Artykuł metodologiczny

System In Vitro do badania uśpienia nowotworów i przejścia w wzrost przerzutny

15.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2914

⸱

11 sierpnia 2011

 , 
1Department of Biology, University of Haifa, 2Transgenic Oncogenesis and Genomics Section, Laboratory of Cancer Biology and Genetics, National Cancer Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono zmodyfikowany trójwymiarowy układ in vitro, w którym charakterystyka wzrostu kilku linii komórkowych nowotworu w zrekonstytuowanej błonie podstawnej koreluje z uśpionym lub proliferacyjnym zachowaniem komórek nowotworowych w wtórnym miejscu przerzutowym in vivo.

Streszczenie

Nawroty raka piersi często następują po długim okresie utajenia, w którym nie występują objawy nowotworu, a przerzuty mogą nie stać się klinicznie widoczne aż do wielu lat po usunięciu guza pierwotnego i przeprowadzeniu terapii adjuwantowej. Prawdopodobnym wyjaśnieniem tego zjawiska jest fakt, że komórki nowotworowe zasiedliły miejsca przerzutowe, są oporne na konwencjonalne terapie i pozostają w stanie uśpienia przez długi czas 1-4.

Istnienie uśpionych komórek nowotworowych w miejscach wtórnych opisywano wcześniej jako spoczywające komórki samotne, które nie proliferują ani nie ulegają apoptozie 5-7. Co więcej, wykazano, że komórki samotne te oddzielają się od guza pierwotnego na wczesnym etapie progresji choroby 8-10 i przebywają w stanie zatrzymania wzrostu w szpiku kostnym, krwi oraz węzłach chłonnych pacjentów 1,4,11. Zrozumienie mechanizmów regulujących uśpienie lub przejście w stan proliferacyjny jest zatem kluczowe dla odkrycia nowych celów i interwencji zapobiegających nawrotowi choroby. Jednakże wyjaśnienie mechanizmów regulujących przejście z uśpienia nowotworowego do wzrostu przerzutowego było utrudnione ze względu na brak dostępnych systemów modelowych.

in vivo i ex vivo systemy modelowe służące do badania progresji przerzutowej komórek nowotworowych zostały opisane wcześniej 1,12-14. Jednakże systemy modelowe te nie dostarczyły w czasie rzeczywistym i w sposób wysokoprzepustowy wglądu w mechanizmy wyzwalające przejście pojedynczych uśpionych komórek nowotworowych do proliferacji jako choroby przerzutowej. Opracowaliśmy niedawno trójwymiarowy (3D) system in vitro do modelowania cech wzrostu in vivo komórek wykazujących albo uśpione (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46), albo proliferacyjne (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) zachowania przerzutowe in vivo. Wykazaliśmy, że komórki nowotworowe wykazujące uśpienie in vivo w miejscu przerzutu pozostają w stanie spoczynku podczas hodowli w trójwymiarowym (3D) ekstraktcie błony podstawnej (BME), podczas gdy komórki silnie przerzutowe in vivo łatwo proliferują w hodowli 3D po zmiennych, ale stosunkowo krótkich okresach spoczynku. Co istotne, wykorzystując system modelowy 3D in vitro, udowodniliśmy po raz pierwszy, że skład ECM odgrywa ważną rolę w regulowaniu tego, czy uśpione komórki nowotworowe przejdą w stan proliferacyjny, a następnie potwierdziliśmy to w badaniach in vivo15-17. Zatem system modelowy opisany w niniejszym raporcie zapewnia metodę in vitro do modelowania uśpienia nowotworu i badania przejścia do wzrostu proliferacyjnego indukowanego przez mikrośrodowisko.

Protokół

1. Hodowla i utrzymanie uśpionych oraz metastatycznych linii komórkowych nowotworu

  1. Hodować uśpione komórki nowotworowe (D2OR/ MCF7/K7M2-AS.46) oraz komórki przerzutowe (D2A1/ MDA-MB-231/ K7M2) w płytkach hodowlanych 10 cm zawierających DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) z wysoką zawartością glukozy, 10% FBS (płodowej surowicy bydlęcej) oraz antybiotykami. Po osiągnięciu przez komórki 70-80% konfluencji przejść do następnych analiz.

