W niniejszym raporcie opisujemy trójwymiarowy model rekonstrukcji skóry, który naśladuje architekturę i skład ludzkiej skóry. Wykorzystując model rekonstrukcji skóry, badano fizjologię melanocytów, progresję czerniaka oraz losy dermalnych komórek macierzystych. Model ten jest również przydatny jako narzędzie przedkliniczne do oceny leków.
Artykuł metodologiczny
Trójwymiarowy model rekonstrukcji ludzkiej skóry: narzędzie do badania normalnej skóry i progresji czerniaka
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Większość badań in vitro w eksperymentalnej biologii skóry przeprowadzono w dwuwymiarowych (2D) monokulturach, podczas gdy narastające dowody sugerują, że komórki zachowują się inaczej, gdy są hodowane w trójwymiarowej (3D) macierzy zewnątrzkomórkowej i oddziałują z innymi komórkami (1-5). Modele mysie były szeroko wykorzystywane do badania morfogenezy tkanek in vivo. Jednak skóra myszy i człowieka wykazuje istotne różnice w architekturze komórkowej i fizjologii, co utrudnia ekstrapolację wyników badań na myszach na ludzi. Ponieważ melanocyty w skórze myszy są zlokalizowane głównie w mieszkach włosowych, posiadają one odmienne właściwości biologiczne niż melanocyty ludzkie, które znajdują się przede wszystkim w warstwie podstawnej naskórka. Niedawny rozwój modeli rekonstrukcji ludzkiej skóry 3D umożliwił badanie oddziaływań komórka-macierz oraz komórka-komórka pomiędzy różnymi typami komórek. Rekonstrukcje składają się z „ skóry właściwej” z fibroblastami osadzonymi w macierzy kolagenu I, „naskórka”, który składa się ze stratyfikowanych, zróżnicowanych keratynocytów oraz funkcjonalnej błony podstawnej, która oddziela naskórek od skóry właściwej. Kolagen zapewnia rusztowanie, dostarczanie składników odżywczych oraz potencjał do oddziaływań międzykomórkowych. Modele skóry 3D zawierające komórki melanocytarne odtwarzają naturalne cechy homeostazy melanocytów i progresji czerniaka w ludzkiej skórze. Podobnie jak in vivo, melanocyty w zrekonstruowanej skórze są zlokalizowane przy błonie podstawnej, przeplatając się z keratynocytami warstwy podstawnej. Komórki czerniaka wykazują te same cechy odzwierciedlające pierwotne stadium nowotworu (RGP, VGP i komórki czerniaka przerzutowego) in vivo. Niedawno w ludzkiej skórze właściwej zidentyfikowano dermalne komórki macierzyste (6). Te wielopotencjalne komórki macierzyste mogą migrować do naskórka i różnicować się w melanocyty.
Protokół
1. Trójwymiarowy model rekonstrukcji ludzkiej skóry:
- Przygotowanie warstwy abezylowej: W probówce o pojemności 50 ml, w warunkach chłodzenia na lodzie, wymieszać następujące odczynniki: 0,59 ml 10X EMEM, 50 μl 200 mM L-glutaminy, 0,6 ml FBS, 120 μl 7,5% wodorowęglanu sodu i 4,6 ml kolagenu bydlęcego typu I. Do każdego insertu w taczkach do hodowli tkankowej należy dodać 1 ml mieszaniny. Inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej, aż żel stężeje. Kolor mieszaniny powinien być od słomkowo-żółtego do różowego.
- Poddać ludzkie fibroblasty z kolb hodowlanych trypsynizacji przy użyciu 0,25% trypsyny/EDTA, a następnie dodać DMEM zawierający 10% FBS w celu neutralizacji. Zebrać komórki poprzez wirowanie i resuspendować 0,45 x 106 komórki w 1,5 ml DMEM z 10% FBS. W przypadku dermalnych komórek macierzystych należy zebrać 6600 sfer dermalnych (podczas wzrostu w medium dla komórek macierzystych, dermalne komórki macierzyste tworzą sfery w sposób analogiczny do neurosfer), opukując kolbę w celu odłączenia sfer, a następnie przeprowadzając wirowanie.
