Artykuł metodologiczny

Wprowadzenie do techniki ukierunkowanego niszczenia mikropęcherzyków za pomocą ultradźwięków

15.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2963

⸱

12 czerwca 2011

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, JABSOM, University of Hawaii

W tym artykule

Podsumowanie

Celowana destrukcja mikropęcherzyków za pomocą ultradźwięków (UTMD) może być wykorzystywana do ukierunkowanego, miejscowego dostarczania cząsteczek bioaktywnych, w tym genów terapeutycznych, do organów docelowych dostępnych dla fal ultradźwiękowych, takich jak serce i wątroba1-6.

Streszczenie

W metodzie UTMD cząsteczki biologicznie czynne, takie jak ujemnie naładowane wektory plazmidowego DNA kodujące interesujący gen, są dodawane do kationowych otoczek mikrobąbelkowych środków kontrastowych7-9. U myszy te mikrobąbelki przenoszące wektory mogą być podawane dożylnie lub bezpośrednio do lewej komory serca. U większych zwierząt mogą być one również wprowadzane za pomocą cewnika wewnątrzwieńcowego. Następnie dostarczanie z krwiobiegu do organu docelowego odbywa się poprzez kawitację akustyczną przy częstotliwości rezonansowej mikrobąbelków. Prawdopodobne jest, że energia mechaniczna generowana przez rozpad mikrobąbelków prowadzi do przejściowego tworzenia się porów w komórkach śródbłonka mikrokrążenia w docelowym obszarze lub pomiędzy nimi10. W wyniku tego efektu sonoporacji zwiększa się wydajność transfekcji do i przez komórki śródbłonka, a wektory kodujące transgen są odkładane w otaczającej tkance. Plazmidowe DNA pozostające w krwiobiegu jest szybko degradowane przez nukleazy obecne we krwi, co dodatkowo zmniejsza prawdopodobieństwo dostarczenia do tkanek niedданanych działaniu ultradźwięków i prowadzi do wysoce specyficznej transfekcji organu docelowego.

Protokół

1. Przygotowanie roztworu zapasowego mikropęcherzyków

  1. W 10 ml PBS wymieszać 20 mg 1,2-dipalmitoylo-sn-glycero-3-fosfatydylocholiny i 50 mg 1,2-dipalmitoylo-sn-glycero-3-fosfatydyloetanolaminy z 1 g glukozy.
  2. Podgrzewać mieszaninę w łaźni wodnej w temperaturze wrzenia przez 20-30 minut, mieszając pipetą co 5 minut.
  3. Roztwór można przechowywać w temperaturze 4°C do 6 miesięcy.

2. Przygotowanie mikropęcherzyków

  1. Pobrać 250 μl przygotowanego roztworu zapasu mikropęcherzyków i inkubować w temperaturze 40°C przez 15 minut.
  2. Podgrzany roztwór mikropęcherzyków przenosi się następnie do mikropopyczki o pojemności 1,5 mL zawierającej 50 μl glicerolu.
  3. Dodać 1-2 mg oczyszczonego plazmidowego DNA kodującego konstrukt ekspresyjny dla interesującego genu (oczyszczonego w tym przykładzie za pomocą zestawu Qiagen Endotoxin free MegaPrep kit, Qiagen, Germantown, MD, przy optymalnym stężeniu 4mg/ml). Dodać fosforanowy bufor solny (PBS) do uzyskania końcowej objętości 500 μl. W celu zapewnienia sterylności stosuje się preparaty Qiagen maxipreps wolne od endotoksyn oraz sterylny PBS.
  4. Powietrze w mikropopyczce zastępuje się następnie gazem octafluoropropanem.
  5. Mikropopyczkę wstrząsa się następnie energicznie w amalgamatorze stomatologicznym przez 20 sekund.
  6. Nadfazę zawierającą pozostałe DNA i bufor, które nie związały się z mikropęcherzykami, ostrożnie usuwa się, a warstwę mikropęcherzyków płucze trzykrotnie sterylnym PBS w celu usunięcia niezwiązanego DNA, umieszczając próbkę na lodzie pomiędzy każdym cyklem płukania. Zazwyczaj osiągamy wydajność wiązania na poziomie 30-40%. Wszystkie odczynniki są sterylne, a podczas pracy zachowana jest szczególna ostrożność w celu zminimalizowania kontaminacji.
  7. Mikropęcherzyki z wiązanym plazmidowym DNA umieszcza się następnie na lodzie do dwóch godzin przed użyciem.
  8. Nadfazę usuniętą z mikropopyczki po mieszaniu i płukaniu PBS-em można wykorzystać do oznaczenia stężenia niezwiązanego DNA, a analogicznie ilości DNA związanego (na podstawie znanego stężenia początkowego), mierząc gęstość optyczną tego roztworu przy długości fali 260nm za pomocą spektrofotometru.

