Trójwymiarowy model rekonstrukcji ludzkiej skóry: narzędzie do badania normalnej skóry i progresji czerniaka

Podsumowanie

W niniejszym raporcie opisujemy trójwymiarowy model rekonstrukcji skóry, który naśladuje architekturę i skład ludzkiej skóry. Wykorzystując model rekonstrukcji skóry, badano fizjologię melanocytów, progresję czerniaka oraz losy dermalnych komórek macierzystych. Model ten jest również przydatny jako narzędzie przedkliniczne do oceny leków.

Streszczenie

Większość badań in vitro w eksperymentalnej biologii skóry przeprowadzono w dwuwymiarowych (2D) monokulturach, podczas gdy narastające dowody sugerują, że komórki zachowują się inaczej, gdy są hodowane w trójwymiarowej (3D) macierzy zewnątrzkomórkowej i oddziałują z innymi komórkami (1-5). Modele mysie były szeroko wykorzystywane do badania morfogenezy tkanek in vivo. Jednak skóra myszy i człowieka wykazuje istotne różnice w architekturze komórkowej i fizjologii, co utrudnia ekstrapolację wyników badań na myszach na ludzi. Ponieważ melanocyty w skórze myszy są zlokalizowane głównie w mieszkach włosowych, posiadają one odmienne właściwości biologiczne niż melanocyty ludzkie, które znajdują się przede wszystkim w warstwie podstawnej naskórka. Niedawny rozwój modeli rekonstrukcji ludzkiej skóry 3D umożliwił badanie oddziaływań komórka-macierz oraz komórka-komórka pomiędzy różnymi typami komórek. Rekonstrukcje składają się z „ skóry właściwej” z fibroblastami osadzonymi w macierzy kolagenu I, „naskórka”, który składa się ze stratyfikowanych, zróżnicowanych keratynocytów oraz funkcjonalnej błony podstawnej, która oddziela naskórek od skóry właściwej. Kolagen zapewnia rusztowanie, dostarczanie składników odżywczych oraz potencjał do oddziaływań międzykomórkowych. Modele skóry 3D zawierające komórki melanocytarne odtwarzają naturalne cechy homeostazy melanocytów i progresji czerniaka w ludzkiej skórze. Podobnie jak in vivo, melanocyty w zrekonstruowanej skórze są zlokalizowane przy błonie podstawnej, przeplatając się z keratynocytami warstwy podstawnej. Komórki czerniaka wykazują te same cechy odzwierciedlające pierwotne stadium nowotworu (RGP, VGP i komórki czerniaka przerzutowego) in vivo. Niedawno w ludzkiej skórze właściwej zidentyfikowano dermalne komórki macierzyste (6). Te wielopotencjalne komórki macierzyste mogą migrować do naskórka i różnicować się w melanocyty.