- Przygotowanie warstwy komórkowej: W probówce o pojemności 50 mL, w warunkach chłodzenia w lodzie, wymieszać następujące składniki: 1,65 mL 10X EMEM, 150 μl 200 mM L-glutaminy, 1,85 ml FBS, 350 μl 7,5% wodorowęglanu sodu, 14 ml kolagenu bydlęcego typu I oraz 1,5 ml zawiesiny fibroblastów z kroku 2 (alternatywnie należy użyć kombinacji 0,45 x 106 fibroblasty oraz 6600 sfer dermalnych w 1,5 ml pożywki do rekonstrukcji skóry I (dla rekonstruktów dermalnych komórek macierzystych), wymieszać dokładnie. Do każdego insertu pokrytego warstwą acellularną dodać 3 ml mieszaniny. Inkubować przez 45 min w temperaturze 37 °C w 5% CO22 inkubator do hodowli tkankowych. Kolor mieszaniny powinien zmieniać się od słomkowożółtego do różowego. Po zestaleniu się żelu dodać DMEM zawierający 10% FBS (2 ml do wnętrza i 10 ml na zewnątrz insertu w każdym dołku tacek do rekonstrukcji skóry). Inkubować przez 4 dni, upewniając się, że żel uległ kontrakcji.
- Odssać medium z wnętrza i z zewnątrz każdego wkładu. W celu wypłukania standardowej surowicy dodać medium piorące (HBSS z 1% dializowanym FBS) w ilości 2 ml do wnętrza oraz 10 ml na zewnątrz wkładu. Inkubować przez 1 godzinę w 37 °C.
- Przygotowanie pożywki do rekonstrukcji skóry:
- W przypadku rekonstruktów normalnych melanocytów i dermalnych komórek macierzystych: aby przygotować pożywkę podstawową (500 ml), należy zmieszać następujące odczynniki: 490 ml bezzbiłkowej pożywki dla keratynocytów, 1,8 ml ekstraktu z przysadki bydlęcej, 10 ml dializowanej płodowej surowicy bydlęcej, 500 μl z 10 μg/mL SCF, 562.5 μl z 4 μg/mL bFGF i 500 μl z 264 μg/mL ET-3. Pożywka I: Dodaj 10 μl EGF z 100 μg/mL do 100 ml pożywki zasadowej. Pożywka II: Dodać 2 μl EGF do 100 mL pożywki podstawowej. Pożywka III: Dodać 720 μl CaCl₂2 od 1 M do 300 ml pożywki podstawowej.
- Do rekonstrukcji skóry z czerniakiem: Aby przygotować Medium I (100 ml), zmieszać następujące odczynniki: 72,5 ml DMEM, 24 ml F12 (HAM's), 2 ml L-glutaminy o stężeniu 200 mM, 200 μl hydrokortyzonu 269 μg/mL, 200 μl obiektyw 500X, 200 μl 0,05 M O-fosforyloetanoloaminy, 200 μl adeniny o stężeniu 90 mM, 200 μl progesteron w stężeniu 2 nM, 240 μl CaCl22 o stężeniu 1 M, 200 μl trijodotyronina w stężeniu 10 nM oraz 100 μl surowicy z noworodków cieląt oczyszczonej Chelexem (rozpuścić 3 g Chelex 100 w 100 ml surowicy, mieszać przez 1,5 godziny w temperaturze 4 °C, wysterylizować przez filtr). Aby przygotować Medium II (100 ml), zmieszać następujące odczynniki: 72,5 ml DMEM, 24 ml F12 (HAM's), 2 ml L-glutaminy o stężeniu 200 mM, 200 μl hydrokortyzonu 269 μg/mL, 200 μl obiektywy 500X, 200 μl 0,05 M O-fosforyloetanolaminy, 200 μl adeninę o stężeniu 90 mM, 200 μl progesteron w stężeniu 2 nM, 240 μl 1 M CaCl2, 200 μl trijodotyronina w stężeniu 10 nM i 100 μl surowica z noworodka cielęcia. Aby przygotować Medium III (300 ml), należy zmieszać następujące odczynniki: 142,5 ml DMEM, 142,5 ml F12 (HAM's) oraz 6 ml L-glutaminy o stężeniu 200 mM, 600 μl hydrokortyzonu 269 μg/mL, 600 μl obiektywy 500X, 600 μl 0,05 M O-fosforyloetanoloaminy, 600 μl adeniny o stężeniu 90 mM, 600 μl progesteron w stężeniu 2 nM, 720 μl CaCl22 o stężeniu 1 M, 600 μl Trijodotyronina w stężeniu 10 nM oraz 6 ml surowicy z noworodka cielęcia.
