Obrazowanie wielofotonowe inwazji komórek nowotworowych w ortotopowym modelu mysim dla raka płaskonabłonkowego jamy ustnej

Podsumowanie

Przedstawiono kompleksowy przegląd technik wykorzystywanych w tworzeniu mysiego modelu raka jamy ustnej oraz ilościowego monitorowania inwazji nowotworowej w obrębie języka za pomocą mikroskopii wielofotonowej komórek znakowanych. System ten może służyć jako użyteczna platforma do oceny molekularnej oraz skuteczności leków w przypadku związków przeciwinwazyjnych.

Streszczenie

Inwazja lokalno-regionalna raka głowy i szyi jest powiązana z ryzykiem przerzutowania i stanowi trudne wyzwanie przy projektowaniu i wdrażaniu strategii leczenia pacjentów. Opracowano ortotopowe modele mysie raka jamy ustnej, aby ułatwić badanie czynników wpływających na inwazję oraz służyć jako systemy modelowe do oceny terapii przeciwnowotworowych. W systemach tych wizualizacja rozproszonych komórek nowotworowych w tkankach jamy ustnej była zazwyczaj przeprowadzana za pomocą konwencjonalnej histologii lub przy użyciu in vivo metody bioluminescencyjne. Główną wadą tych technik jest immanentna niemożność dokładnej wizualizacji i kwantyfikacji w trzech wymiarach wczesnej inwazji komórek nowotworowych wywodzących się z ogniska pierwotnego. Przedstawiamy tutaj protokół, który łączy uznany model raka płaskonabłonkowego języka (SCOT) z obrazowaniem dwufotonowym, co umożliwia wielowektorową wizualizację rozprzestrzeniania się nowotworu języka. Linia komórkowa nowotworu głowy i szyi OSC-19 została stabilnie zmodyfikowana w celu ekspresji peptydu wiążącego F-aktynę LifeAct połączonego z białkiem fluorescencyjnym mCherry (LifeAct-mCherry). Fox1^nu/nu myszy, którym wstrzyknięto te komórki, niezawodnie wykształcają guzy, które umożliwiają wizualizację języka za pomocą ex vivo zastosowanie mikroskopii dwufotonowej. Technika ta umożliwia ortotopową wizualizację masy guza oraz lokalnie naciekających komórek w wyciętych językach, bez naruszania regionalnego mikrośrodowiska guza. Dodatkowo system ten pozwala na ilościową ocenę inwazji komórek nowotworowych poprzez obliczanie dystansów, na jakie komórki naciekające przemieściły się z miejsca pierwotnego guza. Całość procedury stanowi ulepszony system modelowy do analizy czynników przyczyniających się do inwazji SCOT oraz opracowania metod terapeutycznych ukierunkowanych na zapobieganie lokalnej inwazji i odległym przerzutom. Metoda ta posiada również potencjał do późniejszego połączenia z innymi modalnościami obrazowania w warunkach in vivo.

Protokół

1. Linie komórkowe, konstrukcja wektora i produkcja lentiwirusów

1. Ludzkie linie komórkowe nowotworów głowy i szyi (OSC19 lub UMSCC1) hodowano w pożywce kompletnej składającej się z DMEM (Cellgro kat. nr 50-003-PB) uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej FBS (Hyclone kat. nr SH30070.03), 1% penicyliny/streptomycyny (Cellgro kat. nr 30-002-CI) oraz 1% nieessentialnych aminokwasów (Cellgro kat. nr 25-025-CI).
2. Aby przenieść sekwencję kodującą LifeAct-mCherry do lentiwirusego wektora pLL7.0, zmodyfikowano miejsce rozpoznawania Sbf1 w macierzystym cDNA mCherry poprzez wprowadzenie trzech mutacji cichych do sekwencji rozpoznawczej przy użyciu mutagenezy celowanej (Stratagene kat. nr 200518-5). Otrzymaną zmodyfikowaną sekwencję LifeAct-mCherry namnożono metodą PCR z flankującymi miejscami EcoR1/Sbf1, a następnie subklonowano do pLL7.0 w celu wygenerowania konstruktu pLL7.0-LifeAct-mCherry.