Protokół

1. Trójwymiarowy model rekonstrukcji ludzkiej skóry:

1. Przygotowanie warstwy acelularnej: W probówce 50 mL na lodzie wymieszać następujące odczynniki: 0,59 mL 10X EMEM, 50 μl 200 mM L-glutaminy, 0,6 mL FBS, 120 μl 7,5% wodorowęglanu sodu oraz 4,6 mL kolagenu bydlęcego typu I. Do każdego wkładu w płytkach do hodowli tkankowej dodać 1 mL mieszaniny. Inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej, aż żel stężeje. Kolor mieszaniny powinien być od słomkowo-żółtego do różowego.
2. Fibroblasty ludzkie z kolb hodowlanych trypsynizować 0,25% trypsyną/EDTA, a następnie dodać DMEM zawierający 10% FBS w celu neutralizacji. Komórki zebrać przez wirowanie i resuspendować 0,45 x 10⁶ komórek w 1,5 mL DMEM z 10% FBS. W przypadku macierzystych komórek skóry właściwej zebrać 6600 sfery dermy (gdy macierzyste komórki skóry właściwej rosną w pożywce dla komórek macierzystych, tworzą sfery w sposób podobny do neurosfer) poprzez opukanie kolby w celu odczepienia sfer i wirowanie.
3. Przygotowanie warstwy komórkowej: W probówce 50 mL na lodzie wymieszać następujące składniki: 1,65 mL 10X EMEM, 150 μl 200 mM L-glutaminy, 1,85 mL FBS, 350 μl 7,5% wodorowęglanu sodu, 14 mL kolagenu bydlęcego typu I oraz 1,5 mL zawiesiny fibroblastów z kroku 2 (alternatywnie, w przypadku rekonstruktów z macierzystych komórek skóry właściwej, użyć kombinacji 0,45 x 10⁶ fibroblastów i 6600 sfery dermy w 1,5 mL pożywki do rekonstrukcji skóry I), dokładnie wymieszać. Do każdego wkładu pokrytego warstwą acelularną dodać 3 mL mieszaniny. Inkubować przez 45 min w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowej z 5 % CO₂. Kolor mieszaniny powinien być od słomkowo-żółtego do różowego. Po stężeniu żelu dodać DMEM zawierający 10% FBS (2 mL do wnętrza i 10 mL na zewnątrz wkładu w każdym dołku płytek do rekonstrukcji skóry). Inkubować przez 4 dni, upewniając się, że żel uległ kontrakcji.
4. Odssać pożywkę z wnętrza i z zewnątrz każdego wkładu. Dodać pożywkę płuczącą (HBSS z 1% dializowanego FBS) w ilości 2 mL do wnętrza i 10 mL na zewnątrz wkładu, aby wypłukać zwykłe serum. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
5. Przygotowanie pożywki do rekonstrukcji skóry:
   1. Dla rekonstruktów z normalnymi melanocytami i macierzystymi komórkami skóry właściwej: Aby przygotować pożywkę podstawową (500 mL), wymieszać następujące odczynniki: 490 mL bezserwatkowej pożywki dla keratynocytów, 1,8 mL ekstraktu z przysadki bydlęcej, 10 mL dializowanego płodowego surowicy bydlęcej, 500 μl SCF o stężeniu 10 μg/mL, 562,5 μl bFGF o stężeniu 4 μg/mL oraz 500 μl ET-3 o stężeniu 264 μg/mL. Pożywka I: Do 100 mL pożywki podstawowej dodać 10 μl EGF o stężeniu 100 μg/mL. Pożywka II: Do 100 mL pożywki podstawowej dodać 2 μl EGF. Pożywka III: Do 300 mL pożywki podstawowej dodać 720 μl 1 M CaCl₂.