2. Test proliferacji komórek nowotworowych w stanie uśpienia (spoczynku) i komórek przerzutowych (proliferujących) hodowanych w systemie 3D-BME

Hodowla komórek uśpionych/metastatycznych w systemie 3D

  1. Rozmrozić ekstrakt błony podstawnej (BME) Cultrex z obniżoną zawartością czynników wzrostu w lodówce w temperaturze 4°C dzień przed przeprowadzeniem testu. Należy pamiętać, że BME powinien być przez cały czas przechowywany w lodzie.
  2. Następnego dnia umieścić płytkę 96-dołkową na tacy z lodem wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza. Każdy dołek pokryć 50-100μl lodowatego BME za pomocą dozownika ze strzykawką. Należy upewnić się, że w dołkach nie powstały pęcherzyki powietrza. Płytkę 96-dołkową pokrytą BME umieścić w inkubatorze z nawilżaniem, w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37°C na 30 minut.
  3. W międzyczasie odessać medium z komórek guza uśpionego i/lub przerzutowego (przygotowanych w sekcji 1). Przepłukać płytki hodowlane 10 ml fosforanowo-buforowanego roztworu soli, pH 7.4 (PBS). Odessać PBS i dodać do płytek hodowlanych 2ml trypsyny uprzednio ogrzanej do 37°C. Inkubować płytki w warunkach nawilżania, 5% CO2 w temperaturze 37°C przez 5 min.
  4. Przenieść komórki do probówki stożkowej 15 ml zawierającej 5ml DMEM z wysoką zawartością glukozy uzupełnionego o 10% FCS i antybiotyki, a następnie policzyć komórki.
  5. Odwirować całkowitą liczbę komórek przeznaczonych do hodowli w wirówce do kultur tkankowych z prędkością 1500g w temperaturze pokojowej przez 5 min. W naszych testach przygotowujemy 2X103 komórek /dołek dla każdej linii komórkowej lub punktu czasowego poddanego badaniu. Wartość ta może się jednak różnić w zależności od użytych linii komórkowych.
  6. Ostrożnie odessać nadsącz. Należy pamiętać, że w większości przypadków osad nie jest widoczny, dlatego należy pozostawić niewielką ilość medium. Opukać palcami dno probówki stożkowej 15ml, aby upewnić się, że uzyskano zawiesinę pojedynczych komórek. Resuspender osad w DMEM z niską zawartością glukozy z antybiotykami, uzupełnionym o 2% FCS + 2% BME (medium testowe). Należy dodać 100 μl medium testowego na każde 2x103 komórek. Wielokrotnie triturować komórki pipetą 5ml, aby zapewnić utrzymanie zawiesiny pojedynczych komórek.
  7. Nanieść 100μl mieszaniny komórkowej na dołek na powierzchnię płytki 96-dołkowej pokrytej BME. W celu oceny tła (w sekcji 2.8) nanieść dodatkowo 100μl na dołek samego medium testowego na płytkę 96-dołkową pokrytą BME. Inkubować przygotowane płytki 96-dołkowe w inkubatorze z nawilżaniem, 5% CO2 w temperaturze 37°C. Komórki należy dokarmiać medium testowym co 4 dni.

Test proliferacji:

  1. Test proliferacji komórek: w wybranych punktach czasowych dodać do studni 20 μl odczynnika z zestawu Cell Titer 96 AQueous One Solution Cell Proliferation assay. Inkubować w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37°C przez 2h. Za pomocą czytnika płytek ELISA zmierzyć absorbancję przy 490nm. W celu oceny i odjęcia tła, dodać 20μl odczynnika z zestawu Cell Titer 96 AQueous One Solution Cell Proliferation assay do studni uprzednio powleczonych BME i zawierających jedynie pożywkę do testu. Za pomocą czytnika płytek ELISA zmierzyć absorbancję przy 490 nm.

3. Barwienie immunofluorescencyjne cząsteczek sygnalizacji komórkowej w uśpionych (spoczywających) komórkach nowotworowych i/lub przerzutowych (proliferujących) komórkach nowotworowych

Hodowla komórek uśpionych/metastatycznych w systemie 3D do barwienia immunofluorescencyjnego

*Poniższy protokół jest modyfikacją protokołu hodowli 3D opublikowanego przez Debnath J et al 18.