- Potraktuj ludzkie keratynocyty z kolb hodowlanych 0,05% trypsyną/EDTA, zneutralizuj trypsynę za pomocą inhibitora trypsyny z soi (250 mg/L w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem), odwiruj, a następnie resuspenduj pellet komórkowy do stężenia 4,17 x 106 komórek/ml w medium do rekonstrukcji skóry I.
- Poddać trypsynizacji ludzkie melanocyty lub komórki czerniaka z kolb hodowlanych przy użyciu 0,05% trypsyny/EDTA, zneutralizować trypsynę za pomocą inhibitora trypsyny z soi, odwirować, a następnie zawiesić osad komórkowy w stężeniu 0,83 x 106 komórek/ml w medium do rekonstrukcji skóry I.
- Usuń medium piorące z wnętrza i z zewnętrznej strony każdego insertu.
- Dodać pożywkę do rekonstrukcji skóry I (1,5 ml do wnętrza i 10 ml na zewnątrz każdego insertu).
- Pobierz 600 μl suspensja komórkowa keratynocytów i 600 μl zawiesina komórkowa melanocytów lub komórek czerniaka, wymieszać dokładnie. Rozdzielić 200 μl mieszaninę zawiesiny komórkowej kropla po kropli do wnętrza każdego wkładu. Do rekonstrukcji komórek macierzystych skóry należy użyć 100 μl wyłącznie zawiesiny keratynocytów. Inkubować przez 2 dni w 37 °C.
- Odssać pożywkę do rekonstrukcji skóry I z wnętrza i z zewnątrz każdego wkładu. Dodać pożywkę do rekonstrukcji skóry II (2 ml do wnętrza i 10 ml na zewnątrz). Inkubować przez kolejne 2 dni w 37 °C.
- Odssać podłoże do rekonstrukcji skóry II (skin reconstruct medium II) z wnętrza i z zewnętrznej strony każdego insertu, a następnie dodać 7,5 ml podłoża do rekonstrukcji skóry III (skin reconstruct medium III) wyłącznie na stronę zewnętrzną. Od tego momentu powierzchnia rekonstruktów zostaje wystawiona na działanie powietrza. Wymieniać podłoże III co drugi dzień aż do 18. dnia.
- Pobranie zrekonstruowanej skóry w 18. dniu:
- Odssać pożywkę z wnętrza i z zewnątrz insertów.
- Za pomocą pęsety wyjmij wkłady z tacki.
- Wytnij rekonstrukcję (łącznie z filtrem poliwęglanowym), prowadząc ostrzem skalpela po okręgu blisko krawędzi.
- Przetnij rekonstrukt oraz filtr na pół na twardej powierzchni.
- W przypadku skrawków parafinowych: połowę rekonstruktu należy umieścić w kasecie histologicznej pomiędzy dwoma czarnymi papierami do biopsji TBS, a następnie zanurzyć całą kasetę w 10% formalinie na ponad 4 godziny. Następnie kasetę należy umieścić w 70% etanolu i przechowywać w 4 °C do momentu rozpoczęcia procesu rekonstrukcji do zatapiania w parafinie.