   2. Dla rekonstrukcji skóry z czerniakiem: Aby przygotować Pożywkę I (100 mL), wymieszać następujące odczynniki: 72,5 mL DMEM, 24 mL F12 (HAM's), 2 mL 200 mM L-glutaminy, 200 μl hydrokortyzonu o stężeniu 269 μg/mL, 200 μl ITES 500X, 200 μl O-fosforyloetanolaminy 0,05 M, 200 μl adeniny 90 mM, 200 μl progesteronu 2 nM, 240 μl 1 M CaCl₂, 200 μl trijodotyroniny 10 nM oraz 100 μl surowicy z noworodka cielęcia oczyszczonej Chelexem (rozpuścić 3 g Chelex 100 w 100 mL surowicy, mieszać przez 1,5 godziny w 4 °C, wysterylizować przez filtrację). Aby przygotować Pożywkę II (100 mL), wymieszać następujące odczynniki: 72,5 mL DMEM, 24 mL F12 (HAM's), 2 mL 200 mM L-glutaminy, 200 μl hydrokortyzonu o stężeniu 269 μg/mL, 200 μl ITES 500X, 200 μl O-fosforyloetanolaminy 0,05 M, 200 μl adeniny 90 mM, 200 μl progesteronu 2 nM, 240 μl 1 M CaCl2, 200 μl trijodotyroniny 10 nM oraz 100 μl surowicy z noworodka cielęcia. Aby przygotować Pożywkę III (300 mL), wymieszać następujące odczynniki: 142,5 mL DMEM, 142,5 mL F12 (HAM's), 6 mL 200 mM L-glutaminy, 600 μl hydrokortyzonu o stężeniu 269 μg/mL, 600 μl ITES 500X, 600 μl O-fosforyloetanolaminy 0,05 M, 600 μl adeniny 90 mM, 600 μl progesteronu 2 nM, 720 μl 1 M CaCl₂, 600 μl trijodotyroniny 10 nM oraz 6 mL surowicy z noworodka cielęcia.
6. Keratynocyty ludzkie z kolb hodowlanych trypsynizować 0,05% trypsyną/EDTA, zneutralizować trypsynę inhibitorem trypsyny z soi (250 mg/L w 1x fosforanie buforze soli), odwirować, a osad komórkowy resuspendować w stężeniu 4,17 x10⁶ komórek/mL w pożywce do rekonstrukcji skóry I.
7. Melanocyty ludzkie lub komórki czerniaka z kolb hodowlanych trypsynizować 0,05% trypsyną/EDTA, zneutralizować trypsynę inhibitorem trypsyny z soi, odwirować, a osad komórkowy resuspendować w stężeniu 0,83 x10⁶ komórek/mL w pożywce do rekonstrukcji skóry I.
8. Usunąć pożywkę płuczącą z wnętrza i z zewnątrz każdego wkładu.
9. Dodać pożywkę do rekonstrukcji skóry I (1,5 mL do wnętrza i 10 mL na zewnątrz każdego wkładu).
10. Pobrać 600 μl zawiesiny komórek keratynocytów i 600 μl zawiesiny komórek melanocytów lub komórek czerniaka, dokładnie wymieszać. Do wnętrza każdego wkładu dozować po kropli 200 μl zmieszanej zawiesiny komórek. W przypadku rekonstruktów z macierzystych komórek skóry właściwej użyć tylko 100 μl zawiesiny keratynocytów. Inkubować przez 2 dni w temperaturze 37 °C.
11. Odssać pożywkę do rekonstrukcji skóry I z wnętrza i z zewnątrz każdego wkładu. Dodać pożywkę do rekonstrukcji skóry II (2 mL do wnętrza i 10 mL na zewnątrz). Inkubować przez kolejne 2 dni w temperaturze 37 °C.
12. Odssać pożywkę do rekonstrukcji skóry II z wnętrza i z zewnątrz każdego wkładu, dodać 7,5 mL pożywki do rekonstrukcji skóry III tylko na zewnątrz. Od tego momentu powierzchnia rekonstruktów zostaje wystawiona na działanie powietrza. Wymieniać pożywkę III co drugi dzień aż do 18. dnia.
13. Zebrać rekonstrukt skóry w 18. dniu:
    1. Odssać pożywki z wnętrza i z zewnątrz wkładów.
    2. Wyjąć wkłady z płytki za pomocą pęsety.
    3. Wyciąć rekonstrukt (wraz z filtrem poliwęglanowym), prowadząc ostrzem skalpela wzdłuż okręgu blisko krawędzi.
    4. Przeciąć rekonstrukt i filtr na pół na twardej powierzchni.
14. Dla skrawków parafiny: umieścić połowę rekonstruktu w kasecie histologicznej pomiędzy dwoma czarnymi papierami do biopsji TBS i namoczyć całą kasetę w 10% formalinie przez ponad 4 godziny. Następnie umieścić kasetę w 70% etanolu i przechowywać w 4 °C do momentu przygotowania rekonstruktu do zatopienia w parafinie.
