez 5 min. Ostrożnie odessać nadsącz. Należy zauważyć, że pellet nie jest widoczny, dlatego należy pozostawić niewielką ilość medium. Opukać palcami dno 15ml probówki stożkowej, aby upewnić się, że uzyskano zawiesinę pojedynczych komórek. Resuspendować pellet w medium do analizy. Na każde 5x103 komórek należy dodać 40μl medium do analizy. Kilkakrotnie trituratować komórki za pomocą pipety 5ml. Ten etap jest bardzo ważny, aby zapewnić utrzymanie zawiesiny pojedynczych komórek.
- Wysiać 40μl mieszaniny komórek na studnię, na każdą z 8 komór pokrytych BME. Inkubować system szkiełek 8-komorowych z hodowlą w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37°C. Komórki należy dokarmiać medium do analizy co 4 dni.
Barwienie immunofluorescencyjne:
- W wybranych punktach czasowych odessać górną warstwę pożywki i dodać 20μl utrwalacza zawierającego 4% Paraformaldehyde (PFA), 5% sacharozy i 0,1% Triton X-10, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odessać utrwalacz i dodać 200μl 4% PFA zawierającego 5% sacharozy, inkubując w temperaturze pokojowej przez 25 minut.
- Odessać utrwalacz; do każdej studni dodać 40 μl soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odessać PBS i dodać 40 μ PBS zawierający 0,05% Tween 20 na 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Zablokować utrwalone komórki w temperaturze pokojowej, dodając 20μl 10% surowicy z osła lub 3% BSA przez 1 godzinę (roztwór blokujący należy dobrać empirycznie dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego).
- Odessać roztwór blokujący i dodać 20μl przeciwciała pierwszorzędowego (rozcieńczenie należy dobrać empirycznie dla każdego stosowanego przeciwciała pierwszorzędowego). Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w 10% surowicy z osła, jeśli do blokowania użyto 10% surowicy z osła, lub rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w 3% BSA, jeśli zastosowano roztwór blokujący 3% BSA. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4°C.
- Odessać przeciwciało, przemyć studnie 40μl PBS przez 15 minut i powtórzyć tę czynność dwukrotnie. Odessać PBS i dodać 20μl przeciwciała wtórnego przeciw-odpowiednim-IgG z osła sprzężonego z rhodamine red (rozcieńczenie należy dobrać empirycznie), przykryć szkiełko 8-komorowe folią aluminiową i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Przemyć studnie 40μl PBS (3x15 minut na każde przemycie). Odessać PBS. Zamontować preparat przy użyciu medium montażowego VECTASHIELD z DAPI. Suszyć szkiełka przez 40 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Szkiełka można przechowywać przez 1 tydzień w temperaturze 4°C. Przechowywać szkiełka w ciemności. Wykonać obrazowanie szkiełek za pomocą mikroskopii konfokalnej.
4. Reprezentatywne wyniki:
Przykład analizy proliferacji uśpionych komórek nowotworowych D2.0R oraz przerzutowych komórek D2A1 w hodowli 3D przedstawiono na Rysunku 1A. Komórki D2.0R pozostają uśpione (w stanie spoczynku) przez cały 14-dniowy okres hodowli eksperymentalnej, podczas gdy silnie przerzutowe komórki D2A1 pozostają uśpione jedynie przez cztery do sześciu dni, po czym zaczynają proliferować. W początkowej fazie uśpienia wiele komórek w hodowli 3D występuje pojedynczo (Rysunek 1B; dzień 4), natomiast inne nieproliferujące komórki tworzą wielokomórkowe sferoidy. Przejście komórek D2A1 ze stanu uśpienia do stanu proliferacyjnego w hodowli 3D (Rysunek 1B; dzień 12) wiąże się z gwałtownymi zmianami morfologii komórek. W związku z tym badanie to może być wykorzystane do sprawdzenia, jakie czynniki mogą pobudzić uśpione komórki D2.0R do wyjścia ze stanu uśpienia oraz jakie czynniki mogą zapobiegać przejściu komórek D2A1 ze stanu uśpienia. Rysunek 2 przedstawia przykład czynnika zapobiegającego przejściu komórek D2A1 ze stanu uśpienia do stanu proliferacyjnego. Jak zilustrowano na Rysunku 2, traktowanie komórek D2A1 specyficznym inhibitorem kinazy lekkich łańcuchów miozyny (ML-7) pozwoliło utrzymać komórki D2A1 w stanie uśpienia.