- W przypadku skrawków mrożonych:
- Umieść drugą połowę rekonstruktu w 50% sacharozie w temperaturze 4 °C przez 1–2 godziny, następnie zmienić stężenie sacharozy na 2M i przechowywać w 4 °C przez kolejne 1-2 godziny.
- Nalej medium do mrożenia OCT (optimal cutting temperature) do jednorazowej formy podstawowej tak, aby wypełniło ono około 50% objętości formy. Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza w medium OCT.
- Chwyć krawędź rekonstruktu pęsetą i wyjmij go z sacharozy. Połóż go na ręcznikach Kimwipes, aż wchłoną one sacharozę.
- Przenieś rekonstrukcję do formy podstawowej na wierzch OCT, używając pęsety i szpatułki. Przykryj górną część rekonstrukcji kolejną warstwą OCT, aż forma podstawowa zostanie całkowicie wypełniona. Upewnij się, że w OCT nie ma pęcherzyków powietrza, które utrudniłyby cięcie.
- Umieść formę podstawową równomiernie na kruszonym suchym lodzie i poczekaj do całkowitego zamrożenia OCT.
- Owiń formę bazową folią aluminiową i przechowuj w temperaturze -70 °C do momentu przygotowania do cięcia w kriostacie.
- Przeszczep rekonstrukcyjny skóry u myszy:
- Przygotować probówkę typu Falcon o pojemności 50 ml z 5 ml pożywki DMEM (do zamrażania i rozmrażania skóry mysiej).
- Należy użyć samicy bezwłosej myszy outbred SCID w wieku około 6 tygodni.
- Myszy poddaje się znieczuleniu izofluranem (system EZ anesthesia): znieczulenie wstępne przeprowadza się w komorze indukcyjnej z użyciem 4% izofluranu (przed przeniesieniem myszy na stół operacyjny), a następnie utrzymuje znieczulenie za pomocą maski nosowej podczas procedury (izofluran: 1,5–2%). W celu zapobiegania hipotermii stosuje się ogrzewanie za pomocą podkładki grzewczej, a aby uniknąć uszkodzeń gałek ocznych podczas znieczulenia, aplikuje się sterylny lubrykant oftalmiczny.
- Wlać 600 ml wody do zlewki i pozostawić na płycie grzejnej, aby utrzymać temperaturę wody w zakresie 40 - 60 °C.
- Oczyścić skórę myszy za pomocą nalewki z benzoesanu i gazików nasączonych alkoholem.
- Zaznacz linię na grzbiecie myszy, aby zachować tę samą pozycję podczas późniejszego szycia.
- Za pomocą nożyczek Iris i pęsety wyciąć na górnej części grzbietu myszy okrągły obszar rany o średnicy około 1,2 cm. Obszar rany przykryć sterylnymi gazykami. Wycięty okrągły fragment skóry mysiej umieścić w 5 ml DMEM, a następnie pozostawić w pojemniku z ciekłym azotem do całkowitego zamrożenia. Probówkę rozmrozić w gorącej wodzie na płytce grzejnej aż do całkowitego rozmarznięcia. Procedurę powtórzyć 3 razy.
- Oddziel rekonstrukt skóry z insertu transwell za pomocą skalpela i bardzo ostrożnie usuń membranę, a następnie przenieś rekonstrukt skóry (warstwą naskórka do góry) na łoże rany.
- Umieść skórę mysi (warstwą naskórka do góry) na powierzchni rekonstruktu skóry.
- Wykonaj pierwszy szew w miejscu wcześniej zaznaczonego markera, drugi na dole, a następnie dwa kolejne szwy po bokach, aby utrwalić skórę myszy.
- Oczyścić skórę myszy po przeszczepie. Zdjąć stożek nosowy i pozostawić mysz na podgrzewanym podkładzie do momentu odzyskania przytomności i zdolności do poruszania się.