3. Kalibracja sprzętu

  1. Przed pierwszym użyciem przetwornik kawitacyjny 1 MHz musi zostać skalibrowany, aby zapewnić odpowiedni indeks mechaniczny i powtarzalność impulsów. Zanurzalny przetwornik 1 MHz, 13 mm, niefokusowany jest podłączony do generatora funkcji/dowolnych przebiegów 20 MHz za pomocą wzmacniacza mocy.
  2. Przetwornik umieszcza się w plastikowym pojemniku wypełnionym wodą, kierując go bezpośrednio na hydrofon, który został podłączony do oscyloskopu 50 MHz poprzez wzmacniacz ładunkowy.
  3. Kształt fali, częstotliwość, amplituda, cykl serii impulsów oraz wzmocnienie mocy mogą być modyfikowane w celu uzyskania odpowiedniego cyklu pracy i indeksu mechanicznego optymalnego dla wywołania kawitacji mikropęcherzyków. W tym konkretnym eksperymencie system został skalibrowany do indeksu mechanicznego odpowiadającego wartości ~1,3 przy 1 MHz.

4. Dostarczanie mikropęcherzyków i UTMD

  1. Przed podaniem mikropęcherzyków i zastosowaniem UTMD, myszy C57BL/6 poddano znieczuleniu za pomocą ketaminy w dawce 10mg/kg i ksylazyny w dawce 5mg/kg poprzez wstrzyknięcie doszpikowe (IP).
  2. Mikropęcherzyki podano dożylnie poprzez bezpośrednią iniekcję do lewej komory serca lub poprzez kaniulację żyły ogonowej. W przypadku bezpośredniej iniekcji do serca, objętość do 10 μl roztworu mikropęcherzyków obciążonych plazmidowym DNA wstrzykuje się za pomocą igły 30G wprowadzonej w 4tej przestrzeni międzyżebrowej przedniej, pod kontrolą wizualizacji ultrasonograficznej, do lewej komory serca.
  3. Bolus roztworu mikropęcherzyków w wyniku wtrysku do lewej komory jest wizualizowany przy użyciu wysokoczęstotliwościowego przetwornika ultradźwiękowego 38 MHz firmy Visual Sonics, umieszczonego w pozycji stacjonarnej na klatce piersiowej myszy w widoku wzdłużnym, z zastosowaniem systemu obrazowania Vevo 210 firmy VisualSonics. Wszystkie strzykawki i igły są sterylne, co zapewnia możliwie najbardziej sterylne środowisko dla tych iniekcji.
  4. Bezpośrednio po wstrzyknięciu przeprowadza się niszczenie mikropęcherzyków przez około 5 minut, używając drugiego, mniejszego przetwornika niskiej częstotliwości 1,0 MHz trzymanego bezpośrednio nad wybranym narządem, aby skierować proces niszczenia do tego regionu. W tym przykładzie ultradźwięki podawano do wątroby przy częstotliwości powtarzania impulsów 1,0 MHz, z indeksem mechanicznym wynoszącym około 1,3-1,5 oraz okresem powtarzania impulsów 10 ms na każde 20 cykli. Alternatywnie, impulsy można zsynchronizować z EKG myszy (nie pokazano tego w tym eksperymencie), stosując serie 3 klatek ultradźwięków co 4-6 cykli serca. Osiągamy większą efektywność transfekcji przy zastosowaniu protokołów, które pozwalają łożu kapilarnemu na ponowne wypełnienie się pęcherzykami pomiędzy seriami ultradźwięków.

5. Alternatywna metoda dostarczania

Zdecydowaliśmy się wyróżnić wstrzyknięcie dokomorowe ze względu na złożoność procedury, jednak w wielu przypadkach, takich jak przedłużona infuzja mikropęcherzyków, preferowaną metodą jest wstrzyknięcie do żyły ogonowej. W przypadku metody dostarczania mikropęcherzyków drogą żylną przez ogon, mysz jest znieczulana w ten sam sposób. Strzykawka zawierająca mikropęcherzyki z wiązanym plazmidowym DNA jest podłączona do igły 27G/cewnika żyły ogonowej. Cewnik żyły ogonowej wprowadza się do dystalnej jednej trzeciej prawej lub lewej żyły bocznej biegnącej wzdłuż ogona myszy. Strzykawkę z mikropęcherzykami umieszcza się w pompie infuzyjnej, która automatycznie podaje jednolity, zaprogramowany objętość roztworu w określonym czasie. Zazwyczaj infundujemy 20-30μl z prędkością 3ml/hour.