  1. Przygotować BME zgodnie z opisem w sekcji 2.1. Następnego dnia: umieścić system szkiełek przedmiotowych z 8 komorami na tacy z lodem wewnątrz dygestorium z przepływem laminarnym. Pokryć każdą studzienkę 50ul lodowatego BME za pomocą pipety 200μl. Upewnić się, że BME jest rozprowadzone równomiernie i w studzienkach nie powstały pęcherzyki powietrza. Umieścić szkiełko z 8 komorami pokryte BME w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37°C na 20 min.
  2. Zebrać komórki uśpione i/lub przerzutowe z sekcji 1 i przygotować do hodowli zgodnie z opisem w sekcjach 2.3- 2.4. Zebrać całkowitą liczbę komórek do hodowli do probówki stożkowej 15 ml. Przygotowujemy 5 x103 komórek / studzienkę dla każdej linii komórkowej i badanego punktu czasowego. Odwirować komórki w wirówce do hodowli tkankowych z prędkością 1500g w temperaturze pokojowej przez 5 min. Ostrożnie odessać nadsącz. Należy pamiętać, że osad nie jest widoczny; dlatego należy pozostawić niewielką ilość pożywki. Opukać palcami dno probówki stożkowej 15ml, aby upewnić się, że uzyskano zawiesinę pojedynczych komórek. Resuspendować osad w pożywce do testu. Na każde 5x103 komórek należy dodać 400μl pożywki do testu. Wielokrotnie triturować komórki za pomocą pipety 5ml. Ten krok jest bardzo ważny dla zapewnienia utrzymania zawiesiny pojedynczych komórek.
  3. Nanieść 400μl mieszaniny komórek na studzienkę, na wierzch każdej z 8 komór pokrytych BME. Inkubować system szkiełek z 8 komorami z hodowlą w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37°C. Komórki należy dokarmiać pożywką do testu co 4 dni.

Barwienie immunofluorescencyjne:

  1. W wybranych punktach czasowych odessać górną warstwę medium i dodać 200μl utrwalacza zawierającego 4% Paraformaldehydu (PFA), 5% sacharozy i 0,1% Triton X-100, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odessać utrwalacz i dodać 200μl 4% PFA zawierającego 5% sacharozy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 25 minut.
  2. Odessać utrwalacz; do każdej studni dodać 400 μl fosforanu soli buforowanej (PBS). Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odessać PBS i dodać 400 μl PBS zawierającego 0,05% Tween 20 na 10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Zablokować utrwalone komórki w temperaturze pokojowej, stosując 200μl 10% surowicy osła lub 3% BSA przez 1 godzinę (odpowiedni roztwór blokujący należy dobrać empirycznie dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego).
  4. Odessać roztwór blokujący i dodać 200μl przeciwciała pierwszorzędowego (rozcieńczenie należy dobrać empirycznie dla każdego stosowanego przeciwciała pierwszorzędowego). Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w 10% surowicy osła, jeśli do blokowania użyto 10% surowicy osła, lub w 3% BSA, jeśli użyto roztworu blokującego z 3% BSA. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w 4°C.
  5. Odessać przeciwciało, przemyć studnie 400μl PBS przez 15 minut i powtórzyć tę czynność dwukrotnie. Odessać PBS i dodać 200μl przeciwciała wtórnego anty-IgG osła sprzężonego z rodaminą czerwoną (rozcieńczenie należy dobrać empirycznie), przykryć szkiełko 8-komorowe folią aluminiową i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  6. Przemyć studnie 400μl PBS (3x15 minut każdego płukania). Odessać PBS. Zamontować preparaty przy użyciu medium montażowego VECTASHIELD z DAPI. Suszyć szkiełka przez 40 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Szkiełka można przechowywać przez 1 tydzień w 4°C. Przechowywać szkiełka w ciemności. Wykonać obrazowanie szkiełek za pomocą mikroskopii konfokalnej.

4. Reprezentatywne wyniki:

Przykład analizy proliferacji uśpionych komórek nowotworowych D2.0R oraz przerzutowych komórek D2A1 w hodowli 3D przedstawiono na Ryc. 1A. Komórki D2.0R pozostają uśpione (w stanie spoczynku) przez cały 14-dniowy okres hodowli eksperymentalnej, podczas gdy silnie przerzutowe komórki D2A1 pozostają uśpione jedynie przez cztery do sześciu dni, po czym zaczynają proliferować. W początkowej fazie uśpienia wiele komórek w hodowli 3D pozostaje odosobnionych (Ryc. 1B; dzień 4), podczas gdy inne nieproliferujące komórki tworzą wielokomórkowe sferoidy. Przejście komórek D2A1 ze stanu uśpienia do stanu proliferacyjnego w hodowli 3D (Ryc. 1B; dzień 12) wiąże się z gwałtownymi zmianami w morfologii komórek. Zatem test ten może być wykorzystany do zbadania, jakie czynniki mogą skłonić uśpione komórki D2.0R do wyjścia ze stanu uśpienia oraz jakie czynniki mogą zapobiegać przejściu komórek D2A1 ze stanu uśpienia. Ryc. 2 przedstawia przykład związku zapobiegającego przejściu komórek D2A1 ze stanu uśpienia do stanu proliferacyjnego. Jak zilustrowano na Ryc. 2, traktowanie komórek D2A1 specyficznym inhibitorem kinazy lekkich łańcuchów miozyny (ML-7) pozwoliło utrzymać komórki D2A1 w stanie uśpienia.