- Przenieś mysz do nowej klatki.
- Analgezja pooperacyjna: meloksykam (1 mg/kg) podawany podskórnie bezpośrednio po zabiegu, 24 godziny oraz 48 godzin po zabiegu.
2. Reprezentatywne wyniki:
Rekonstrukty skóry z prawidłowymi melanocytami i dermalnymi komórkami macierzystymi
Rekonstrukty skóry są hodowane w specjalnej płytce 6-dołkowej z wkładkami. Kompartment dermalny jest hodowany w pożywce DMEM z 10% FBS przez pierwsze cztery dni (Rys. 1A). Pożywka do rekonstruktów skóry I jest stosowana podczas wysiewania keratynocytów z melanocytami lub komórkami czerniaka (Rys. 1B). W 9. dniu naskórek zostaje wystawiony na działanie powietrza, co umożliwia różnicowanie keratynocytów (Rys. 1C). W 18. dniu naskórek rekonstruktów skóry składa się z warstwowych warstw keratynocytów. Niedróżnicowana warstwa podstawna i kolejno różnicujące się warstwy są zorientowane pionowo (Rys. 1D). Barwienie przekroju rekonstruktów markerem melanocytarnym S100 wykazuje, że melanocyty są rozmieszczone w warstwie podstawnej naskórka i komunikują się z wieloma keratynocytami poprzez wypustki dendrytyczne (Rys. 1E). Kompartment dermalny zawiera fibroblasty zatopione w macierzy kolagenu typu I. Zdeponowany kolagen IV wskazuje na błonę podstawną, która oddziela naskórek od skóry właściwej (Rys. 1F). Gdy dermalne komórki macierzyste (oznaczone lentiwirusem GFP) są zatopione wraz z fibroblastami w macierzy kolagenu I, migrują one do naskórka i różnicują się w melanocyty (1), (Rys. 2). W naskórku rozwija się wiele warstw keratynocytów.
Rekonstrukcje skóry z guzami czerniaka
Badania kliniczno-patologiczne wskazują, że czerniaki postępują w sposób etapowy: powszechne nabyte znamiona, znamiona dysplastyczne, czerniaki w fazie wzrostu radialnego (RGP), czerniaki w fazie wzrostu pionowego (VGP) oraz czerniaki przerzutowe (7). Różne stadia linii komórkowych czerniaka są morfologicznie do siebie podobne w hodowli 2-D (Ryc. 3A-D), jednak po włączeniu ich do rekonstrukcji skóry zachowanie komórek odzwierciedla ich charakterystykę in vivo. Lokalizacja i tempo wzrostu prawidłowych melanocytów są ściśle kontrolowane w rekonstrukcjach skóry (Ryc. 3E). Pierwotne czerniaki RGP WM35 proliferują głównie w naskórku (Ryc. 3F), podczas gdy czerniaki VGP WM793 rosną inwazyjnie w głąb skóry właściwej (Ryc. 3G). Czerniaki przerzutowe 1205Lu agresywnie naciekają głęboko do skóry właściwej (Ryc. 3H).
Rycina 1. Rekonstrukcje skóry z normalnymi melanocytami. Wygląd makroskopowy rekonstrukcji skóry przedstawiono na panelach A-C. A. Fibroblasty zmieszane z kolagenem są hodowane w DMEM zawierającym 10% FBS i tworzą komponent skórny. B. Keratynocyty i melanocyty są wysiewane na wierzch skóry właściwej i rosną w medium do rekonstrukcji skóry. C. Naskórek zostaje wystawiony na działanie powietrza w 9. dniu. D. Rekonstrukcja skóry barwiona H&E wykazuje naskórek składający się z pionowo zorientowanej warstwy podstawnej oraz następujących po niej zróżnicowanych warstw komórek wielowarstwowych. Skóra właściwa zawiera fibroblasty osadzone w macierzy kolagenu typu I. E. Melanocyty S100-dodatnie (czarne strzałki) są rozmieszczone wzdłuż błony podstawnej i komunikują się z wieloma keratynocytami. F. Barwienie na kolagen IV wskazuje błonę podstawną, która oddziela naskórek od skóry właściwej. Wszystkie barwienia w panelach D-F zostały wykonane na przekrojach utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie.
