Trójwymiarowy model rekonstrukcji ludzkiej skóry: narzędzie do badania normalnej skóry i progresji czerniaka

Summary

W tym raporcie opisujemy trójwymiarowy model rekonstrukcji skóry, który naśladuje ludzką skórę pod względem architektury i kompozycji. Badano fizjologię melanocytów, progresję czerniaka oraz losy komórek macierzystych skóry właściwej za pomocą modelu rekonstrukcji skóry. Model jest również przydatny jako narzędzie przedkliniczne do oceny leków.

Abstract

Większość badań in vitro w eksperymentalnej biologii skóry została przeprowadzona w dwuwymiarowych (2D) monokulturach, podczas gdy coraz więcej dowodów sugeruje, że komórki zachowują się inaczej, gdy są hodowane w trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej i również wchodzą w interakcje z innymi komórkami (1-5). Modele mysie są szeroko wykorzystywane do badania morfogenezy tkanek in vivo. Jednak skóra myszy i człowieka mają znaczące różnice w architekturze komórkowej i fizjologii, co utrudnia ekstrapolację badań na myszach na ludzi. Ponieważ melanocyty w skórze myszy są głównie zlokalizowane w mieszkach włosowych, mają one odmienne właściwości biologiczne od ludzkich, które znajdują się głównie w warstwie podstawnej naskórka. Niedawny rozwój modeli 3D rekonstrukcji ludzkiej skóry umożliwił badanie interakcji między macierzą komórkową a komórką oraz między różnymi typami komórek. Rekonstrukcje składają się z "skóry właściwej" z fibroblastami osadzonymi w macierzy kolagenu I, "naskórka", który składa się z warstwowych, zróżnicowanych keratynocytów i funkcjonalnej błony podstawnej, która oddziela naskórek od skóry właściwej. Kolagen zapewnia rusztowanie, dostarczanie składników odżywczych i potencjał interakcji między komórkami. Modele 3D skóry zawierające komórki melanocytowe podsumowują naturalne cechy homeostazy melanocytów i progresji czerniaka w ludzkiej skórze. Podobnie jak in vivo, melanocyty w zrekonstruowanej skórze są zlokalizowane na błonie podstawnej przeplatanej keratynocytami warstwy podstawnej. Komórki czerniaka wykazują te same cechy, które odzwierciedlają pierwotne stadium guza (RGP, VGP i przerzutowe komórki czerniaka) in vivo. Ostatnio zidentyfikowano komórki macierzyste skóry właściwej w ludzkiej skórze właściwej (6). Te silne komórki macierzyste mogą migrować do naskórka i różnicować się w melanocyty.

