W niniejszym artykule przedstawiamy prostą i praktyczną technikę odlewu naczyniowego mózgu, która jest łatwa w wykonaniu i może być wykorzystana do obrazowania drzewa naczyniowego mózgu dorosłej myszy.
Artykuł metodologiczny
Odlewanie naczyń mózgowych dorosłej myszy do obrazowania 3D i analizy morfologicznej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obrazowanie naczyniowe ma kluczowe znaczenie w klinicznej diagnostyce i leczeniu chorób naczyniomózgową, takich jak malformacje tętniczo-żylne mózgu (BAVM). Modele zwierzęce są niezbędne do badania etiopatogenezy oraz potencjalnych terapii chorób naczyniomózgowych. Obrazowanie naczyń u dużych zwierząt jest stosunkowo proste. Jednakże, ze względu na koszt i dostępność genetycznie zmodyfikowanych linii myszy, pożądane jest opracowanie metod obrazowania naczyń w mysich modelach chorób mózgu. Obrazowanie drzewa naczyniowego mózgu myszy stanowi wyzwanie. U ludzi i większych zwierząt złotym standardem oceny angioarchitektury na poziomie makronaczyniowym (naczynia przewodzące) jest angiografia z użyciem kontrastu wprowadzanego przez cewnik pod kontrolą promieni rentgenowskich, co jest metodą nieodpowiednią dla małych gryzoni.
W niniejszym artykule przedstawiamy metodę odlewania naczyń mózgowych, która pozwala na uzyskanie trwałego szkieletu całego łoża naczyniowego, w tym tętnic, żył i naczyń włosowatych, który może być analizowany przy użyciu wielu różnych modalności. Całkowite odlewanie mikronaczyń układu naczyniowego mózgu myszy może być trudne, jednak wyzwania te zostaną omówione w tym protokole krok po kroku. Poprzez perfuzję wewnątrzsercową materiału do odlewania naczyń, odlewane są wszystkie naczynia organizmu. Następnie mózg można usunąć i wyklarować za pomocą organicznego rozpuszczalnika, salicylanu metylu. Trójwymiarowe obrazowanie naczyń krwionośnych mózgu można przeprowadzić w prosty i niedrogi sposób za pomocą dowolnego konwencjonalnego mikroskopu w świetle przechodzącym lub mikroskopu stereoskopowego. Odlew układu naczyniowego mózgu może być również obrazowany i kwantyfikowany przy użyciu mikrotomografii komputerowej (micro-CT)1. Ponadto, po obrazowaniu, odlew mózgu można zalać parafiną w celu przeprowadzenia analizy histologicznej.
Zaletą tej metody odlewania naczyń w porównaniu z innymi technikami jest jej szeroka adaptacja do różnych narzędzi analitycznych, w tym do analizy mikroskopowej w świetle przechodzącym, tomografii komputerowej (CT) dzięki radioprzepuszczalności materiału, a także analizy histologicznej i immunohistochemicznej. Tak efektywne wykorzystanie tkanek może ograniczyć liczbę używanych zwierząt i zredukować koszty. Niedawno zademonstrowaliśmy zastosowanie tej metody do wizualizacji nieregularnych naczyń krwionośnych w mysim modelu dorosłego BAVM na poziomie mikroskopowym2 oraz przedstawiliśmy dodatkowe obrazy zniekształconych naczyń uzyskane za pomocą mikro-CT. Choć metoda ta ma pewne wady i może nie być idealna dla wszystkich rodzajów analiz, jest to prosta i praktyczna technika, której można łatwo się nauczyć i szeroko stosować do odlewania naczyń krwionośnych w całym organizmie.
Protokół
1. Oczyszczanie naczyń krwionośnych z krwi
- Zanurz mysz w narkozie poprzez podanie dootrzewnowe 100 mg/kg ketaminy z 10 mg/kg ksylazyny rozpuszczonych w 0,25 ml soli fizjologicznej.