Rysunek 2. Dermalne komórki macierzyste w rekonstruktach skóry migrują do naskórka i różnicują się w melanocyty. W 5. dniu po wysianiu keratynocytów pojedyncze komórki GFP-dodatnie (zielone) zaczynają migrować poza sfery. Naskórek nadal składa się z jednej warstwy. W 8. dniu kilka komórek dociera do granicy naskórka i skóry właściwej. Do 10. dnia komórki GFP-dodatnie są ściśle ułożone w pozycji błony podstawnej. Zmigrowane do naskórka komórki GFP-dodatnie wykazują ekspresję markera melanocytarnego HMB45 (czerwony, wskazany białymi strzałkami). Jądra komórkowe są barwione DAPI (niebieski). Naskórek rozwija się w wiele warstw. Błonę podstawną zaznaczono białymi liniami przerywanymi.
Rysunek 3. Rekonstrukcje skóry na różnych etapach czerniaka: A-D. Normalne melanocyty i komórki czerniaka hodowane w kulturach 2D. A. Melanocyty z napletka. B. Komórki RGP WM35. C. Komórki VGP WM793. D. Komórki przerzutowego czerniaka 1205Lu. E. Normalne melanocyty znajdują się w błonie podstawnej. F. Komórki czerniaka RGP WM35 rosną w postaci skupisk komórek w naskórku. G. Komórki czerniaka VGP WM793 naciekają do skóry właściwej poprzez błonę podstawną. H. Komórki przerzutowego czerniaka 1205Lu agresywnie naciekają głęboko do skóry właściwej.
Rozwiązywanie problemów
| Problem | Rozwiązywanie problemów |
| Mieszanina kolagenu nie twardnieje | Kolor mieszaniny kolagenu powinien być słomkowo-żółty do różowego; w przeciwnym razie pH jest niewłaściwe i kolagen może nie żelować. Jeśli kolor jest jaskrawożółty, należy dodać więcej wodorowęglanu sodu, dodając go kropla po kropli. |
| Kolagen przedwcześnie wytrąca się w mieszaninie | Wszystkie komponenty należy przechowywać w lodzie do momentu umieszczenia mieszaniny kolagenu na wkładce |
| Skurczony kolagen nie jest jednorodny (jedna strona jest grubsza od drugiej) | Należy skalibrować półkę inkubatora |
| Epidermis tworzy mniej niż trzy warstwy keratynocytów | Należy użyć nieróżnicowanych keratynocytów z niskich pasaży |
Dyskusja
Opisano proces tworzenia trójwymiarowych (3D) rekonstruktów skóry z wykorzystaniem prawidłowych ludzkich melanocytów, dermalnych komórek macierzystych oraz komórek czerniaka. W hodowlach monowarstwowych komórki melanocytarne wykazują podobną morfologię (spłaszczoną, wrzecionowatą lub bardziej dendrytyczną), niezależnie od ich pochodzenia czy stadium klinicznego. W przeciwieństwie do tego, rekonstrukty skóry 3D odwzorowują właściwości komórek czerniaka charakterystyczne dla poszczególnych stadiów. Prawidłowe ludzkie melanocyty występują jako pojedyncze komórki w błonach podstawnych pomiędzy warstwą naskórka a skórą właściwą. Pierwotne komórki czerniaka RGP rosną w formie małych skupisk wzdłuż błony podstawnej, podczas gdy bardziej agresywne komórki czerniaka VGP tworzą duże skupiska przebijające się przez błonę podstawną do skóry właściwej. Komórki czerniaka przerzutowego rosną we wszystkich kierunkach i naciekają głęboko do skóry właściwej jako pojedyncze komórki lub skupiska. W tym modelu można przeprowadzić analizy ilościowe, mierząc głębokość nacieku oraz stopień proliferacji. Oprócz charakteryzacji prawidłowych i nowotworowych komórek melanocytarnych, przy użyciu tego modelu możemy bezpośrednio indukować różnicowanie dermalnych komórek macierzystych w dojrzałe melanocyty, które migrują do warstwy podstawnej naskórka i nawiązują bona fide komunikację z keratynocytami poprzez upregulację E-kadheryny (6).