15. Dla skrawków mrożonych:
    1. Umieścić drugą połowę rekonstruktu w 50% sacharozie w 4 °C na 1-2 godziny, następnie wymienić sacharozę na 2 M i przechowywać w 4 °C przez kolejne 1-2 godziny.
    2. Nalać medium do mrożenia OCT (optimal cutting temperature) do jednorazowej formy bazowej tak, aby wypełniło około 50% formy. Unikać powstawania pęcherzyków powietrza w OCT.
    3. Chwycić krawędź rekonstruktu pęsetą i wyjąć go z sacharozy. Umieścić na chusteczkach Kimwipes, aż wchłoną one sacharozę.
    4. Przenieść rekonstrukt do formy bazowej na wierzch OCT, używając pęsety i szpatułki. Przykryć wierzch rekonstruktu dodatkową ilością OCT, aż forma bazowa zostanie całkowicie wypełniona. Upewnić się, że w OCT nie ma pęcherzyków powietrza, które utrudniłyby cięcie.
    5. Umieścić formę bazową równo na kruszonym suchym lodzie i pozwolić OCT całkowicie zamarznąć.
    6. Zawinąć formę bazową w folię aluminiową i przechowywać w -70 °C do momentu cięcia w kriosztacie.
16. Przeszczepić rekonstrukt skóry na myszy:
    1. Przygotować probówkę Falcon 50 mL z 5 mL DMEM (do zamrażania i rozmrażania skóry myszy).
    2. Użyć samicy myszy SCID bezwłosej outbred o wieku około 6 tygodni.
    3. Myszy poddać znieczuleniu izofluranem (system znieczulania EZ): znieczulenie wstępne przeprowadzić w komorze indukcyjnej z 4% izofluranem (przed przeniesieniem myszy na stół chirurgiczny) i podtrzymać znieczulenie za pomocą maski nosowej podczas zabiegu (izofluran: 1,5-2%). Zapewnić wsparcie cieplne za pomocą podgrzewanej podkładki, aby zapobiec hipotermii, oraz zastosować sterylny lubrykant oftalmiczny, aby zapobiec urazom oczu podczas znieczulenia.
    4. Wlać 600 mL wody do zlewki i pozostawić na płycie grzejnej, aby utrzymać temperaturę wody między 40 a 60 °C.
    5. Oczyścić skórę myszy nalewką z benzoesanem i tamponami nasączonymi alkoholem.
    6. Zaznaczyć linię na grzbiecie myszy, aby zachować tę samą pozycję podczas późniejszego szycia.
    7. Wyciąć okrągłe łoże rany o średnicy około 1,2 cm na górnej części grzbietu myszy, używając nożyczek Iris i pęsety. Przykryć łoże rany sterylnymi gazy. Umieścić okrągły fragment skóry myszy w 5 mL DMEM, a następnie pozostawić w pojemniku z ciekłym azotem do całkowitego zamrożenia. Rozmrozić probówkę w gorącej wodzie na płycie grzejnej aż do całkowitego roztopienia. Powtórzyć 3 razy.
    8. Oddzielić rekonstrukt skóry od transwellu za pomocą skalpela i bardzo ostrożnie usunąć membranę, następnie przenieść rekonstrukt skóry (stroną naskórkową do góry) na łoże rany.
    9. Umieścić skórę myszy (stroną naskórkową do góry) na wierzchu rekonstruktu skóry.
    10. Wykonać pierwszy szew w miejscu wcześniej zaznaczonym, drugi na dole, a następnie dwa kolejne szwy po bokach, aby utrwalić skórę myszy.
    11. Oczyścić skórę myszy po przeszczepie. Zdjąć maskę nosową i pozostawić mysz na podgrzewanej podkładce do momentu przebudzenia i odzyskania zdolności poruszania się.
    12. Przenieść mysz do nowej klatki.
    13. Analgezja pooperacyjna: Meloksykam (1 mg/kg) poprzez wstrzyknięcie podskórne natychmiast po operacji, 24 godziny oraz 48 godzin po operacji.