- Po potwierdzeniu znieczulenia brakiem reakcji na uciśnięcie łapy, za pomocą nożyczek wykonać nacięcie klatki piersiowej tuż poniżej wyrostka mieczykowatego, przeciąć przeponę oraz naciąć tkanki między segmentem grzbietowym a brzusznym klatki piersiowej, aby odsłonić jamę klatki piersiowej. Odsłonić serce, odchylając mostek i przyległą ścianę klatki piersiowej, a następnie unieruchomić je kleszczykami hemostatycznymi. Otworzyć worek osierdziowy pęsetą, aby odsłonić serce.
- Włączyć pompę perfuzyjną (ciśnienie 100mmHg) podłączoną do roztworu ciepłego PBS z dodatkiem heparyny (5 unit/ml) w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C oraz do drenu z tępą igłą 22G na wylocie.
- Wprowadzić igłę do lewej komory, w pobliżu wierzchołka serca. Natychmiast naciąć prawy przedsionek, aby umożliwić odpływ krwi systemowej i kontynuować płukanie aż do całkowitego usunięcia krwi z krwiobiegu.
2. Perfuzja środka odlewiczego do układu naczyniowego
- Przygotować roztwór odlewniczy Microfil (Flow Tech, Inc. Carver, MA) zgodnie z protokołem producenta: wymieszać 5 ml rozcieńczalnika MV z 4 ml przefiltrowanego związku MV. Dodać 450μl (5%) katalizatora (utwardzacza MV). Czas pracy roztworu wynosi 20 minut, jednak należy go wymieszać bezpośrednio przed użyciem, aby zapewnić odpowiednią lepkość.
- Pobrać roztwór środka odlewniczego do strzykawki 10ml, przymocować do strzykawki tępą igłę 20G i napełnić igłę roztworem.
- Wprowadzić igłę do lewej komory poprzez ten sam otwór, który służył do wypłukiwania krwi. Przymocować igłę w miejscu wstrzyknięcia za pomocą kleszczyków hemostatycznych na sercu.
- Powoli wstrzykiwać roztwór środka odlewniczego do lewej komory z prędkością około 3 ml/min. Nadmierne ciśnienie może doprowadzić do nieprawidłowego przepływu środka odlewniczego lub potencjalnego pęknięcia naczyń.
- Obserwować oznaki prawidłowej perfuzji, w tym: widoczność środka odlewniczego w naczyniach jelit i wątroby, odbarwienie kończyn dystalnych oraz odbarwienie nosa i języka. W razie potrzeby skorygować położenie igły, aby uzyskać właściwą perfuzję.
3. Pobieranie i przetwarzanie tkanek
- Wyjąć mózg i umieścić w 4% paraformaldehydzie na noc w temperaturze 4°C.
- Odwodnić mózg, przenosząc go z paraformaldehydu bezpośrednio do EtOH o rosnącym stężeniu w temperaturze pokojowej: 25% EtOH przez 1 dzień; 50% EtOH przez 1 dzień; 75% EtOH przez 1 dzień; 95% EtOH przez 2 dni oraz 100% EtOH przez 2 dni.
- Przejrzystość tkanki mózgowej wokół naczyń krwionośnych uzyskać poprzez zanurzenie perfundowanego mózgu w salicylanie metylu na 2 dni w temperaturze pokojowej.
- Układ naczyniowy całego, niepociętego i przejrzystego mózgu można obrazować z mózgiem zanurzonym w salicylanie metylu pod mikroskopem stereoskopowym (Rys. 1) (mikroskop Leica MZFL III, Leica Microsystems, Bannockburn, IL) lub mikroskopem w świetle przechodzącym (Rys. 2) (Leica DM/LS, Leica Microsystems).
- W przypadku niepełnej przejrzystości tkanki można przeprowadzić ponowną klaryfikację. Z salicylanu metylu przenieść mózg do 95% EtOH na 2 dni, do 100% EtOH na 2 dni, a następnie ponownie do salicylanu metylu na 2 dni.
4. Obrazowanie mikro-CT lub zastosowanie histologiczne – przygotowanie tkanek
- Mózg można obrazować za pomocą mikro-CT bezpośrednio po klarowaniu lub po rehydratacji (Rys. 4).