Protocol

1. Trójwymiarowy model rekonstrukcji ludzkiej skóry:

1. Przygotowanie warstwy bezkomórkowej: Wymieszaj następujące odczynniki w probówce o pojemności 50 ml na lodzie: 0,59 ml 10X EMEM, 50 μl 200 mM L-glutaminy, 0,6 ml FBS, 120 μl 7,5% wodorowęglanu sodu i 4,6 ml kolagenu bydlęcego I. Dodaj 1 ml mieszaniny do każdej wkładki tacek do hodowli tkankowych. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej i pozostawić żel do zestalenia się. Kolor mieszanki powinien być od słomkowo-żółtego do różowego.
2. Trypsynizuj ludzkie fibroblasty z kolb hodowlanych za pomocą 0,25% trypsyny / EDTA, dodaj DMEM zawierający 10% FBS w celu zneutralizowania. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić 0,45 x 10⁶ komórek w 1,5 ml DMEM z 10% FBS. W przypadku skórnych komórek macierzystych należy zebrać 6600 kulek skórnych (gdy skórne komórki macierzyste rosną w pożywce komórek macierzystych, tworzą kule w podobny sposób jak neurosfery), stukając w kolbę w celu odłączenia kulek, odwirowując.
3. Przygotowanie warstwy komórkowej: W 50 ml probówce na lodzie wymieszać: 1,65 ml 10X EMEM, 150 μl 200 mM L-glutaminy, 1,85 ml FBS, 350 μl 7,5% wodorowęglanu sodu, 14 ml kolagenu bydlęcego I i 1,5 ml zawiesiny fibroblastów z kroku 2 (alternatywnie należy użyć kombinacji 0,45 x 10⁶ fibroblastów i 6600 kulek skórnych w 1,5 ml podłoża do rekonstrukcji skóry I do rekonstrukcji komórek macierzystych skóry), Dobrze wymieszaj. Dodać 3 ml mieszaniny do każdej bezkomórkowej wkładki pokrytej warstwą. Inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych o stężeniu 5 % CO_{2 .} Kolor mieszanki powinien być od słomkowożółtego do różowego. Po zestaleniu się żelu dodać DMEM zawierający 10% FBS (2 ml wewnątrz i 10 ml na zewnątrz wkładki do każdej studzienki tacek do rekonstrukcji skóry). Inkubuj przez 4 dni i upewnij się, że żel się kurczy.
4. Odsysać pożywkę zarówno od wewnątrz, jak i na zewnątrz każdej wkładki. Dodaj pożywkę myjącą (HBSS z 1% dializowanym FBS) 2 ml do środka i 10 ml na zewnątrz wkładu, aby zmyć zwykłą surowicę. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
5. Przygotowanie podłoża do rekonstrukcji skóry:
   1. Do prawidłowej rekonstrukcji melanocytów i komórek macierzystych skóry: Aby przygotować pożywkę zasadową (500 ml), wymieszaj następujące odczynniki: 490 ml pożywki bez surowicy keratynocytów, 1,8 ml ekstraktu z przysadki bydlęcej, 10 ml dializowanej płodowej surowicy bydlęcej, 500 μl 10 μg/ml SCF, 562,5 μl 4 μg/ml bFGF i 500 μl 264 μg/ml ET-3. Pożywka I: Dodać 10 μl EGF o stężeniu 100 μg/ml do 100 ml podłoża zasadowego. Pożywka II: Dodaj 2 μl EGF do 100 ml podłoża zasadowego. Pożywka III: Dodać 720 μl CaCl₂ z 1 M do 300 ml pożywki zasadowej.