Wykorzystanie zwierząt

Wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z zasadami dobrej praktyki hodowlanej, określonymi przez odpowiednie krajowe i/lub lokalne organy ds. dobrostanu zwierząt, a wszystkie prace ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez właściwy komitet (University of Hawaii Institutional Animal Care and Use Committee, numer zatwierdzenia 07-10-3). Stosowano odpowiednią anestezję (ketamina/ksylazyna) i zapewniono dostęp do środków przeciwbólowych (Bupivicaine i Buprenorphine), choć nie były one wymagane.

6. Reprezentatywne wyniki:

Skuteczność dostarczania plazmidowego DNA za pomocą UTMD można ocenić za pomocą różnych metod, w zależności od genów zakodowanych w konstrukcie, takich jak między innymi: obrazowanie lucyferazy in vivo, barwienie B-gal ex vivo i/lub immunohistologia. W szczególności obrazowanie bioluminescencyjne in vivo pozwala na seryjne monitorowanie obecności i czasu trwania ekspresji genów u myszy transfekowanych plazmidem kodującym bioluminescencyjny gen reporterowy (lucyferazę). Do obrazowania bioluminescencyjnego wykorzystuje się system obrazowania Xenogen In Vivo Imaging System (IVIS) (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Obrazy wszystkich myszy wykonuje się zazwyczaj w pierwszym dniu po transfekcji za pomocą UTMD, a następnie powtarza co trzy do czterech dni, aż do momentu, gdy ekspresja genu bioluminescencyjnego nie będzie już wizualnie wykrywalna przez system (Rycina 1). Aby przygotować myszy do obrazowania bioluminescencyjnego, zwierzęta otrzymują najpierw wstrzyknięcie domięśniowe (IP) sondy reporterowej lucyferazy D-lucyferyny (Caliper Life Sciences), a następnie są znieczulane około 3 minuty później. Przez około 10 minut oczekuje się na biodystrybucję substratu D-lucyferyny, zanim zwierzę zostanie umieszczone w komorze obrazującej IVIS i wykonany zostanie skan całego ciała. Podczas akwizycji mierzone są fotony emitowane w wyniku fotochemicznej reakcji lucyferazy świetlika z D-lucyferyną. Rycina 1 przedstawia również podobne obrazowanie bioluminescencyjne IVIS wątroby po zastosowaniu UTMD, a Rycina 2 jest obrazem epifluorescencyjnym (10X) transfekowanej wątroby z wykorzystaniem przeciwciała pierwszorzędowego anty-lucyferazy (Sigma-Aldrich) i sprzężonego z AlexFluor-568 przeciwciała wtórnego (Invitrogen). Wyraźnie widać, że transfekcja wątroby za pomocą UTMD wpłynęła nie tylko na komórki śródbłonka, ale również na hepatocyty.

Obrazowanie IVIS myszy traktowanych UTMD; celowanie w serce/wątrobę; intensywność fluorescencji; dane porównawcze.
Rycina 1. Obrazowanie Xenogen/IVIS myszy leczonych za pomocą UTMD w obrębie serca. (A) Myszy kontrolne ujemne: plazmid + PBS następnie UTMD skierowany na serce, (B) Mysz traktowana: plazmid + mikropęcherzyki, a następnie ukierunkowane na serce UTMD i (C) Mysz leczona: Plazmid + mikropęcherzyki, a następnie celowana w wątrobę UTMD.

Immunohistochemia wątroby UTMD, anty-lucyferaza w kolorze czerwonym, obraz mikroskopowy, porównanie plazmidów.
Rysunek 2. Immunohistochemia wątroby UTMD (anty-lucyferaza w kolorze czerwonym). (A) Plazmid bez UTMD oraz (B) Plazmid z UTMD. Obraz konfokalny (10X); jądra komórkowe zabarwione na niebiesko DAPI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