Sygnalizację komórkową w uśpionych i proliferujących komórkach nowotworowych hodowanych w systemie 3D można badać za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego na cząsteczki sygnałowe. Jak pokazano na Rysunku 3, podczas przejścia z fazy uśpienia (dni 1–4) do proliferacji (dzień 7) w komórkach D2A1 następuje znaczny wzrost fosforylacji lekkich łańcuchów miozyny (barwienie czerwone), po którym następuje reorganizacja filamentów f-aktyny tworzących włókna stresowe aktyny (barwienie zielone). Jednakże zablokowanie aktywności kinazy lekkich łańcuchów miozyny w komórkach D2A1 za pomocą shRNA lub specyficznego leku (ML-7) utrzymuje komórki D2A1 w stanie uśpienia i prowadzi do zahamowania fosforylacji lekkich łańcuchów miozyny oraz organizacji włókien stresowych f-aktyny (Rysunek 4).
Rysunek 1. in vitro model do badania uśpienia pojedynczych komórek nowotworowych oraz przejścia w wzrost przerzutniczy. A) Proliferacja uśpionych komórek D2.0R i przerzutniczych D2A1 w 3D Cultrex BME, n=8 (średnia ± SE). Reprezentatywne wyniki trzech eksperymentów (* p≤0,05). B) Obrazy z mikroskopii świetlnej komórek D2.0R i D2A1 hodowanych w 3D Cultrex Powiększenie BME x20. Rysunek zmodyfikowany na podstawie Barkan i wsp. 17.
Rysunek 2. Zapobieganie przejściu komórek D2A1 ze stanu uśpienia (spoczynku) do proliferacji w systemie hodowli 3D poprzez inhibicję kinazy lekkiego łańcucha miozyny (MLCK)Przebieg czasowy proliferacji komórek D2A1 hodowanych w 3D Cultrex BME, n=8 (średnia ± SE). Komórki nie były poddane działaniu czynników (kontrola) lub były traktowane specyficznym inhibitorem MLCK (ML-7; 5 μM) przez 48 h, począwszy od 5. dnia hodowli. Rysunek zmodyfikowany na podstawie Barkan et al. 17.
Rysunek 3. Fosforylacja lekkich łańcuchów miozyny, po której następuje reorganizacja aktyny F podczas przejścia komórek D2A1 ze stanu uśpienia do wzrostu proliferacyjnegoKomórki D2A1 hodowano w 3D. Cultrex BME na szkiełku przedmiotowym z 8 komorami. Komórki utrwalono i zabarwiono DAPI (niebieski) w celu lokalizacji jąder, faloidyną (zielony) dla f-aktyny oraz przeciwciałem przeciwko fosforylowanej formie lekkiego łańcucha miozyny (MLC-p) (czerwony), jak wskazano dla różnych punktów czasowych. Nałożenie obrazów barwienia f-aktyny i MLC-p (żółty). Ekspresja MLC-p wzrosła podczas przejścia komórek D2A1 ze stanu uśpienia (dni 1–4) do wzrostu proliferacyjnego (dzień 7), po którym nastąpiło tworzenie włókien stresowych aktyny (strzałki). Mikroskopia konfokalna, powiększenie x63. Biały pasek odpowiada 20 mikronom. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Barkan et al. 17.