   2. Do rekonstrukcji skóry czerniaka: Aby uzyskać pożywkę I (100 ml), wymieszaj następujące odczynniki: 72,5 ml DMEM, 24 ml F12 (szynki), 2 ml L-glutaminy 200 mM, 200 μl hydrokortyzonu 269 μg/ml, 200 μl ITES 500X, 200 μl O-fosforyloetanoloaminy 0,05 M, 200 μl adeniny 90 mM, 200 μl progesteronu o stężeniu 2 nM, 240 μl CaCl₂ o stężeniu 1 M, 200 μl trijodotyroniny o stężeniu 10 nM i 100 μl surowicy cieląt nowonarodzonych po skaleczeniu (rozpuścić 3 g Chelex 100 w 100 ml surowicy, mieszać 1,5 godziny w temperaturze 4 °C, sterylizować przez filtr). Aby przygotować pożywkę II (100 ml), wymieszaj następujące odczynniki: 72,5 ml DMEM, 24 ml F12 (HAM), 2 ml L-glutaminy 200 mM, 200 μl hydrokortyzonu 269 μg/ml, 200 μl ITES 500X, 200 μl O-fosforyloetanoloaminy 0,05 M, 200 μl adeniny 90 mM, 200 μl progesteronu 2 nM, 240 μl CaCl2 o stężeniu 1 M, 200 μl trójjodotyroniny o stężeniu 10 nM i 100 μl surowicy nowonarodzonej cielętej. Aby przygotować pożywkę III (300 ml), wymieszaj następujące odczynniki: 142,5 ml DMEM, 142,5 ml F12 (HAM), 6 ml L-glutaminy 200 mM, 600 μl hydrokortyzonu 269 μg/ml, 600 μl ITES 500X, 600 μl O-fosforyloetanoloaminy 0,05 M, 600 μl adeniny 90 mM, 600 μl progesteronu 2 nM, 720 μl CaCl₂ z 1 M, 600 μl trójjodotyroniny 10 nM i 6 ml surowicy nowonarodzonej cielętej.
6. Trypsynizować ludzkie keratynocyty z kolb hodowlanych 0,05% trypsyny/EDTA, neutralizować trypsynę inhibitorem trypsyny sojowej (250 mg / L w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem), odwirować, ponownie zawiesić osad komórkowy w 4,17 x10⁶ komórek/ml w podłożu do rekonstrukcji skóry I.
7. Trypsynizować ludzkie melanocyty lub komórki czerniaka z kolb hodowlanych 0,05% trypsyny / EDTA, neutralizować trypsynę inhibitorem trypsyny sojowej, odwirować, ponownie zawiesić osad komórkowy w 0,83 x10⁶ komórek / ml w podłożu do rekonstrukcji skóry I.
8. Usuń płyn myjący zarówno z wewnątrz, jak i na zewnątrz każdego wkładu.
9. Dodaj pożywkę do rekonstrukcji skóry I (1,5 ml do środka i 10 ml na zewnątrz każdej wkładki).
10. Weź 600 μl zawiesiny komórkowej keratynocytów i 600 μl zawiesiny komórek melanocytów lub komórek czerniaka, dobrze wymieszaj. Dozować 200 μl zawiesiny z mieszanych komórek kropla po kropli do wnętrza każdej wkładki. Do rekonstrukcji komórek macierzystych skóry należy użyć tylko 100 μl zawiesiny keratynocytów. Inkubować przez 2 dni w temperaturze 37 °C.
11. Odessać medium do rekonstrukcji skóry I zarówno od wewnątrz, jak i na zewnątrz każdej wkładki. Dodaj pożywkę do rekonstrukcji skóry II (2 ml do środka i 10 ml na zewnątrz). Inkubować przez kolejne 2 dni w temperaturze 37 °C.
12. Odessać pożywkę do rekonstrukcji skóry II od wewnątrz i na zewnątrz każdej wkładki, dodać 7,5 ml pożywki do rekonstrukcji skóry III tylko na zewnątrz. Od tego momentu powierzchnia rekonstrukcji zaczyna być wystawiona na działanie powietrza. Zmieniaj podłoże III co drugi dzień aż do 18 dnia.
13. Rekonstrukcja skóry podczas zbiorów w 18 dniu:
    1. Zasysać media od wewnątrz i na zewnątrz wkładek.
    2. Wyjmij wkładki z tacki za pomocą kleszczyków.
    3. Wytnij rekonstrukcję (w tym filtr poliwęglanowy), kreśląc ostrzem skalpela okrąg blisko krawędzi.
    4. Przetnij rekonstrukcję i filtr na pół na twardej powierzchni.
14. W przypadku wycinków parafinowych: umieść połowę rekonstrukcji w kasecie histologicznej między 2 czarnymi bibułkami do biopsji TBS i namocz całą kasetę w 10% formalinie przez ponad 4 godziny. Następnie umieść kasetę w 70% etanolu i przechowuj ją w temperaturze 4 °C, aż będziesz gotowy do przetworzenia rekonstrukcji w celu zatopienia parafiny.
15. Dla sekcji mrożonych:
    1. Drugą połowę rekonstrukcji umieścić w 50% sacharozie w temperaturze 4 °C na 1-2 godziny, następnie zmienić sacharozę na 2 M i przechowywać w temperaturze 4 °C przez kolejne 1-2 godziny.
    2. Dozuj media do zamrażania o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) do jednorazowej formy podstawowej, tak aby wypełniła około 50% łodzi. Unikaj wszelkich pęcherzyków w OCT.
    3. Chwyć krawędź rekonstrukcji kleszczami i usuń rekonstrukcję z sacharozy. Umieść go na chusteczkach Kimwipes, aż chusteczki wchłoną sacharozę.
    4. Przenieś rekonstrukcję do formy bazowej na wierzchu OCT za pomocą kleszczy i szpatułki. Przykryj górną część rekonstrukcji większą ilością OCT, aż forma podstawowa będzie całkowicie pełna. Upewnij się, że w OCT nie ma żadnych pęcherzyków, które utrudnią cięcie.
    5. Umieść formę bazową równomiernie na pokruszonym suchym lodzie i pozwól OCT całkowicie zamarznąć.
    6. Zawiń formę bazową w folię aluminiową i przechowuj ją w temperaturze -70 °C, aż będziesz gotowy do cięcia kriostatem.
16. Przeprowadź rekonstrukcję skóry na myszy:
    1. Przygotuj probówkę sokoła o pojemności 50 ml z 5 ml DMEM (do zamrażania i rozmrażania skóry myszy).
    2. Użyj samicy myszy bezwłosej SCID niekrewniaczej około 6 tygodni.
    3. Mysz jest znieczulana izofluranem (system anestezjologiczny EZ): znieczulenie wstępne wykonuje się w komorze indukcyjnej 4% izofluranem (przed przeniesieniem myszy na łóżko chirurgiczne) i utrzymuje znieczulenie przez oddychacz nosa podczas zabiegu (izofluran: 1,5-2%). Wspomaganie cieplne przez podgrzewaną podkładkę, aby zapobiec hipotermii i sterylny lubrykant okulistyczny stosowany w celu zapobiegania uszkodzeniom oczu podczas znieczulenia.
    4. Wlej 600 ml wody do zlewki i pozostaw na płycie grzejnej, aby utrzymać temperaturę wody w zakresie 40 - 60 °C.
    5. Oczyść skórę myszy za pomocą złożonej nalewki benzoesowej i wacików nasączonych alkoholem.
    6. Zaznacz linię na górze pleców myszy, aby zachować tę samą pozycję do późniejszego szycia.
    7. Wytnij okrągłe łóżko z raną o średnicy około 1,2 cm w górnej części pleców myszy za pomocą nożyczek do tęczówki i kleszczy. Przykryj łożysko rany sterylnymi gąbkami z gazy. Umieść okrągłą skórę myszy w 5 ml DMEM, a następnie pozostaw w pojemniku z ciekłym azotem, aż całkowicie zamarznie. Rozmrozić rurkę w gorącej wodzie na płycie grzejnej, aż do całkowitego rozmrożenia. Powtórz 3 razy.
    8. Oderwij skórę rekonstrukcją od transwell za pomocą ostrza chirurgicznego i bardzo ostrożnie usuń membranę, przenieś rekonstrukcję skóry (naskórkiem do góry) na wierzch łożyska rany.
    9. Umieść skórę myszy (naskórkiem do góry) na wierzchu skóry i zrekonstruuj.
    10. Wykonaj pierwszy szew na wcześniej oznaczonym markerze, drugi na dole, a następnie dwa kolejne szwy po bokach, aby przymocować skórę myszy.
    11. Oczyść skórę myszy po szczepieniu. Zdejmij nos i trzymaj mysz na podgrzewanej podkładce, dopóki się nie obudzi i nie zacznie chodzić.
    12. Umieść mysz w nowej klatce.
    13. Analgezja pooperacyjna: Meloksykam (1 mg/kg) we wstrzyknięciu podskórnym bezpośrednio po zabiegu, 24 godziny i 48 godzin po zabiegu.