Sygnalizację komórkową w uśpionych i proliferujących komórkach nowotworowych hodowanych w systemie 3D można badać za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego na cząsteczki sygnałowe. Jak pokazano na Rysunku 3, podczas przejścia komórek D2A1 ze stanu uśpienia (dni 1-4) do proliferacji (dzień 7) następuje znaczny wzrost fosforylacji lekkiego łańcucha miozyny (barwienie czerwone), po którym następuje reorganizacja filamentów f-aktyny, tworzących włókna stresowe aktyny (barwienie zielone). Jednakże zablokowanie aktywności kinazy lekkiego łańcucha miozyny w komórkach D2A1 za pomocą shRNA lub specyficznego leku (ML-7) utrzymuje komórki D2A1 w stanie uśpienia i skutkuje zahamowaniem fosforylacji lekkiego łańcucha miozyny oraz organizacji włókien stresowych f-aktyny (Rysunek 4).

figure-protocol-1
Rycina 1. Model in vitro do badania stanu uśpienia pojedynczych komórek nowotworowych oraz przejścia w wzrost przerzutowy. A) Proliferacja uśpionych komórek D2.0R i przerzutowych D2A1 w 3-D Cultrex BME, n=8 (średnia ± SE). Reprezentatywne wyniki trzech eksperymentów (* p≤0.05). B) Obrazy z mikroskopii świetlnej komórek D2.0R i D2A1 hodowanych w 3-D Cultrex BME, powiększenie x20. Rycina zmodyfikowana na podstawie Barkan et al 17.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Zapobieganie przejściu komórek D2A1 ze stanu uśpienia (spoczynku) do proliferacji w systemie hodowli 3D poprzez inhibicję kinazy lekkich łańcuchów miozyny (MLCK). Przebieg czasowy proliferacji komórek D2A1 hodowanych w 3-D Cultrex BME, n=8 (średnia ±SE). Komórki pozostały nieleczone (kontrola) lub były traktowane specyficznym inhibitorem MLCK (ML-7; 5 μM) przez 48 hr poczynając od 5. dnia hodowli. Rysunek zmodyfikowany na podstawie Barkan et al 17.

figure-protocol-3
Rycina 3. Fosforylacja lekkiego łańcucha miozyny, a następnie reorganizacja f-aktyny podczas przejścia komórek D2A1 ze stanu uśpienia do wzrostu proliferacyjnego. Komórki D2A1 hodowano w 3-D Cultrex BME na szkiełkach przedmiotowych z 8 komorami. Komórki utrwalono i zabarwiono DAPI (niebieski) w celu lokalizacji jąder, faloidyną (zielony) dla f-aktyny oraz przeciwciałem przeciwko fosforylowanej formie lekkiego łańcucha miozyny (MLC-p) (czerwony), jak wskazano w różnych punktach czasowych. Nałożenie barwień f-aktyny i MLC-p (żółty). Ekspresja MLC-p wzrosła podczas przejścia komórek D2A1 ze stanu uśpienia (dni 1-4) do wzrostu proliferacyjnego (dzień 7), po czym nastąpiło tworzenie włókien stresowych aktyny (strzałki). Mikroskopia konfokalna, powiększenie x63. Biały pasek odpowiada 20 microns. Rycina zmodyfikowana na podstawie Barkan et al 17.

figure-protocol-4
Rysunek 4. Hamowanie tworzenia włókien stresowych f-aktyny zapśredniczone przez kinazę lekkich łańcuchów miozyny (MLCK) w komórkach D2A1. Komórki D2A1 pozostawiono bez obróbki (kontrola), poddano działaniu inhibitora MLCK (ML-7; 5 μM) przez 48 hr począwszy od 5. dnia hodowli lub poddano transfekcji shRNA przeciwko MLCK bądź kontrolnym shRNA (scrambled), a następnie barwiono na obecność fosforylowanej formy lekkiego łańcucha miozyny (MLC-p) (czerwony), f-aktyny (zielony) oraz jąder komórkowych (niebieski). Nałożenie barwień f-aktyny i MLC-p (żółty). Mikroskopia konfokalna, powiększenie x63. Biały pasek odpowiada 20 mikronom.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mechanizmy odpowiedzialne za utrzymywanie rozproszonych komórek nowotworowych w stanie uśpienia lub prowadzące do ich przejścia w wzrost przerzutny pozostają w dużej mierze nieznane. Zjawisko to było niezwykle trudne do zbadania u pacjentów ludzkich 4,12, a opracowano niewiele modeli przedklinicznych pozwalających rozwiązać ten problem. Niemniej jednak scharakteryzowano niektóre systemy modelowe uśpienia nowotworów in vivo oraz ex-vivo (przegląd w 1,12). Jednak modele in vivo

