Opisujemy niskokosztową, wysokoprzepustową metodę przesiewania aktywności endoglukanazy grzybowej w E. coli. Metoda opiera się na prostym wizualnym odczycie degradacji substratu, nie wymaga oczyszczania enzymu i jest wysoce skalowalna. Umożliwia to szybkie przesiewanie dużych bibliotek wariantów enzymatycznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wysokoprzepustowy screening aktywności grzybowej endoglukanazy w Escherichia coli
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Enzymy celulazy (endoglukanazy, celobiohydrolazy i β-glukozydazy) hydrolizują celulozę do cukrów prostych, które z kolei mogą zostać przekształcone w alkohole paliwowe1. Potencjał hydrolizy enzymatycznej biomasy celulozowej w celu zapewnienia odnawialnych źródeł energii zintensyfikował wysiłki na rzecz inżynierii celulaz w celu ekonomicznej produkcji paliw2. Szczególne zainteresowanie budzą celulazy grzybowe3-8, które są już wykorzystywane przemysłowo w przetwórstwie spożywczym i tekstylnym.
Identyfikacja aktywnych wariantów w bibliotece mutantów celulaz jest kluczowa dla procesu inżynierii; aktywne mutanty mogą być dalej testowane pod kątem poprawy właściwości i/lub poddane dodatkowej mutagenezie. Efektywną inżynierię celulaz grzybowych utrudniał brak narzędzi genetycznych dla organizmów rodzimych oraz trudności w ekspresji enzymów w gospodarzach heterologicznych. Niedawno Morikawa i współpracownicy opracowali metodę ekspresji w E. coli domen katalitycznych endoglukanaz z H. jecorina3,9, ważnego grzyba przemysłowego zdolnego do wydzielania celulaz w dużych ilościach. Funkcjonalną ekspresję w E. coli zgłoszono również dla celulaz z innych grzybów, w tym Macrophomina phaseolina10 oraz Phanerochaete chrysosporium11-12.
Przedstawiamy metodę wysokoprzepustowego screeningu aktywności grzybowej endoglukanazy w E. coli. (Ryc. 1) Metoda ta wykorzystuje powszechny barwnik mikrobiologiczny czerwień kongową (CR) do wizualizacji enzymatycznej degradacji karboksymetylocelulozy (CMC) przez komórki rosnące na podłożu stałym. Test aktywności wymaga niedrogich odczynników, minimalnych manipulacji i daje jednoznaczne wyniki w postaci stref degradacji („halo”) w miejscu kolonii. Chociaż za pomocą tej metody nie można określić ilościowego pomiaru aktywności enzymatycznej, stwierdziliśmy, że wielkość halo koreluje z całkowitą aktywnością enzymatyczną w komórce. Dalsza charakterystyka poszczególnych pozytywnych klonów pozwoli określić względną sprawność białka.
Tradycyjne testy aktywności CMC/CR z użyciem całych komórek bakteryjnych13 polegają na wylewaniu agaru zawierającego CMC na kolonie, co wiąże się z ryzykiem kontaminacji krzyżowej, lub na inkubowaniu kultur w dołkach z agarem CMC, co jest mniej praktyczne przy eksperymentach na dużą skalę. Przedstawiamy tutaj ulepszony protokół, który modyfikuje istniejące metody płukania14 w badaniu aktywności celulazy: komórki hodowane na płytkach z agarem CMC są usuwane przed barwieniem CR. Nasz protokół znacznie ogranicza kontaminację krzyżową i jest wysoce skalowalny, co umożliwia szybki screening tysięcy klonów. Oprócz enzymów H. jecorina, wyekspresowano i przeselekcjonowano warianty endoglukanazy z Thermoascus aurantiacus oraz Penicillium decumbens (pokazane na Rysunku 2), co sugeruje, że protokół ten ma zastosowanie do enzymów pochodzących z wielu organizmów.
Protokół
1. Przygotowanie płyt do przesiewania
- Do 1 L wody destylowanej dodać 25 g pożywki wzrostowej LB, 15 g agaru oraz 1,5 g podłoża z karboksymetylocelulozy (CMC), a następnie wysterylizować w autoklawie.