2. Reprezentatywne wyniki:

Rekonstrukcje skóry z normalnymi melanocytami i dermalnymi komórkami macierzystymi
Rekonstrukcje skóry hoduje się w specjalnej płytce 6-dołkowej z wkładkami. Przedział dermalny jest hodowany w DMEM z 10% FBS przez pierwsze cztery dni (Rys. 1A). Pożywkę do rekonstrukcji skóry I stosuje się, gdy keratynocyty są zasiewane wraz z melanocytami lub komórkami czerniaka (Rys. 1B). W 9. dniu naskórek zostaje wystawiony na działanie powietrza, co umożliwia różnicowanie się keratynocytów (Rys. 1C). W 18. dniu naskórek rekonstrukcji skóry składa się z warstwowych struktur keratynocytów. Niedoróżnicowana warstwa podstawna oraz kolejno różnicujące się warstwy są zorientowane pionowo (Rys. 1D). Barwienie przekroju rekonstrukcji markerem melanocytarnym S100 pokazuje, że melanocyty znajdują się w warstwie podstawnej naskórka i komunikują się z wieloma keratynocytami poprzez wypustki dendrytyczne (Rys. 1E). Przedział dermalny zawiera fibroblasty zatopione w macierzy kolagenu typu I. Zdeponowany kolagen IV wskazuje błonę podstawną, która oddziela naskórek od skóry właściwej (Rys. 1F). Gdy dermalne komórki macierzyste (oznaczone lentiwirusowym wektorem GFP) zostaną zatopione wraz z fibroblastami w macierzy kolagenu I, migrują one do naskórka i różnicują się w melanocyty (1), (Rys. 2). W naskórku rozwija się wiele warstw keratynocytów.

Rekonstrukcje skóry z guzami czerniaka
Badania kliniczno-patologiczne wskazują, że czerniaki postępują etapowo: od powszechnych nabytych znamion, poprzez znamiona dysplastyczne, czerniaki w fazie wzrostu radialnego (RGP), czerniaki w fazie wzrostu pionowego (VGP), aż po czerniaki przerzutowe (7). Różne stadia linii komórkowych czerniaka są do siebie morfologicznie podobne w hodowli 2-D (Ryc. 3A-D), jednak po wbudowaniu ich w rekonstrukcje skóry zachowanie komórek odzwierciedla ich charakterystykę in vivo. Lokalizacja i szybkość wzrostu prawidłowych melanocytów są ściśle kontrolowane w rekonstrukcjach skóry (Ryc. 3E). Pierwotne czerniaki RGP WM35 proliferują głównie w naskórku (Ryc. 3F), podczas gdy czerniaki VGP WM793 rosną inwazyjnie w głąb skóry właściwej (Ryc. 3G). Przerzutowe czerniaki 1205Lu agresywnie naciekają głęboko do skóry właściwej (Ryc. 3H).

Rysunek 1. Rekonstrukcje skóry z normalnymi melanocytami. Ogólny wygląd rekonstrukcji skóry przedstawiono w punktach A-C. A. Fibroblasty zmieszane z kolagenem są hodowane w DMEM zawierającym 10% FBS i tworzą przedział skórny. B. Keratynocyty i melanocyty są wysiewane na wierzch skóry właściwej i rosną w pożywce do rekonstrukcji skóry. C. Naskórek zostaje wystawiony na działanie powietrza w 9. dniu. D. Rekonstrukcja skóry barwiona H&E wykazuje naskórek składający się z pionowo zorientowanej warstwy podstawnej oraz sekwencyjnie zróżnicowanych warstw komórek nabłonkowych. Skóra właściwa zawiera fibroblasty zatopione w macierzy z kolagenu typu I. E. Melanocyty S100-dodatnie (czarne strzałki) są rozmieszczone wzdłuż błony podstawnej i komunikują się z wieloma keratynocytami. F. Barwienie na kolagen IV wskazuje błonę podstawną, która oddziela naskórek od skóry właściwej. Wszystkie barwienia w punktach D-F wykonano na przekrojach utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie.