Rysunek 4. Inhibicja tworzenia włókien stresowych z f-aktyny w komórkach D2A1 pośredniczona przez kinazę lekkich łańcuchów miozyny (MLCK). Komórki D2A1 nie poddano obróbce (kontrola) lub poddano działaniu inhibitora MLCK (ML-7; 5 μM), przez 48 h poczynając od 5. dnia hodowli, lub traktowane skramblowanym shRNA lub shRNA przeciwko MLCK i barwione na fosforylowaną formę lekkiego łańcucha miozyny (MLC-p) (czerwony), f-aktynę (zielony) oraz jądra komórkowe (niebieski). Nałożenie obrazów barwienia f-aktyny i MLC-p (żółty). Mikroskopia konfokalna, powiększenie x63. Biały pasek odpowiada 20 mikronom.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Mechanizmy odpowiedzialne za utrzymywanie rozproszonych komórek nowotworowych w stanie uśpienia lub prowadzące do ich przejścia w wzrost przerzutny pozostają w dużej mierze nieznane. Zjawisko to było niezwykle trudne do zbadania u pacjentów ludzkich 4,12, a opracowano niewiele modeli przedklinicznych pozwalających rozwiązać ten problem. Niemniej jednak scharakteryzowano niektóre systemy modelowe uśpienia nowotworów in vivo oraz ex-vivo (przegląd w 1,12). Jednak modele in vivo
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsze badania były częściowo finansowane z Programu Badań Wewnętrznych (Intramural Research Program) Narodowego Instytutu Nowotworów (National Cancer Institute).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM z wysoką zawartością glukozy | Invitrogen | 11965-118 | |
| DMEM z niską zawartością glukozy | Invitrogen | 11885-092 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Invitrogen | 10091-148 | |
| Ekstrakt z błony podstawnej Cultrex 3-D z obniżoną zawartością czynników wzrostu | Trevigen Inc. | Stężenie białka między 14-15mg/ml | |
| Linie komórkowe D2.0R i D2A1 | 5,19 | ||
| Komórki K7M2 i K7M2AS1.46 | 20 | ||
| Komórki raka piersi MCF-7 i MDA-MB-231 | ATCC | ||
| Szklany system szkiełek z 8 komorami | Lab-Tek | 177402 | |
| Zestaw do badania proliferacji komórek Cell Titer 96 AQueous One Solution | Promega Corp. | G3580 | |
| Medium montażowe VECTASHIELD z DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Normalna surowica osła | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Czytnik płytek ELISA | Bio-Tec | Pomiar przy 490nm | |
| Mikroskop konfokalny | Carl Zeiss, Inc. | Powiększenie x63 |
Bibliografia
- Aguirre-Ghiso, J. A. Models, mechanisms and clinical evidence for cancer dormancy. Nat Rev Cancer. 7, 834-846 (2007).
- Pantel, K., Woelfle, U. Micrometastasis in breast cancer and other solid tumors. J Biol Regul Homeost Agents. 18, 120-125 (2004).
- Naumov, G. N. Ineffectiveness of doxorubicin treatment on solitary dormant mammary carcinoma cells or late-developing metastases. Breast Cancer Res Treat. 82, 199-206 (2003).
- Klein, C. A. Framework models of tumor dormancy from patient-derived observations. Curr Opin Genet Dev. , (2010).
- Naumov, G. N. Persistence of solitary mammary carcinoma cells in a secondary site: a possible contributor to dormancy. Cancer Res. 62, 2162-2168 (2002).
- Townson, J. L., Chambers, A. F. Dormancy of solitary metastatic cells. Cell Cycle. 5, 1744-1750 (2006).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Pantel, K. Differential expression of proliferation-associated molecules in individual micrometastatic carcinoma cells. J Natl Cancer Inst. 85, 1419-1424 (1993).
- Demicheli, R. Tumour dormancy: findings and hypotheses from clinical research on breast cancer. Semin Cancer Biol. 11, 297-306 (2001).
- Braun, S. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N Engl J Med. 353, 793-802 (2005).
- Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. Cancer micrometastases. Nat Rev Clin Oncol. 6, 339-351 (2009).
- Goss, P. E., Chambers, A. F. Does tumour dormancy offer a therapeutic target. Nat Rev Cancer. 10, 871-877 (2010).
- Mendoza, A. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120, 2979-2988 (2010).
- Naumov, G. N. A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype. J Natl Cancer Inst. 98, 316-325 (2006).
- Barkan, D. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).
- Barkan, D., Green, J. E., Chambers, A. F. Extracellular matrix: A gatekeeper in the transition from dormancy to metastatic growth. Eur J Cancer. , (2010).
- Barkan, D. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. Cancer Res. 68, 6241-6250 (2008).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
- Morris, V. L. Mammary carcinoma cell lines of high and low metastatic potential differ not in extravasation but in subsequent migration and growth. Clin Exp Metastasis. 12, 357-367 (1994).
- Khanna, C. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med. 10, 182-186 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