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Niniejsze badania były częściowo finansowane z Programu Badań Wewnętrznych (Intramural Research Program) Narodowego Instytutu Nowotworów (National Cancer Institute).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM z wysoką zawartością glukozyInvitrogen11965-118
DMEM z niską zawartością glukozyInvitrogen11885-092
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Invitrogen10091-148
Ekstrakt z błony podstawnej Cultrex 3-D z obniżoną zawartością czynników wzrostuTrevigen Inc.Stężenie białka między 14-15mg/ml
Linie komórkowe D2.0R i D2A15,19
Komórki K7M2 i K7M2AS1.4620
Komórki raka piersi MCF-7 i MDA-MB-231ATCC
Szklany system szkiełek z 8 komoramiLab-Tek177402
Zestaw do badania proliferacji komórek Cell Titer 96 AQueous One SolutionPromega Corp.G3580
Medium montażowe VECTASHIELD z DAPIVector LaboratoriesH-1200
Normalna surowica osłaJackson ImmunoResearch017-000-121
Czytnik płytek ELISABio-TecPomiar przy 490nm
Mikroskop konfokalnyCarl Zeiss, Inc.Powiększenie x63

Bibliografia

  1. Aguirre-Ghiso, J. A. Models, mechanisms and clinical evidence for cancer dormancy. Nat Rev Cancer. 7, 834-846 (2007).
  2. Pantel, K., Woelfle, U. Micrometastasis in breast cancer and other solid tumors. J Biol Regul Homeost Agents. 18, 120-125 (2004).
  3. Naumov, G. N. Ineffectiveness of doxorubicin treatment on solitary dormant mammary carcinoma cells or late-developing metastases. Breast Cancer Res Treat. 82, 199-206 (2003).
  4. Klein, C. A. Framework models of tumor dormancy from patient-derived observations. Curr Opin Genet Dev. , (2010).
  5. Naumov, G. N. Persistence of solitary mammary carcinoma cells in a secondary site: a possible contributor to dormancy. Cancer Res. 62, 2162-2168 (2002).
  6. Townson, J. L., Chambers, A. F. Dormancy of solitary metastatic cells. Cell Cycle. 5, 1744-1750 (2006).
  7. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
  8. Pantel, K. Differential expression of proliferation-associated molecules in individual micrometastatic carcinoma cells. J Natl Cancer Inst. 85, 1419-1424 (1993).
  9. Demicheli, R. Tumour dormancy: findings and hypotheses from clinical research on breast cancer. Semin Cancer Biol. 11, 297-306 (2001).
  10. Braun, S. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N Engl J Med. 353, 793-802 (2005).
  11. Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. Cancer micrometastases. Nat Rev Clin Oncol. 6, 339-351 (2009).
  12. Goss, P. E., Chambers, A. F. Does tumour dormancy offer a therapeutic target. Nat Rev Cancer. 10, 871-877 (2010).
  13. Mendoza, A. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120, 2979-2988 (2010).
  14. Naumov, G. N. A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype. J Natl Cancer Inst. 98, 316-325 (2006).
  15. Barkan, D. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).
  16. Barkan, D., Green, J. E., Chambers, A. F. Extracellular matrix: A gatekeeper in the transition from dormancy to metastatic growth. Eur J Cancer. , (2010).
  17. Barkan, D. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. Cancer Res. 68, 6241-6250 (2008).
  18. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
  19. Morris, V. L. Mammary carcinoma cell lines of high and low metastatic potential differ not in extravasation but in subsequent migration and growth. Clin Exp Metastasis. 12, 357-367 (1994).
  20. Khanna, C. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med. 10, 182-186 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tr jwymiarowa hodowla kom reknawr t raka piersiekstrakt b ony podstawnejtest proliferacji kom reku pione kom rki nowotworoweprzerzutowe kom rki nowotworowelekki a cuch miozyny

Powiązane artykuły