2. Produkcja wirusa pLL7.0-LifeAct-mCherry

1. Produkcję wirusową przeprowadzono zgodnie z instrukcją Lentiviral Expression Systems (System Bioscience wersja 2-051018).
2. Linia komórek opakowujących 293T/17 (ATCC kat. # CRL-11268) była hodowana do 40% konfluencji w tym samym pełnym medium, którego używano dla linii HNSCC.
3. Komórki transfekowano wektorami pLL7.0-LifeAct-mCherry, psPAX2 oraz pVSV-G w stosunku odpowiednio 3:2:1, wykorzystując CalPhos (Clontech kat. # 631312).
4. Po 24 godzinach początkowe medium z transfekcji wymieniono na świeże medium.
5. Następnie medium zbierano i uzupełniano co 12 godzin przez okres 72 godzin, przechowując je w temperaturze 4°C.

3. Wytwarzanie linii komórkowych głowy i szyi ze stabilną ekspresją LifeAct-mCherry

1. Zebraną pożywkę wirowano z prędkością 2000 rpm przez 10 minut w temperaturze 4°C.
2. 1 mL oczyszczonej pożywki zawierającej wirusa dodano bezpośrednio do komórek OSC19 lub UMSCC1 na 12 godzin. Następnie komórki przepłukano i dodano kolejny 1 mL wirusa na kolejne 12 godzin.
3. Komórki traktowano pożywką zawierającą 200mg/ml puromycyny przez dwa tygodnie w celu wyselekcjonowania kolonii opornych.
4. Przeżyłe klony przesiewano wizualnie pod kątem ekspresji LifeAct-mCherry za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pojedyncze dodatnie kolonie poddano trypsynizacji przy użyciu sterylnych 3mm dysków do klonowania (Fisher kat # 0790710A).
5. Dodatnie komórki hodowano w pożywce zawierającej 200mg/ml puromycyny do momentu ich zamrożenia lub wykorzystania do wstrzyknięć ortotopowych.

4. Tworzenie ortotopowego ksenoprzeszczepu guza

1. Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem (09-0821) zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu West Virginia.
2. Komórki nowotworowe wykazujące ekspresję LifeAct-mCherry poddano trypsynizacji oraz wirowaniu, a następnie 2,5 x 10⁴ komórek zawieszono w 50 μL pożywki kompletnej.
3. Komórki nowotworowe wprowadzono do strzykawki o objętości 1 ml z przymocowaną igłą o rozmiarze 27 ½ G.
4. Samice myszy atymicznych Fox1^nu/nu w wieku 8 tygodni (Harlan Laboratories) zanestezjowano kombinacją 80 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny. Zanestezjowane myszy utrzymywano w temperaturze 37-40 °C na podkładce grzewczej.
5. Za pomocą sterylnej pincety delikatnie chwycono czubek języka i ostrożnie wysunięto go z jamy ustnej.
6. Komórki powoli wstrzykiwano w jedną stronę każdego języka, aby utworzyć guzowatą masę w centrum języka, unikając naczyń tętnic językowych.
7. Myszom wstrzyknięto 2,1 mg/kg johimbiny i przeniesiono je z powrotem na podkładkę grzewczą, gdzie monitorowano je przez 2-3 godziny podczas wybudzania z narkozy.
8. Po odzyskaniu przytomności myszy umieszczono w sterylnych klatkach zawierających miękką dietę z ciasta transgenicznego (Bioserve kat. nr S3472).
9. Myszy ważono co 2-3 dni i monitorowano wizualnie pod kątem pojawienia się guza.