Dzięki zastosowaniu wektorów wirusowych jesteśmy w stanie aktywować lub inaktywować funkcję genów, co pozwala na lepsze zrozumienie dynamiki i znaczenia funkcjonalnego genów eksprymowanych przez poszczególne typy komórek w rekonstruktach skóry. Stanowi to obiecujący i wydajny model do badania nie tylko mechanizmów transformacji melanocytów, ale również progresji czerniaka (8). Długoterminowa obserwacja fenotypów komórkowych stała się możliwa dzięki przeszczepianiu rekonstruktów skóry zwierzętom z niedoborem odporności. Taka chimera skóry ludzkiej i myszy jest doskonałym narzędziem badawczym do analizy melanomogenezy oraz przerzutowania czerniaka.
Rekonstrukcje skóry mogą być również użyteczną platformą do oceny leków. Wiele leków, które eliminują komórki nowotworowe w warunkach hodowli 2D, często wykazuje niewielki efekt w zastosowaniach eksperymentalnych i klinicznych. Podobnie jak w guzie in vivo, komórki czerniaka w hodowlach 3D są często oporne na leki, na które reagują komórki w hodowlach 2D, co sugeruje, że mikrośrodowisko moduluje szlaki sygnalizacyjne w czerniaku. W celu skutecznego odkrywania leków model 3D rekonstrukcji skóry stanowi idealne narzędzie przedkliniczne do przewidywania działania związków in vivo (9,10).
Podsumowując, modele rekonstrukcji skóry stanowią pomost między badaniami in vitro a in vivo. Pozwolą one na lepsze zrozumienie tego, które geny biorą udział w transformacji oraz w jaki sposób komórki macierzyste przyczyniają się do tego procesu.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Wistar Institute Animal Facility, Microscopy Facility, Histotechnology Facility oraz Research Supply Center. Badanie to zostało sfinansowane częściowo z grantów National Institutes of Health CA 076674, CA 098101, CA 025874 oraz CA 10815.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10x EMEM | BioWhittaker | 12-684F | |
| L-glutamina | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Hyclone | SH-30071.02 | |
| Kwasowo ekstrahowany kolagen z bydlęcych ścięgien | Organogeneza | 200/50 | |
| Płytki do hodowli tkankowych 6-dołkowe z wkładkami | Organogeneza | 9285 | |
| Bezwiernikowe pożywka dla keratynocytów (Keratinocyte Serum Free Medium) | GIBCO, by Life Technologies | 17005042 | |
| Dializowana surowica z płodu cielęcego | Hyclone | SH-30079.03 | |
| rekombinowany czynnik wzrostu komórek macierzystych człowieka | Fitzgerald Industries | RDI-307-255X | |
| Podstawowy FGF | Fitzgerald Industries | 30R-AF015 | |
| Endotelina-3, ludzka | American Peptide | 88-5-10 | |
| chlorek wapnia | Sigma-Aldrich | C-7902 | |
| DMEM | JRH biosciences | 56430-10L | |
| F12 (HAM’s) | GIBCO, by Life Technologies | 11765-54 | |
| Hydrokortyzon | Sigma-Aldrich | H-0888 | |
| Insulina, transferyna, etanolamina, selen (ITES) | BioWhittaker | 17839Z | |
| O-fosforyloetanoloamina | Sigma-Aldrich | P0503 | |
| Adenina | Sigma-Aldrich | A9795 | |
| Progesteron | Sigma-Aldrich | P-8783 | |
| Trijodotyronina | Sigma-Aldrich | T-5516 | |
| Surowica z noworodków cieląt | Hyclone | SH3011802 | |
| 10% buforowana formalina | Surgipath | 00600 | |