Rysunek 2. Komórki macierzyste skóry właściwej w rekonstruktach skórnych migrują do naskórka i różnicują się w melanocyty. W 5. dniu po wysianiu keratynocytów pojedyncze komórki GFP-dodatnie (zielone) zaczynają migrować poza sfery. Naskórek składa się wciąż z pojedynczej warstwy. W 8. dniu kilka komórek dociera do granicy naskórka i skóry właściwej. Do 10. dnia komórki GFP-dodatnie ściśle ustawiają się w pozycji błony podstawnej. Zmigrowane do naskórka komórki GFP-dodatnie wykazują ekspresję markera melanocytarnego HMB45 (czerwony, wskazany białymi strzałkami). Jądra komórkowe są barwione DAPI (niebieski). Naskórek rozwija się w wiele warstw. Błonę podstawną oznaczono białymi liniami przerywanymi.

Rysunek 3. Rekonstrukcje skóry na różnych etapach czerniaka: A-D. Normalne melanocyty i komórki czerniaka hodowane w kulturach 2D. A. Melanocyty ze skóry napletka. B. Komórki RGP WM35. C. Komórki VGP WM793. D. Komórki przerzutowego czerniaka 1205Lu. E. Normalne melanocyty znajdują się w błonie podstawnej. F. Komórki czerniaka RGP WM35 rosną w postaci skupisk komórkowych w naskórku. G. Komórki czerniaka VGP WM793 naciekają do skóry właściwej przez błonę podstawną. H. Komórki przerzutowego czerniaka 1205Lu agresywnie naciekają głęboko do skóry właściwej.

Rozwiązywanie problemów

Problem	Rozwiązywanie problemów
Mieszanina kolagenu nie krzepnie	Kolor mieszaniny kolagenu powinien być słomkowo-żółty do różowego; w przeciwnym razie pH jest niewłaściwe i kolagen może nie utworzyć żelu. Jeśli kolor jest jaskrawożółty, należy kroplami dodać więcej wodorowęglanu sodu.
Kolagen przedwcześnie wytrąca się w mieszaninie	Wszystkie składniki należy przechowywać w lodzie do momentu umieszczenia mieszaniny kolagenu na wkładce
Skurczony kolagen nie jest jednorodny (jedna strona jest grubsza od drugiej)	Należy skalibrować półkę inkubatora
Naskórek tworzy mniej niż trzy warstwy keratynocytów.	Należy użyć niezróżnicowanych keratynocytów z niskich pasaży

Dyskusja

Opisano proces tworzenia trójwymiarowych (3D) rekonstruktów skóry z wykorzystaniem prawidłowych ludzkich melanocytów, dermalnych komórek macierzystych oraz komórek czerniaka. W hodowlach monowarstwowych komórki melanocytarne wykazują podobną morfologię (spłaszczoną, wrzecionowatą lub bardziej dendrytyczną), niezależnie od ich pochodzenia czy stadium klinicznego. W przeciwieństwie do tego, rekonstrukty skóry 3D odwzorowują właściwości komórek czerniaka charakterystyczne dla poszczególnych stadiów. Prawidłowe ludzkie melanocyty występują jako pojedyncze komórki w błonach podstawnych pomiędzy warstwą naskórka a skórą właściwą. Pierwotne komórki czerniaka RGP rosną w formie małych skupisk wzdłuż błony podstawnej, podczas gdy bardziej agresywne komórki czerniaka VGP tworzą duże skupiska przebijające się przez błonę podstawną do skóry właściwej. Komórki czerniaka przerzutowego rosną we wszystkich kierunkach i naciekają głęboko do skóry właściwej jako pojedyncze komórki lub skupiska. W tym modelu można przeprowadzić analizy ilościowe, mierząc głębokość nacieku oraz stopień proliferacji. Oprócz charakteryzacji prawidłowych i nowotworowych komórek melanocytarnych, przy użyciu tego modelu możemy bezpośrednio indukować różnicowanie dermalnych komórek macierzystych w dojrzałe melanocyty, które migrują do warstwy podstawnej naskórka i nawiązują bona fide komunikację z keratynocytami poprzez upregulację E-kadheryny (6).