2. Reprezentatywne wyniki:

Skóra rekonstruuje się z normalnymi melanocytami i komórkami macierzystymi skóry
Rekonstrukcje skóry są hodowane w specjalnej 6-dołkowej tacce z wkładkami. Przedział skórny jest hodowany w DMEM z 10% FBS przez pierwsze cztery dni (ryc. 1A). Pożywka do rekonstrukcji skóry I jest używana, gdy keratynocyty są obsiane melanocytami lub komórkami czerniaka (ryc. 1B). Naskórek jest wystawiony na działanie powietrza w 9 dniu, co umożliwia różnicowanie keratynocytów (ryc. 1C). W 18 dniu naskórek skóry ulega rekonstrukcji złożonej z warstwowych warstw keratynocytów. Niezróżnicowana warstwa podstawowa i warstwy kolejno zróżnicowane są zorientowane pionowo (rys. 1D). Barwienie przekroju rekonstrukcji markerem melanocytowym S100 pokazuje, że melanocyty są ustawione w warstwie podstawnej naskórka i komunikują się z wieloma keratynocytami poprzez przedłużenia dendrytowe (ryc. 1E). Przedział skórny zawiera fibroblasty osadzone w matrycy kolagenu typu I. Zdeponowany kolagen IV wskazuje na błonę podstawną, która oddziela naskórek od skóry właściwej (ryc. 1F). Gdy skórne komórki macierzyste (znakowane wektorem lentiwirusowym GFP) są osadzone w fibroblastach w matrycy kolagenu I, migrują do naskórka i różnicują się w melanocyty (1), (ryc. 2). W naskórku powstaje wiele warstw keratynocytów.

Rekonstrukcje skóry guzów czerniaka
Badania kliniczno-patologiczne wskazują, że czerniaki postępują stopniowo: znamiona nabyte częste, znamiona dysplastyczne, czerniaki RGP (radialna faza wzrostu), czerniaki VGP (pionowa faza wzrostu) i czerniaki przerzutowe (7). Różne stadia linii komórkowych czerniaka są morfologicznie podobne do siebie w hodowli 2D (ryc. 3A-D), ale gdy są one włączane do rekonstrukcji skóry, zachowanie komórek odzwierciedla ich cechy in vivo. Lokalizacja i tempo wzrostu prawidłowych melanocytów są ściśle kontrolowane w rekonstrukcjach skóry (ryc. 3E). Czerniaki pierwotne RGP WM35 namnażają się głównie w naskórku (ryc. 3F), podczas gdy czerniaki VGP WM793 rosną inwazyjnie do skóry właściwej (ryc. 3G). Czerniaki z przerzutami 1205Lu agresywnie atakują w głąb skóry właściwej (ryc. 3H).

Rysunek 1. Skóra rekonstruuje się z normalnymi melanocytami. Ogólny wygląd rekonstrukcji skóry jest pokazany w A-C. A. Fibroblasty zmieszane z kolagenem są hodowane w DMEM zawierającym 10% FBS i tworzą kompartment skórny. B. Keratynocyty i melanocyty są wysiewane na wierzchu skóry właściwej i rosną w podłożu do odbudowy skóry. C. Naskórek jest wystawiony na działanie powietrza w 9 dniu. D. Rekonstrukcja skóry zabarwionej H&E przedstawia naskórek składający się z pionowej, zorientowanej warstwy podstawnej i sekwencyjnie zróżnicowanych warstw komórkowych. Skóra właściwa zawiera fibroblasty osadzone w matrycy kolagenu typu I. E. Melanocyty S100-dodatnie (czarne strzałki) są ustawione na błonie podstawnej i komunikują się z wieloma keratynocytami. F. Barwienie kolagenu dożylnie wskazuje na błonę podstawną, która oddziela naskórek od skóry właściwej. Wszystkie barwienia w D-F wykonano na skrawkach utrwalonych formaliną i zatopionych w parafinie.