- Po autoklawowaniu pozwolić pożywce ostygnąć, a następnie dodać odpowiednie antybiotyki oraz IPTG do stężenia końcowego 100μM.
- Nalać po 200 mL pożywki do 5 dużych kwadratowych szalek Petriego/tacek do testów biologicznych (240 x 240 x 20 mm lub większych). Pozostawić płytki do całkowitego wyschnięcia.
2. Generowanie i przesiew biblioteki endoglukanaz
- Wygenerować bibliotekę domen katalitycznych endoglukanazy. Może to zostać osiągnięte na wiele sposobów (np. poprzez mutogenezę celowaną lub losową, rekombinację itp.), zależnie od decyzji badacza.
- Sklonować bibliotekę do wektora w taki sposób, aby znajdowały się one pod kontrolą promotora T7 z operatorem lac i zawierały sekwencję sygnałową pelB w celu kierowania do periplazmy. Przykładem odpowiedniego wektora jest pET22b(+) od Novagen.
- Przetransformować bibliotekę endoglukanazy do szczepu E. coli BL21 (DE3) i wysiać na płytki w celu uzyskania pojedynczych kolonii.
- Inkubować transformaty przez noc w temperaturze 37°C.
- Za pomocą sterylnych wykałaczek zaszczepić klony na 96-dołkowe płytki głębokie zawierające 400μL podłoża LB z dodatkiem odpowiednich antybiotyków. Inkubować przez noc w temperaturze 37°C przy wstrząsaniu z prędkością 250 rpm.
- Do nocnych kultur w płytkach 96-dołkowych dodać sterylny glicerol do stężenia końcowego 10% w celu długoterminowego przechowywania w temperaturze -80°C. Będzie to płytka matrycowa.
- Za pomocą stempla 96-pinowego przenieść nocne kultury z płytek na płytki przesiewowe zawierające IPTG i CMC. Na każdą płytkę przesiewową można przenieść do 5 zestawów nocnych kultur.
- Oznaczyć płytki przesiewowe w taki sposób, aby znana była tożsamość i orientacja każdej płytki 96-dołkowej.
- Inkubować przeniesione biblioteki w temperaturze pokojowej (17-25°C) przez noc lub do momentu pojawienia się widocznych kolonii.
- Płukać płytkę wodą destylowaną, aż do całkowitego usunięcia śladów kolonii.
- Wylać czerwień kongową (CR; 0,5% w wodzie) na wypłukaną płytkę. Należy dodać tylko tyle CR, aby pokryć całą płytkę.
- Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Nie przekraczać 15 minut inkubacji w CR. Dłuższy czas inkubacji spowoduje powstanie mniej wyraźnych halo.
- Odlać CR i dodać obfitą ilość (więcej niż potrzeba do pokrycia płytki) 1M NaCl.
- Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Odlać NaCl, aby odsłonić halo degradacji CMC. W celu uzyskania lepszej rozdzielczości halo może być wymagany dłuższy czas inkubacji z NaCl lub wielokrotne płukanie NaCl.
- Za pomocą sterylnej wykałaczki wyizolować klony aktywnych enzymów z płytki matrycowej do dalszej charakterystyki.
3. Reprezentatywne wyniki:
Przykład odczytu dla tego wysokoprzepustowego przesiewu przedstawiono na Rysunku 3. Klony można zidentyfikować jako nieaktywne, słabo aktywne oraz silnie aktywne na podstawie wielkości stref degradacji. Jest to szczególnie przydatne, jeśli w bibliotece znajduje się enzym o znanej aktywności jako referencja. Jak tu pokazano, identyfikacja aktywnych enzymów jest wiarygodna i powtarzalna. Należy jednak pamiętać, że prawidłowe oznakowanie płytek przesiewowych jest niezwykle ważne. Badacz musi być w stanie zidentyfikować aktywne warianty po wypłukaniu kolonii, aby móc wyizolować je z płyty matki przechowywanej w -80°C do dalszej charakterystyki. Wreszcie, trudno jest ocenić a priori zależność między aktywnościami na substratach sztucznych a naturalnymi. Dlatego badacz musi przetestować wszystkie pozytywne klony na materiale istotnym przemysłowo, aby określić przydatność białka.