UTMD stanowi nowatorskie podejście do dostarczania genów. Jako technologia platformowa może być łączone z wieloma potencjalnymi strategiami terapii genowej w celu dostarczania licznych cząsteczek bioaktywnych w sytuacjach, gdy pożądany jest wysoki stopień specyficzności tkankowej. Głównym ograniczeniem biologicznym tej techniki jest niska wydajność transfekcji. Innym istotnym czynnikiem jest dostępność organu docelowego dla ultradźwięków, która może być znacznie ograniczona przez przyległe kości lub powietrze. Technika t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Wsparcie finansowe obejmowało granty NHLBI HL080532, NHLBI HL073449, NCRR RR16453 oraz krajowy grant AHA National Grant-in Aid Award (przyznany dla RVS). Szczególne podziękowania kierujemy do grupy Distance Course Design and Consulting (DCDC), dcdcgroup.org, za pomoc w produkcji wideo, a także do Departamentu Edukacji USA (Grant nr P336C050047), który sfinansował działalność DCDC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2-dipalmitylo-sn-glycero-3-fosfatydylocholinaSigma-AldrichP-5911składnik lipidowej otoczki mikropęcherzyka
1,2-dipalmitylo-sn-glycero-3-fosfatydyloetanoloaminaSigma-AldrichP-3275składnik lipidowej otoczki mikropęcherzyka
glukozaSigma-AldrichG5400uważane za stabilizujące mikropęcherzyki
bufor fosforanowo-solnySigma-AldrichP5368
glicerolSigma-AldrichG5516uważane za zapobiegające koalescencji mikropęcherzyków
Gaz oktafluoropropanuAirgasPonieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do przetłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przełożyć na język polski zgodnie z wytycznymi.gaz obojętny stosowany w zastosowaniach klinicznych
amalgamator dentystyczny VialMixBristol-Myers SquibbNie dotyczy
przetwornik niefokusujący, 1 MHz, 13 mmOlympus CorporationA303S-SU
Generator funkcji i przebiegów dowolnych 20 MHzAgilent Technologies33220A
Wzmacniacz mocyKrohn-Hite Co.Model 7500
HydrofonBruel and KjaerTyp 1803
Wzmacniacz ładunkowyBruel and KjaerTyp 2634
Oscyloskop 500 MHzLeCroy9354L
VisualSonics’ System obrazowania Vevo 2100 z przetwornikiem 34 MHzVisualSonics, inc.2100
cewniki do żyły ogonowej 27G o długości jednej calaVisualSonics, inc.Brak danych
pompa infuzyjna Genie PlusKent ScientificGENIE

Bibliografia

  1. Bekeredjian, R., Chen, S., Frenkel, P. A., Grayburn, P. A., Shohet, R. V. Ultrasound-targeted microbubble destruction can repeatedly direct highly specific plasmid expression to the heart. Circulation. 108, 1022-1026 (2003).
  2. Bekeredjian, R., Katus, H. A., Kuecherer, H. F. Therapeutic use of ultrasound targeted microbubble destruction: a review of non-cardiac applications. Ultraschall Med. 27, 134-140 (2006).
  3. Chen, S. Regeneration of pancreatic islets in vivo by ultrasound-targeted gene therapy. Gene Ther. 17, 1411-1420 (2010).
  4. Miao, C. H. Ultrasound enhances gene delivery of human factor IX plasmid. Hum Gene Ther. 16, 893-905 (2005).
  5. Shimoda, M., Chen, S., Noguchi, H., Matsumoto, S., Grayburn, P. A. In vivo non-viral gene delivery of human vascular endothelial growth factor improves revascularisation and restoration of euglycaemia after human islet transplantation into mouse liver. Diabetologia. 53, 1669-1679 (2010).
  6. Shohet, R. V. Echocardiographic destruction of albumin microbubbles directs gene delivery to the myocardium. Circulation. 101, 2554-2556 (2000).
  7. Sirsi, S., Borden, M. Microbubble Compositions, Properties and Biomedical Applications. Bubble Sci Eng Technol. 1, 3-17 (2009).
  8. Li, H. L. Ultrasound-targeted microbubble destruction enhances AAV-mediated gene transfection in human RPE cells in vitro and rat retina in vivo. Gene Ther. 16, 1146-1153 (2009).
  9. Lindner, J. R. Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions. Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).
  10. Newman, C. M., Bettinger, T. Gene therapy progress and prospects: ultrasound for gene transfer. Gene Ther. 14, 465-475 (2007).
  11. Vancraeynest, D. Myocardial injury induced by ultrasound-targeted microbubble destruction: evidence for the contribution of myocardial ischemia. Ultrasound Med Biol. 35, 672-679 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przygotowanie mikrop cherzyk wdostarczanie plazmidowego DNAkawitacja akustycznaefekt sonorporacjitransfekcja kom rek r db onkaobrazowanie bioluminescencyjnepodawanie mikrop cherzyk wkalibracja ultrad wi k wanaliza ekspresji gen w

Powiązane artykuły