Dzięki zastosowaniu wektorów wirusowych jesteśmy w stanie aktywować lub inaktywować funkcję genów, co pozwala na lepsze zrozumienie dynamiki i znaczenia funkcjonalnego genów eksprymowanych przez poszczególne typy komórek w rekonstruktach skóry. Stanowi to obiecujący i wydajny model do badania nie tylko mechanizmów transformacji melanocytów, ale również progresji czerniaka (8). Długoterminowa obserwacja fenotypów komórkowych stała się możliwa dzięki przeszczepianiu rekonstruktów skóry zwierzętom z niedoborem odporności. Taka chimera skóry ludzkiej i myszy jest doskonałym narzędziem badawczym do analizy melanomogenezy oraz przerzutowania czerniaka.

Rekonstrukcje skóry mogą być również użyteczną platformą do oceny leków. Wiele leków, które eliminują komórki nowotworowe w warunkach hodowli 2D, często wykazuje niewielki efekt w zastosowaniach eksperymentalnych i klinicznych. Podobnie jak w guzie in vivo, komórki czerniaka w hodowlach 3D są często oporne na leki, na które reagują komórki w hodowlach 2D, co sugeruje, że mikrośrodowisko moduluje szlaki sygnalizacyjne w czerniaku. W celu skutecznego odkrywania leków model 3D rekonstrukcji skóry stanowi idealne narzędzie przedkliniczne do przewidywania działania związków in vivo (9,10).

Podsumowując, modele rekonstrukcji skóry stanowią pomost między badaniami in vitro a in vivo. Pozwolą one na lepsze zrozumienie tego, które geny biorą udział w transformacji oraz w jaki sposób komórki macierzyste przyczyniają się do tego procesu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10x EMEM	BioWhittaker	12-684F
L-glutamina	GIBCO, by Life Technologies	25030-081
Płodowa surowica bydlęca	Hyclone	SH-30071.02
Kwasowo ekstrahowany kolagen z bydlęcych ścięgien	Organogeneza	200/50
Płytki do hodowli tkankowych 6-dołkowe z wkładkami	Organogeneza	9285
Bezwiernikowe pożywka dla keratynocytów (Keratinocyte Serum Free Medium)	GIBCO, by Life Technologies	17005042
Dializowana surowica z płodu cielęcego	Hyclone	SH-30079.03
rekombinowany czynnik wzrostu komórek macierzystych człowieka	Fitzgerald Industries	RDI-307-255X
Podstawowy FGF	Fitzgerald Industries	30R-AF015
Endotelina-3, ludzka	American Peptide	88-5-10
chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	C-7902
DMEM	JRH biosciences	56430-10L
F12 (HAM’s)	GIBCO, by Life Technologies	11765-54
Hydrokortyzon	Sigma-Aldrich	H-0888
Insulina, transferyna, etanolamina, selen (ITES)	BioWhittaker	17839Z
O-fosforyloetanoloamina	Sigma-Aldrich	P0503
Adenina	Sigma-Aldrich	A9795
Progesteron	Sigma-Aldrich	P-8783
Trijodotyronina	Sigma-Aldrich	T-5516
Surowica z noworodków cieląt	Hyclone	SH3011802
10% buforowana formalina	Surgipath	00600
optymalne medium do mrożenia w temperaturze cięcia (OCT)	Sakura Finetek	4583
Wielokasetowe	Surgipath	02293-BX
dokumentacja z biopsji TBS	Triangle Biomedical Sciences	BP-B
artykuły dotyczące biopsji TBS	Triangle Biomedical Sciences	BP-B
Jednorazowe formy podstawowe	Fisher Scientific	15-182-501C
Nalewka z benzoesanem złożonym	Professional Disposables, Inc,	S42450
gaziki nasączone alkoholem	apteka CVS
Pleciona jedwabna nić chirurgiczna, czarna, 5-0	Ethicon Inc.	682G
Gazy chirurgiczne (sterylne)	apteka CVS
Pinceta	Roboz Surgical Instruments Co.	RS5070
Nożyczki irydologiczne	Roboz Surgical Instruments Co.	RS5913
Skalpele chirurgiczne	Feather Safety Razor Co, Ltd.	2976
znieczulenie EZ	Euthanex Corp.
mysz SCID hairless outbred	Charles River Laboratories