5. Przygotowanie języków myszy do obrazowania ex-vivo

1. Myszy z guzami w różnych punktach czasowych (zazwyczaj 2-4 tygodnie po wstrzyknięciu) uśmiercono poprzez inhalację dwutlenkiem węgla.
2. Wycięto języki, przepłukano je 1X PBS i przymocowano do jednej strony standardowej kasety do zatapiania tkanek w parafinie (StatLab Cat #H104,) za pomocą monofilamentowej nici krawieckiej z lokalnego sklepu hobbystycznego oraz igły krawieckiej rozmiaru 8.
3. Po unieruchomieniu języków cały zespół kasety umieszczono w 30mm naczyniu do hodowli tkankowej i zanurzono w 1X PBS.
4. Przetworzone języki niezwłocznie wykorzystano do mikroskopii dwufotonowej.

6. Obrazowanie nowotworów języka za pomocą mikroskopii dwufotonowej

1. Kasety z językami zanurzono w szalce 60 mm zawierającej 1X PBS, przymocowanej w specjalnie zaprojektowanym uchwycie na wysuwanym ramieniu wspornikowym (Chamber Shuttle, Siskiyou instruments) umieszczonym pod obiektywem mikroskopu pionowego (Moveable Microscope (MOM); Sutter Instruments).
2. Obiektyw imersyjny wodny 40X/0.8NA umieszczono bezpośrednio na widocznych zmianach nowotworowych lub nad nimi. Obrazowanie języków przeprowadzono za pomocą mikroskopii dwufotonowej z laserem Ti:szafir (Mira, Coherent) przy intensywności 60 mW i długości fali wejściowej 755 nm w celu optymalizacji sygnału mCherry.
3. Seryjne obrazy z laserowego skanowania o szerokości 1 mm gromadzono w odstępach głębokości 1 μm na całkowitej głębokości tkanki od 15 do 100 μm (w zależności od objętości guza). Obrazy rejestrowano za pomocą ScanImage, programu open source opartego na platformie MATLAB, opracowanego w laboratorium Karela Svobody (Janelia Farms, HHMI). ScanImage generuje dwukanałowy sygnał wyjściowy wzorów skanowania rastrowego do sterowania galwanometrycznymi lustrami skanującymi x/y, a jednocześnie rejestruje maksymalnie czterokanałowy sygnał wejściowy z lamp fotopowielaczy (PMTs) za pośrednictwem karty akwizycji danych (PCI-6610S, National Instruments). Sygnały z PMT są wzmacniane przez nisko szumowe przedwzmacniacze prądowe (SR570, Stanford Research System) przed przesłaniem do karty NI-DAQ w celu wyświetlenia na monitorze. ScanImage zbiera obrazy z serii z-stack poprzez sterowanie osią z obiektywu oraz rejestruje obrazy time-lapse w trybie pojedynczym lub cyklicznym. Obrazy zapisywano w pojedynczym pliku TIFF z głębią 16 bitów.