Rysunek 2. Skórne komórki macierzyste w rekonstrukcji skóry migrują do naskórka i różnicują się w melanocyty. W 5 dniu po wysianiu keratynocytów pojedyncze komórki GFP-dodatnie (zielone) zaczynają migrować ze sfer. Naskórek nadal składa się z jednej warstwy. W 8 dniu kilka komórek dociera do granicy naskórka-skóra właściwa. Do 10 dnia komórki GFP-dodatnie są ściśle wyrównane w pozycji błony podstawnej. Migrowane komórki GFP-dodatnie w naskórku wyrażają marker melanocytowy HMB45 (czerwony, jak wskazują białe strzałki). Jądra są barwione DAPI (na niebiesko). Naskórek rozwija się jako wiele warstw. Błona podstawna jest oznaczona białymi przerywanymi liniami.

Rysunek 3. Rekonstrukcje skóry w różnych stadiach czerniaka: A-D. Normalne melanocyty i komórki czerniaka hodowane w kulturach 2D. A. Melanocyty z napletka. B. Ogniwa RGP WM35. C. Ogniwa VGP WM793. D. Przerzuty komórek czerniaka 1205Lu. E. Normalne melanocyty znajdują się na błonie podstawnej. F. Komórki czerniaka WM35 RGP rosną jako skupiska komórek w naskórku. G. Komórki czerniaka VGP WM793 wnikają do skóry właściwej przez błonę podstawną. H. Przerzuty czerniaka Komórki 1205Lu agresywnie atakują w głąb skóry właściwej.

Rozwiązywanie problemów

problem Rozwiązywanie problemów Mieszanina kolagenu nie krzepnie Kolor mieszanki kolagenowej powinien być słomkowo-żółty do różowego, w przeciwnym razie pH jest nieprawidłowe i kolagen może nie być żelowy. Jeśli kolor jest jasnożółty, kropla po kropli należy dodawać więcej wodorowęglanu sodu. Kolagen przedwcześnie wytrąca się w mieszance Trzymaj wszystkie składniki na lodzie, dopóki mieszanina kolagenu nie zostanie umieszczona na wkładce Skurczony kolagen nie jest równy (jedna strona jest grubsza niż druga) Skalibruj półkę inkubatora Naskórek składa się z mniej niż trzech warstw keratynocytów. Stosować niezróżnicowane keratynocyty w dolnych przejściach

Discussion

Opisaliśmy tworzenie rekonstrukcji skóry 3D z normalnymi ludzkimi melanocytami, komórkami macierzystymi skóry i komórkami czerniaka. Komórki melanocytowe hodowane w hodowli jednowarstwowej mają podobną morfologię (spłaszczone, wrzecionowate lub bardziej dendrytyczne) niezależnie od ich pochodzenia w stadium klinicznym. W przeciwieństwie do tego, skóra 3D rekonstruuje właściwości komórek czerniaka specyficzne dla danego etapu. Normalne ludzkie melanocyty znajdują się w błonach podstawnych między warstwą naskórka a warstwą skóry właściwej jako pojedyncze komórki. Pierwotne komórki czerniaka RGP rosną jako małe skupiska wzdłuż błony podstawnej, podczas gdy bardziej agresywne komórki czerniaka VGP rosną jako duże skupiska przebijające się przez błonę podstawną do skóry właściwej. Przerzutowe komórki czerniaka rosną we wszystkich kierunkach i wnikają głęboko w skórę właściwą jako pojedyncze komórki lub skupiska. Na tym modelu można przeprowadzić analizy ilościowe, mierząc głębokość inwazji i zakres proliferacji. Oprócz scharakteryzowania prawidłowych i złośliwych komórek melanocytowych, za pomocą modelu możemy bezpośrednio indukować różnicowanie komórek macierzystych skóry w dojrzałe melanocyty, które są domem dla warstwy podstawnej naskórka i ustanowić prawdziwą komunikację z keratynocytami poprzez regulację w górę E-kadheryny (6).