- Aby przygotować tkankę mózgu do analizy histologicznej, należy przeprowadzić rehydratację mózgu poprzez seryjne rozcieńczanie EtOH: 100% EtOH przez 1 dzień; 95% EtOH przez 1 dzień; 75% EtOH przez 1 dzień; 50% EtOH przez 2 dni; 25% EtOH przez 2 dni, a następnie przechowywać w PBS. Mózg można następnie zatopić w parafinie zgodnie ze standardową procedurą.
5. Reprezentatywne wyniki
Po odlewaniu naczyń krwionośnych unaczynienie mózgu można zaobserwować makroskopowo na powierzchni mózgu (Rys. 1A). Drzewo naczyniowe wewnątrz miąższu można zwizualizować po przeprowadzeniu procesu klarowania (Rys. 1B). Szczegółową strukturę naczyniową można obrazować i analizować za pomocą mikroskopu w polu jasnym (Rys. 2), stereomikroskopu (Rys. 3) oraz mikro-tomografii komputerowej (micro-CT) (Rys. 4). Wykorzystując mikroskopię w polu jasnym, można oglądać unaczynienie w różnych płaszczyznach ogniskowania bez konieczności sekcjonowania mózgu (Rys. 2A), a także pojedyncze naczynia mikrokrążenia przy większym powiększeniu (Rys. 2B). Pod stereomikroskopem można zobaczyć całą strukturę naczyniową w jednej płaszczyźnie ogniskowania, co pozwala na lepszą wizualizację trójwymiarowej budowy unaczynienia mózgu (Rys. 3). Obrazy wykonane pod mikroskopem stereoskopowym mogą przedstawiać morfologię dużych naczyń i unaczynienie całego mózgu, lecz brakuje im szczegółów widocznych na zdjęciach wykonanych za pomocą mikroskopii w polu jasnym (Rys. 2B). Technika ta pozwoliła nam wykryć nieregularne naczynia w naszym eksperymentalnym dorosłym modelu mysim BAVM2. Rysunek 5 przedstawia przykład tych samych nieregularnych naczyń wykrytych za pomocą mikro-tomografii komputerowej (Rys. 5A) oraz mikroskopu w polu jasnym (Rys. 5B). Wspólnie dane te pokazują, że po odlewaniu naczyń można analizować tę samą próbkę za pomocą wielu narzędzi obrazowych.
Rysunek 1. Cały mózg myszy po odlewie naczyniowym. Przed (A) i po (B) klarowaniu za pomocą rozpuszczalnika w postaci salicylanu metylu. Naczynia są wyraźnie widoczne na powierzchni mózgu (A) oraz w miąższu po przeprowadzeniu procedury klarowania (B).
Rycina 2. Obrazy z mikroskopu w świetle przechodzącym utrwalonego odlewu naczyniowego mózgu po procesie klarowania. Mózg może być obrazowany w różnych płaszczyznach i przy różnych powiększeniach. Pasek skali 200μm (A) oraz 50μm (B).
Rycina 3. Obraz z mikroskopu stereoskopowego przy powiększeniu 1x przedstawiający całe unaczynienie mózgowe dorosłej myszy w widoku grzbietowym.
Rysunek 4. Obraz z mikro-tomografii komputerowej (micro-CT) tego samego całego mózgu dorosłej myszy przedstawionego na Rysunku 3, widzianego od strony grzbietowej.
Rysunek 5. Zastosowanie metody odlewu naczyniowego w celu wykrycia malformacji tętniczo-żylnej mózgu. A) Skan micro-CT odlewu naczyniowego mózgu przedstawia obszar powiększonych, nieregularnych naczyń przypominających AVM w prawej półkuli w widoku brzuszny. Powiększony obraz obszaru (biała ramka) przedstawiono po prawej stronie. B) Te same nieregularne naczynia zobrazowane pod mikroskopem w polu jasnym przy powiększeniu 50x. Pasek skali 50 μm.
Dyskusja
Przedstawiamy w niniejszym opracowaniu metodę odlewania naczyń mózgowych dorosłych myszy, która umożliwia obrazowanie z wykorzystaniem różnych modalności. Zastosowanie tej metody w modelu choroby BAVM pozwala na analizę 3D nieregularnych naczyń. Potencjalne przyszłe badania obejmują kwantyfikację obrazów mikro-CT, analizę histologiczną tkanek oraz diagnostykę progresji chorób naczyniowych.