Rycina 1. Schematyczny opis procedury przesiewowej. Komórki są transformowane biblioteką endoglukanaz i wysiewane selektywnie w celu uzyskania pojedynczych kolonii. Wybrane klony są hodowane przez noc w głębokich płytkach 96-dołkowych w celu (1) przechowywania w -80°C oraz (2) wysiewu metodą replikacji na płytkach zawierających CMC i IPTG w celu indukcji ekspresji endoglukanazy. Aktywne klony są wybierane z płytki matki przechowywanej w -80°C.
Rysunek 2. Klonowanie i ekspresja grzybiczych domen katalitycznych w E. coli. (A) Wektor ekspresyjny endoglukanazy. Geny sklonowano do pET22b(+) (Novagen) pod kontrolą promotora T7. (B) Panel prawy: kolonie BL21 (DE3) wykazujące ekspresję endoglukanazy. Panel lewy: halo degradacji CMC po przemyciu i wybarwieniu czerwienią Kongowego.
Rycina 3. Przykładowe wyniki przesiewania CMC/Czerwienią Kongową. Zdjęcia płytek przesiewowych wykonane po przemyciu i wywoływaniu Czerwienią Kongową. Wszystkie kolonie na płytkach przesiewowych były o podobnej wielkości.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany tutaj protokół umożliwia szybką i wysokoprzepustową identyfikację aktywnych enzymów przy minimalnej manipulacji. Detekcja aktywności jest dość czuła i jakościowo odzwierciedla poziom aktywności wewnątrz komórki. Łatwość użycia sprawia, że metoda ta jest odpowiednia dla szerokiego zakresu bibliotek enzymów, ograniczona jedynie przez funkcjonalną ekspresję w E. coli. Co więcej, tego rodzaju przesiewanie aktywności nie ogranicza się do fungalnych celulaz, lecz może zostać dostosowane do dowolnej aktywności ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była finansowana przez Gordon and Betty Moore Foundation oraz UNCF/Merck Science Initiative.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| IPTG | Sigma-Aldrich | I1284 | |
| Czerwień kongijska | Sigma-Aldrich | C6277 | |
| Karboksymetyloceluloza | Sigma-Aldrich | 360384 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S1679 | |
| Bacto-agar | BD Biosciences | 214030 | |
| Płytki do bioanaliz | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 240845 |
Bibliografia
- Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels. Nature. 451, 86-89 (2008).
- Wilson, D. B. Cellulases and biofuels. Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).
- Qin, Y. Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum. J Biotechnol. 135, 190-195 (2008).
- Nakazawa, H. Directed evolution of endoglucanase III (Cel12A) from Trichoderma reesei. Appl Microbiol Biotechnol. 83, 649-657 (2009).
- Heinzelman, P. A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination. Proc Natl Acad Sci. 106, 5610-5615 (2009).
- Heinzelman, P. SCHEMA recombination of a fungal cellulase uncovers a single mutation that contributes markedly to stability. J Biol Chem. 284, 26229-26233 (2009).
- Lantz, S. E. Hypocrea jecorina CEL6A protein engineering. Biotechnol Biofuels. 8, 3-20 (2010).
- Mahadevan, S. A. Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima). FEMS Microbiol Lett. 287, 205-211 (2008).
- Nakazawa, H. Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 81, 681-689 (2008).
- Wang, H., Jones, R. W. Properties of the Macrophomina phaseolina endoglucanase (EGL 1) gene product in bacterial and yeast expression systems. Appl Biochem Biotechnol. 81, 153-160 (1999).
- Howard, R. L. Enzyme activity of a Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase (CBHI.1) expressed as a heterologous protein from Escherichia coli. Afr J Biotechnol. 2, 296-300 (2003).
- Howard, Characterisation of a chimeric Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase expressed from Escherichia coli. Afr J Biotechnol. 3, 349-352 (2004).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl Env Microbiol. 43, 777-780 (1982).
- Gilkes, N. R. Mode of action and substrate specificities of cellulases from cloned bacterial genes. J Bio Chem. 259, 10455-10459 (1984).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