Za pomocą wektorów wirusowych jesteśmy w stanie aktywować lub dezaktywować funkcję genów, aby lepiej zrozumieć dynamikę i funkcjonalne znaczenie genów wyrażanych przez każdy typ komórek w rekonstrukcjach skóry, co zapowiada się na skuteczny model do badania nie tylko mechanizmów transformacji melanocytów, ale także progresji czerniaka (8). Długotrwała obserwacja fenotypów komórkowych stała się możliwa dzięki przeszczepianiu rekonstrukcji skóry zwierzętom z niedoborem odporności. Taka ludzka chimera skórno-mysia jest doskonałym narzędziem badawczym do badania czerniakomezy i przerzutów czerniaka.

Rekonstrukcje skóry mogą być również użyteczną platformą do oceny leków. Wiele leków, które eliminują komórki nowotworowe w warunkach hodowli 2D, często ma niewielki wpływ na zastosowania eksperymentalne i kliniczne. Jak widać w guzie in vivo , komórki czerniaka w hodowlach 3D są często oporne na leki, na które reagują komórki w hodowlach 2D, co sugeruje, że mikrośrodowisko moduluje szlaki sygnałowe w czerniaku. W celu pomyślnego odkrycia leku, model rekonstrukcji skóry 3D jest idealnym narzędziem przedklinicznym do przewidywania skutków związków in vivo (9,10).

Podsumowując, modele rekonstrukcji skóry wypełniają lukę między badaniami in vitro i in vivo . Pozwolą one lepiej zrozumieć, które geny biorą udział w transformacji i w jaki sposób komórki macierzyste przyczyniają się do tej transformacji.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x EMEM	BioWhittaker	12-684F
L-glutamina	GIBCO, firmy Life Technologies	25030-081
Płodowa surowica bydlęca	Hyclon	SH-30071.02
Kolagen ekstrahowany kwasem ze ścięgien bydlęcych	Organogeneza	200/50
Hodowla tkankowa 6-dołkowe tacki z wkładkami	Organogeneza	9285
Surowe surowice wolne od keratynocytów	GIBCO, firmy Life Technologies	17005042
Dializowana surowica cielęca	płodu Hyclon	SH-30079.03
rekombinowany czynnik ludzkich komórek macierzystych	Fitzgerald Industries	RDI-307-255X
Podstawowy FGF	Fitzgerald Industries	30R-AF015
Endothelin-3, ludzki	amerykański peptyd	88-5-10
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	C-7902
DMEM	JRH biosciences	56430-10L
F12 (SZYNKA' s)	GIBCO, firmy Life Technologies	11765-54
Hydrokortyzon	Sigma-Aldrich	H-0888
Insulina, transferyna, etanoloamina, selen (ITES)	BioWhittaker	17839Z
O-fosforyloetanoloamina	Sigma-Aldrich	P0503
Adenina	Sigma-Aldrich	A9795
Progesteron	Sigma-Aldrich	P-8783
Trijodotyronina	Sigma-Aldrich	T-5516
Surowica dla noworodków cieląt	Hyclon	SH3011802
10% bufor formalina	Surgipath	00600
Optymalna temperatura cięcia Zamrażanie mediów (OCT)	Sakura Finetek	4583
Multi kasety	Surgipath	02293-BX
Bibułki do biopsji TBS	Trójkątne nauki biomedyczne	Bibułki biopsyjne BP-B
TBS Triangle	Biomedical Sciences	BP-B
Jednorazowe formy bazowe	Fisher Scientific	15-182-501C
Złożona nalewka benzoesowa	Professional Outposables, Inc,	S42450
Waciki do przygotowania alkoholu	Apteka		CVS
Jedwabny pleciony 5-0	Ethicon Inc.	682G
(sterylne)	CVS Kleszcze apteczne
	Roboz Surgical Instruments Co.	RS5070
	Roboz Surgical Instruments Co.	RS5913
Ostrza chirurgiczne	Feather Safety Razor Co, Ltd.	2976
EZ anestezjologiczne	Euthanex Corp.
SCID bezwłosa mysz niekrewniacza	Charles River Laboratories