Typowe problemy i sugestie ich rozwiązywania
Pełna perfuzja naczyń krwionośnych mózgu nie zawsze zostaje osiągnięta. Wyzwaniem jest uzyskanie ciśnienia wystarczającego do dotarcia do dystalnych naczyń krwionośnych bez przerwania lewego przedsionka lub aorty. Aby temu zapobiec, należy stosować stałe ciśnienie wynoszące około 100mmHg. Należy również skorygować położenie igły, aby zapewnić odpowiedni odpływ środka odlewowego do aorty. Ważne jest, aby tętnice szyjne nie były uciśnięte, co umożliwi dotarcie środka odlewowego do naczyń mózgowych. Krytyczne procedury, które korelują z poprawą perfuzji małych naczyń, to: (1) prawidłowe usunięcie krwi z naczyń; (2) filtracja środka odlewowego oraz (3) odpowiednie umieszczenie igły podczas wstrzykiwania środka odlewowego. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć wstrzyknięcia środka odlewowego do lewego przedsionka i płuca. Inni badacze z powodzeniem przeprowadzili perfuzję naczyń mózgowych myszy3 i szczura4 bez stosowania dodatkowych procedur. Analiza manualna naczyń perfundowanych Microfil i barwionych kontrastowo hematoksyliną wykazała 93% perfuzji światła naczyń5. Należy zawsze wyrzucić lub całkowicie wyczyścić każde narzędzie, które miało kontakt ze środkiem odlewowym, ponieważ polimeryzuje on szybko i narzędzia nie mogą być używane u wielu osobników. Przejaśnianie otaczającej tkanki mózgu myszy może być trudne. Po zanurzeniu w salicylanie metylu tkanka może nadal wydawać się nieprzezroczysta, co utrudnia obrazowanie naczyń. Zapewnienie prawidłowego odwodnienia i przejaśnienia powinno rozwiązać ten problem. Umieszczenie tkanki mózgowej na kołysce podczas obróbki alkoholem i salicylanem metylu może poprawić klarowność tkanki.
Wady tej techniki
Ograniczenia tej techniki obejmują: (1) konieczność wstrzyknięcia roztworu środka odlewniczego natychmiast po wymieszaniu, ponieważ szybko gęstnieje on po dodaniu katalizatora; (2) środek odlewniczy łatwo wypełnia naczynia o dużym przewodnictwie, ale nie wypełnia w sposób niezawodny mniejszych naczyń, takich jak tętniczki (naczynia oporowe) i kapilary (naczynia odżywcze); oraz (3) nie jest to najlepszy kontrast radiopochłaniający do obrazowania mikro-CT, choć niektóre grupy preferują Microfil do mikro-CT1,6. Jednakże, stosując się do powyższych sugestii, w tym odpowiedniego umiejscowienia igły, pozycji naczynia i ciśnienia perfuzji, można uzyskać pełny odlew mniejszych naczyń. Zdolność do adaptacji do różnych narzędzi analitycznych sprawia, że środek ten jest cennym narzędziem do analizy struktury naczyniowej mózgu, w tym krążenia tętniczego i żylnego, z różnych perspektyw.
Zastosowania techniki
Zaletą tej metody jest jej szeroki potencjał aplikacyjny. Odlew wypełnia wszystkie naczynia, w tym tętnice, żyły i kapilary wszystkich tkanek w organizmie, dzięki czemu można analizować struktury naczyniowe w wielu organach różnych gatunków. Wcześniej inne grupy stosowały tę perfuzję w przypadku naczyń dużych7 i małych8 u ludzi, małp9, owiec10, szczurów4,11,12 i myszy3,13. Przedstawiamy obecnie dowody na wykorzystanie tej techniki w analizie struktury mikronaczyń w mózgu myszy, zarówno w stanie zdrowym, jak i chorobowym2. Ponadto dostępne są roztwory Microfil o różnych lepkościach, umożliwiające perfuzję naczyń o różnych rozmiarach, oraz o różnych kolorach, co poprawia wizualizację naczyń w różnych organach. Na przykład kolor czerwony jest łatwo widoczny w bladym miąższu mózgu, a żółty dobrze kontrastuje z ciemnoczerwonym mięśniem sercowym. Co więcej, ponieważ materiał jest radioprzepuszczalny, układ naczyniowy może być obrazowany za pomocą mikrotomografii komputerowej (micro-CT) w celu uzyskania obrotowego obrazu 3D. Tkanka po obrazowaniu może być również wykorzystana do wykonania przekrojów parafinowych i analizy histologicznej.