| optymalne medium do mrożenia w temperaturze cięcia (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Wielokasetowe | Surgipath | 02293-BX | |
| dokumentacja z biopsji TBS | Triangle Biomedical Sciences | BP-B | |
| artykuły dotyczące biopsji TBS | Triangle Biomedical Sciences | BP-B | |
| Jednorazowe formy podstawowe | Fisher Scientific | 15-182-501C | |
| Nalewka z benzoesanem złożonym | Professional Disposables, Inc, | S42450 | |
| gaziki nasączone alkoholem | apteka CVS | ||
| Pleciona jedwabna nić chirurgiczna, czarna, 5-0 | Ethicon Inc. | 682G | |
| Gazy chirurgiczne (sterylne) | apteka CVS | ||
| Pinceta | Roboz Surgical Instruments Co. | RS5070 | |
| Nożyczki irydologiczne | Roboz Surgical Instruments Co. | RS5913 | |
| Skalpele chirurgiczne | Feather Safety Razor Co, Ltd. | 2976 | |
| znieczulenie EZ | Euthanex Corp. | ||
| mysz SCID hairless outbred | Charles River Laboratories |
Bibliografia
- Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents. J Biotechnol. 122, 372-381 (2006).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 242-247 (2006).
- Sun, T., Norton, D., McKean, R. J., Haycock, J. W., Ryan, A. J., MacNeil, S. Development of a 3D cell culture system for investigating cell interactions with electrospun fibers. Biotechnol Bioeng. 97, 1318-1328 (2007).
- Kremer, M., Lang, E., Berger, A. Organotypical engineering of differentiated composite-skin equivalents of human keratinocytes in a collagen-GAG matrix (INTEGRA Artificial Skin) in a perfusion culture system. Langenbecks Arch Surg. 386, 357-363 (2001).
- Escámez, M. J., Garcí, M., Larcher, F., Meana, A., Muñoz, E., Jorcano, J. L., Del Río, M. An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice. J Invest Dermatol. 123, 1182-1191 (2004).
- Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Yu, H., Xu, X., Kong, J., Lee, J. T., Herlyn, M. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes. J Cell Sci. 123, 853-860 (2010).
- Meier, F., Nesbit, M., Hsu, M. Y., Martin, B., Van Belle, P., Elder, D. E., Schaumburg-Lever, G., Garbe, C., Walz, T. M., Donatien, P., Crombleholme, T. M., Herlyn, M. Human melanoma progression in skin reconstructs: biological significance of bFGF. Am J Pathol. 156, 193-200 (2000).
- Yu, H., McDaid, R., Lee, J., Li, L., Kumar, S. M., Elder, D. E., Van Belle, P., Gimotty, P., Guerra, M., Hammond, R., Nathanson, K. L., Dalla Palma, M., Herlyn, M., Xu, X. The role of BRAF mutation and p53 inactivation during transformation of a subpopulation of primary human melanocytes. Am J Pathol. 174, 2367-2377 (2009).
- Lee, J. T., Li, L., Brafford, P. A., van den Eijnden, M., Halloran, M. B., Sproesser, K., Haass, N. K., Smalley, K. S., Tsai, J., Bollag, G., Herlyn, M. PLX4032, a potent inhibitor of the B-Raf V600E oncogene, selectively inhibits V600E-positive melanomas. Pigment Cell Melanoma Res. 23, 820-827 (2010).
- Tsai, J., Lee, J. T., Wang, W., Zhang, J., Cho, H., Mamo, S., Bremer, R., Gillette, S., Kong, J., Haass, N. K. Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3041-3046 (2008).
Przedruki i uprawnienia