7. Analiza obrazów przy użyciu oprogramowania Amira

1. Obrazowanie w programie Amira w celu kwantyfikacji guza: w oprogramowaniu Amira otwórz plik TIFF zawierający zestaw obrazów z serii z-stack.
2. Zaznacz nazwę pliku, a następnie wybierz i zastosuj funkcję Voltex, aby wygenerować renderowanie trójwymiarowe. Na wyrenderowanym obrazie zazwyczaj widoczny jest duży obraz guza pierwotnego wraz z kilkoma mniejszymi, rozproszonymi grupami inwazyjnymi (IG) składającymi się z komórek naciekających (patrz Rysunek 6A).
3. Aby zaznaczyć masę guza pierwotnego, wybierz „Open Data”, następnie „Labeling”, a potem „Label Field”.
4. Progowanie guza pierwotnego – zaznacz wszystkie obrazy z serii z-stack i przewiń obrazy w płaszczyźnie z, aby upewnić się, że w trzech wymiarach uwzględniona jest tylko masa guza pierwotnego. Jest to zazwyczaj największy obraz w polu widzenia, który często wydaje się podzielony podczas przesuwania przez płaszczyznę z.
5. Użyj funkcji magicznej różdżki/progowania, aby skorygować fluorescencję tła i usunąć ją z obrazu bez odrzucania sygnału z guza. Zaznacz etykietę „Inside File” i kliknij przycisk ⊕. Zaznacz pole wyboru „All Slices”. Spowoduje to utworzenie kolorowej obramowania wokół progowanego obszaru guza pierwotnego w każdym przyroście serii z-stack.
6. Aby zaznaczyć IG, wybierz funkcję „New”. Zaznacz pojedynczą IG i upewnij się, przewijając płaszczyznę z, że nie jest ona powiązana z guzem pierwotnym.
7. Zaznacz „All Slices” i kliknij przycisk ⊕. Zmień nazwę pliku (np. IG 1).
8. Powtórz procedurę progowania opisaną w punkcie 7.4 oraz krok zaznaczania z punktu 7.5 dla wyznaczonej IG. Wybierz kolor obrysu inny niż kolor użyty do oznaczenia masy guza pierwotnego.
9. Powtarzaj czynność w razie potrzeby dla każdej kolejnej IG na całym obrazie, skanując płaszczyznę z, aby upewnić się, że wszystkie IG zostały oznaczone. Użycie różnych kolorów dla każdej zidentyfikowanej IG ułatwia późniejszą identyfikację na obrazie.
10. Po zaznaczeniu guza pierwotnego i wszystkich IG wybierz „Segmentation” z menu rozwijanego, a następnie „Material Statistics”. Pozwala to na uzyskanie pomiaru objętości oraz współrzędnych X, Y i Z rdzenia guza pierwotnego w celu obliczenia odległości IG od centralnego punktu guza.
11. Po obliczeniu objętości wyznacz odległość każdej IG od centralnego rdzenia guza pierwotnego. Wybierz „Segmentation”, a następnie „Material Statistics”. Krok ten oblicza wszystkie pomiary w pikselach. Przelicz piksele na mikrometry na podstawie kalibracji obiektywu mikroskopu i wszelkich dodatkowych zwiększeń powiększenia (np. funkcji zoom). Dla mikroskopu i ustawień użytych w tych eksperymentach zastosowano obiektyw 40X bez zoomu, co dało kalibrację 1 pixel = 0.298 μm. Zaimportuj dane do arkusza Excel, który zawiera parametry guza pierwotnego w trzech wymiarach (X1, Y1, Z1) oraz dla każdej IG (np. X2, Y2, Z2 dla pierwszej IG).
12. Odległość inwazyjną w mikronach dla każdej IG od centrum guza pierwotnego oblicza się za pomocą wzoru √((X2-X1)² + (Y2-Y1)² + (Z2-Z1)²).
13. Indeks inwazyjności guza (T_I) oblicza się za pomocą wzoru T_I = N_T x V_T x D_T, gdzie N_T = całkowita liczba IG na obrazie, V_T = całkowita objętość wszystkich IG, D_T = całkowita odległość przebyta przez wszystkie grupy inwazyjne od centrum guza pierwotnego.

8. Renderowanie trójwymiarowe przy użyciu oprogramowania Nikon NIS-Elements

1. Trójwymiarowe renderingi o większej szczegółowości topograficznej można wygenerować poprzez zaimportowanie oryginalnych 16-bitowych monochromatycznych plików TIFF całego obrazu guza do pakietu oprogramowania Nikon NIS-Elements (Nikon, Melville, NY). Wybierz „File”, następnie „ND”, a potem „Create ND File from File Sequence”. Wybierz stos obrazów z-series TIFF i określ odpowiednią wielkość kroku.
2. Kalibruj dokument ND w płaszczyźnie xy. Określ rozmiar jednego piksela, korzystając z kalibracji ręcznej.
3. Wybierz „Volume View”. Użyj funkcji „HQ”, aby obliczyć dodatkowe przekroje w płaszczyźnie z w celu uzyskania wyższej jakości. W „3D Renderer Settings” użyj „Advanced Renderer” z jakością „Ultra High Details” i „Full Resolution”. Wybierz „Alpha Blending”, aby uwydatnić powierzchnie guza.
4. Zoptymalizuj obraz trójwymiarowy do prezentacji. Powiększ obraz guza oraz powiązanych IG i przytnij go w razie potrzeby. Obróć obraz w płaszczyznach xyz i dostosuj tablice LUT.
5. Przechwyć obraz do prezentacji. Wybierz „Edit- Create View Snapshot (8 bit RGB)”. Nazwij i zapisz plik w odpowiedni sposób.

9. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1. Ogólny schemat ilustrujący kluczowe etapy powstawania ortotopowego guza języka oraz obrazowania dwufotonowego in situ.

Rysunek 2. Iniekcja komórek OSC19 wykazujących ekspresję LifeAct-mCherry do języka myszy.

Rysunek 3 Wycięty język myszy z guzem, przygotowany do obrazowania dwufotonowego.

Rysunek 4. Orientacja języka z guzem w pozycji w mikroskopie dwufotonowym, przygotowana do obrazowania.

Rysunek 5. Reprezentatywny zrzut ekranu z programu ScanImage prezentujący akwizycję surowych danych początkowego obrazu dwufotonowego.

Rycina 6. Analiza obrazu i kwantyfikacja naciekania guza w ortotopowym modelu guza OSC19. Reprezentatywne zrzuty ekranu z renderowania Amira Voltex (A) oraz pojedynczego przeprogowanego przekroju osi z (B), na których guz pierwotny zaznaczono kolorem fioletowym, grupę inwazyjną 1 (IG-1) kolorem niebieskim, IG-2 kolorem czerwonym i IG-3 kolorem zielonym, jako przykład procedury identyfikacji. Grot strzałek oznacza grupy IG w (A) i (B). C. Wykresy objętości względem odległości naciekania dla ośmiu poszczególnych grup IG wykorzystanych do obliczenia indeksu naciekania guza (Ti).

Rysunek 7. Reprezentatywne obrazy nowotworów i grup komórek nowotworowych naciekających uzyskane zgodnie z niniejszym protokołem w porównaniu z obrazami uzyskanymi za pomocą konwencjonalnego podejścia IHC. A. Przekrój parafionowy całego języka mysiego z ortotopowym nowotworem UMSCC1. Barwienie immunohistochemiczne przeprowadzono zgodnie z konwencjonalnymi procedurami, stosując przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko specyficznemu dla HNSCC markerowi komórkowemu emmprin (Zymed; kat. nr 34-5600) w rozcieńczeniu 1:1000, a wizualizację wykonano przy użyciu zestawu detekcyjnego OmniMap DAB anti-Rb (Ventana kat. nr 760-149), a następnie zastosowano barwienie hematoksyliną żelazową. Obrazy obejmujące cały obszar języka zbierano pojedynczo przy powiększeniu 4X przy użyciu mikroskopu Olympus ZX70 Provis z kamerą Optronics MicroFire CCD i zrekonstruowano za pomocą pakietu obrazowania StereoINvestigator (MBF Bioscience). Nowotwór jest widoczny na czubku języka. Powiększony obszar ukazujący front inwazyjny i poszczególne grupy komórek nowotworowych (groty strzałek) przedstawiono w (B). C. Rendering Nikon NIS-Elements reprezentatywnego nowotworu OSC19. Widoczny jest zwiększony detal konturów oraz wyraźna wizualizacja IG (groty strzałek). Paski skali na wszystkich obrazach = 100 μm.

