Opisujemy niskokosztową, wysokoprzepustową metodę przesiewania aktywności endoglukanazy grzybowej w E. coli. Metoda opiera się na prostym wizualnym odczycie degradacji substratu, nie wymaga oczyszczania enzymu i jest wysoce skalowalna. Umożliwia to szybkie przesiewanie dużych bibliotek wariantów enzymatycznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wysokoprzepustowy screening aktywności grzybowej endoglukanazy w Escherichia coli
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Enzymy celulazy (endoglukanazy, celobiohydrolazy i β-glukozydazy) hydrolizują celulozę do cukrów prostych, które z kolei mogą zostać przekształcone w alkohole paliwowe1. Potencjał hydrolizy enzymatycznej biomasy celulozowej w celu zapewnienia odnawialnych źródeł energii zintensyfikował wysiłki na rzecz inżynierii celulaz w celu ekonomicznej produkcji paliw2. Szczególne zainteresowanie budzą celulazy grzybowe3-8, które są już wykorzystywane przemysłowo w przetwórstwie spożywczym i tekstylnym.
Identyfikacja aktywnych wariantów w bibliotece mutantów celulaz jest kluczowa dla procesu inżynierii; aktywne mutanty mogą być dalej testowane pod kątem poprawy właściwości i/lub poddane dodatkowej mutagenezie. Efektywną inżynierię celulaz grzybowych utrudniał brak narzędzi genetycznych dla organizmów rodzimych oraz trudności w ekspresji enzymów w gospodarzach heterologicznych. Niedawno Morikawa i współpracownicy opracowali metodę ekspresji w E. coli domen katalitycznych endoglukanaz z H. jecorina3,9, ważnego grzyba przemysłowego zdolnego do wydzielania celulaz w dużych ilościach. Funkcjonalną ekspresję w E. coli zgłoszono również dla celulaz z innych grzybów, w tym Macrophomina phaseolina10 oraz Phanerochaete chrysosporium11-12.
Przedstawiamy metodę wysokoprzepustowego screeningu aktywności grzybowej endoglukanazy w E. coli. (Ryc. 1) Metoda ta wykorzystuje powszechny barwnik mikrobiologiczny czerwień kongową (CR) do wizualizacji enzymatycznej degradacji karboksymetylocelulozy (CMC) przez komórki rosnące na podłożu stałym. Test aktywności wymaga niedrogich odczynników, minimalnych manipulacji i daje jednoznaczne wyniki w postaci stref degradacji („halo”) w miejscu kolonii. Chociaż za pomocą tej metody nie można określić ilościowego pomiaru aktywności enzymatycznej, stwierdziliśmy, że wielkość halo koreluje z całkowitą aktywnością enzymatyczną w komórce. Dalsza charakterystyka poszczególnych pozytywnych klonów pozwoli określić względną sprawność białka.
Tradycyjne testy aktywności CMC/CR z użyciem całych komórek bakteryjnych13 polegają na wylewaniu agaru zawierającego CMC na kolonie, co wiąże się z ryzykiem kontaminacji krzyżowej, lub na inkubowaniu kultur w dołkach z agarem CMC, co jest mniej praktyczne przy eksperymentach na dużą skalę. Przedstawiamy tutaj ulepszony protokół, który modyfikuje istniejące metody płukania14 w badaniu aktywności celulazy: komórki hodowane na płytkach z agarem CMC są usuwane przed barwieniem CR. Nasz protokół znacznie ogranicza kontaminację krzyżową i jest wysoce skalowalny, co umożliwia szybki screening tysięcy klonów. Oprócz enzymów H. jecorina, wyekspresowano i przeselekcjonowano warianty endoglukanazy z Thermoascus aurantiacus oraz Penicillium decumbens (pokazane na Rysunku 2), co sugeruje, że protokół ten ma zastosowanie do enzymów pochodzących z wielu organizmów.
Protokół
1. Przygotowanie płyt do przesiewania
- Do 1 L wody destylowanej dodać 25 g pożywki wzrostowej LB, 15 g agaru oraz 1,5 g podłoża z karboksymetylocelulozy (CMC), a następnie wysterylizować w autoklawie.
- Po autoklawowaniu pozwolić pożywce ostygnąć, a następnie dodać odpowiednie antybiotyki oraz IPTG do stężenia końcowego 100μM.
- Nalać po 200 mL pożywki do 5 dużych kwadratowych szalek Petriego/tacek do testów biologicznych (240 x 240 x 20 mm lub większych). Pozostawić płytki do całkowitego wyschnięcia.
2. Generowanie i przesiew biblioteki endoglukanaz
- Wygenerować bibliotekę domen katalitycznych ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany tutaj protokół umożliwia szybką i wysokoprzepustową identyfikację aktywnych enzymów przy minimalnej manipulacji. Detekcja aktywności jest dość czuła i jakościowo odzwierciedla poziom aktywności wewnątrz komórki. Łatwość użycia sprawia, że metoda ta jest odpowiednia dla szerokiego zakresu bibliotek enzymów, ograniczona jedynie przez funkcjonalną ekspresję w E. coli. Co więcej, tego rodzaju przesiewanie aktywności nie ogranicza się do fungalnych celulaz, lecz może zostać dostosowane do dowolnej aktywności .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była finansowana przez Gordon and Betty Moore Foundation oraz UNCF/Merck Science Initiative.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| IPTG | Sigma-Aldrich | I1284 | |
| Czerwień kongijska | Sigma-Aldrich | C6277 | |
| Karboksymetyloceluloza | Sigma-Aldrich | 360384 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S1679 | |
| Bacto-agar | BD Biosciences | 214030 | |
| Płytki do bioanaliz | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 240845 |
Bibliografia
- Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels. Nature. 451, 86-89 (2008).
- Wilson, D. B. Cellulases and biofuels. Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).
- Qin, Y.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