Wnioski
Prezentujemy tutaj protokół wykonania odlewu naczyniowego naczyń krwionośnych mózgu dorosłej myszy, który może być dostosowany przy użyciu różnych technik analitycznych do badania struktury morfologicznej układu naczyniowego mózgowia. Przedstawiliśmy również dowody na zastosowanie tej metody w modelu stanu chorobowego BAVM, reprezentowanego przez powiększone, nieregularne naczynia, które przekierowują krew z krążenia tętniczego do żylnego. Dostępnych jest wiele metod odlewania naczyniowego. Przedstawiony tutaj prosty protokół wykonania odlewu naczyniowego może służyć jako narzędzie do badania układu naczyniowego mózgu dorosłej myszy z wykorzystaniem różnych modalności obrazowania.
Oświadczenia
Procedury eksperymentalne z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco (UCSF).
Podziękowania
Autorzy dziękują Voltaire Gungab za pomoc w przygotowaniu rękopisu. Praca ta była częściowo wspierana przez granty z: National Institutes of Health (T32 GM008440 dla E.J. Walker, R01 NS27713 dla W.L. Young, P01 NS44155 dla W.L. Young i H. Su oraz R21 NS070153 dla H. Su) oraz American Heart Association (AHA 10GRNT3130004 dla H. Su).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Microfil | FlowTech | MV130 | termin przydatności 4 miesiące |
| Salicylan metylu | Fisher Scientific | O3695-500 | do klarowania tkanki |
Bibliografia
- Bolland, B. J., Kanczler, J. M., Dunlop, D. G., Oreffo, R. O. Development of in vivo muCT evaluation of neovascularisation in tissue engineered bone constructs. Bone. 43, 195-202 (2008).
- Walker, E. J. Arteriovenous malformation in the adult mouse brain resembling the human disease. Ann. Neurol. , Forthcoming (2011).
- Iqbal, U. Kinetic analysis of novel mono- and multivalent VHH-fragments and their application for molecular imaging of brain tumours. Br. J. Pharmacol. 160, 1016-1028 (2010).
- Fukunaga, A., Kawase, T., Uchida, K. Functional recovery after simultaneous transplantation with neuro-epithelial stem cells and adjacent mesenchymal tissues into infarcted rat. 145, 473-480 (2003).
- Chugh, B. P. Measurement of cerebral blood volume in mouse brain regions using micro-computed tomography. Neuroimage. 47, 1312-1318 (2009).
- Marxen, M. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Med. Phys. 31, 305-313 (2004).
- Barger, A. C., Beeuwkes, R., 3rd, L. ainey, L, L., Silverman, K. J. Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis. N. Engl. J. Med. 310, 175-177 (1984).
- Fossett, D. T., Caputy, A. J. Operative Neurosurgical Anatomy. , Thieme Medical Publishers. New York. (2002).
- Reynolds, D. G., Brim, J., Sheehy, T. W. The vascular architecture of the small intestinal mucosa of the monkey (Macaca mulatta). Anat. Rec. 159, 211-218 (1967).
- Bernard, S., Luchtel, D. L., Polissar, N., Hlastala, M. P., Lakshminarayan, S. Structure and size of bronchopulmonary anastomoses in sheep lung. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 286, 804-813 (2005).
- Brady, J. M., Cutright, D. E. A new technique of measuring blood vessel volume in bone applied to the mandible and humerus of the rat. Anat. Rec. 170, 143-146 (1971).
- Evan, A. P., Dail, W. G. Efferent arterioles in the cortex of the rat kidney. Anat. Rec. 187, 135-145 (1977).
- Murphy, P. A. Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).
Przedruki i uprawnienia