Dyskusja

Ortotopiczne modele mysie okazały się użyteczne w badaniu wielu aspektów nowotworów głowy i szyi^1,2. Połączyliśmy dobrze ugruntowany ortotopowy system SCOT³ z obrazowaniem mikroskopowym dwufotonowym komórek znakowanych mCherry, tworząc system do badania wczesnych zdarzeń inwazji komórek nowotworowych głowy i szyi. W tej procedurze zauważyliśmy, że komórki mogą wyciekać z miejsca wstrzyknięcia guza, szczególnie u myszy w wieku sześciu tygodni lub młodszych, ze względu na niewystarczającą wielkość języka. Aby uniknąć tego problemu, stosujemy starsze myszy. Większy rozmiar języka u starszych myszy pomaga również zapobiec pęknięciu tętnicy językowej i nadmiernemu krwawieniu z języka. Przyjęcie się guza jest znacznie zwiększone, gdy w miejscu początkowego wstrzyknięcia występuje gwałtowny obrzęk języka. Obrzęk ten ustępuje w ciągu jednej do dwóch godzin w miarę wchłaniania wstrzykniętego płynu. Wzrost guza staje się widoczny jeden do dwóch tygodni po wstrzyknięciu wskazanej liczby komórek w postaci małego białego guzka na powierzchni języka. Zauważyliśmy również, że przy użyciu obiektywu 40X w przedstawionych tutaj badaniach nie jesteśmy w stanie rozróżnić pojedynczych komórek nowotworowych, ale identyfikujemy IGs jako inwazyjne skupiska komórek, które odzwierciedlają typowy sposób inwazji HNSCC.

Do tej pory model ten był szeroko wykorzystywany do badania roli konkretnych cząsteczek, a także działania kilku leków przeciwnowotworowych na wzrost i inwazję SCOT, przy czym skuteczność mierzono poprzez monitorowanie przerzutów do węzłów chłonnych szyi za pomocą metod IHC lub bioluminescencyjnych^4-7. Guzy tworzące się w tym systemie manifestują się blisko powierzchni języka (Rysunek 7), co umożliwia zastosowanie mikroskopii dwufotonowej do obrazowania całych guzów in situ jako inwazyjnych skupisk wielokomórkowych. Procedura ta może być również wykorzystana do wizualizacji inwazji nowotworowej z rozdzielczością komórkową. Mikroskopia dwufotonowa była wcześniej wykorzystywana do badania eksperymentalnych metod leczenia raka głowy i szyi w modelach ortotopowych^8,9 i ksenoprzeszczepach^8,10. Istnieją jednak dwie główne różnice między tymi raportami a naszym protokołem. Po pierwsze, w badaniach tych stosowano markery zewnątrzkomórkowe do celowania/identyfikacji komórek nowotworowych głowy i szyi, co mogło ograniczyć detekcję jedynie do komórek nowotworowych z szerokim dostępem do krwiobiegu. Po drugie, inwazja komórek nowotworowych w pobliżu miejsca pierwotnego, która prawdopodobnie odzwierciedla wczesną aktywność przerzutową, nie była oceniana jako parametr eksperymentalny. Nasz protokół umożliwia bezpośrednią kwantyfikację inwazji komórek nowotworowych w dowolnym momencie progresji guza w językach myszy. Chociaż opisana tutaj metoda dotyczy procedury z wykorzystaniem wypreparowanych języków, obecnie jesteśmy w trakcie adaptacji tej metody do obrazowania inwazji nowotworowej u żywych myszy, aby w połączeniu z bioluminescencją jednocześnie monitorować wczesną inwazję, zajęcie miejscowych węzłów chłonnych oraz przerzuty odległe u tego samego zwierzęcia. Modyfikacje protokołu dla obrazowania in vivo wymagają zaprojektowania odpowiedniego stołu do pozycjonowania i utrzymania myszy podczas obrazowania, a także praktycznego systemu do prawidłowego nawilżania jamy ustnej znieczulonych myszy podczas procedury obrazowania. Po optymalizacji adaptacje te umożliwią badanie roli potencjalnych cząsteczek proinwazyjnych oraz testowanie związków przeciwinwazyjnych pod kątem inwazji miejscowej i bardziej odległego zajęcia przerzutowego u zwierząt w dłuższych okresach czasu.