Solidna generacja komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych populacji komórek macierzystych

Podsumowanie

Ten artykuł skupi się na generowaniu ludzkiej endodermy wątrobowej z populacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.

Streszczenie

Pomimo postępu w modelowaniu toksyczności leków dla ludzi, wiele związków zawodzi podczas badań klinicznych z powodu nieprzewidzianych skutków ubocznych. Koszty badań klinicznych są znaczne, dlatego tak ważne jest, aby na wczesnym etapie opracowywania i wdrażania większej liczby predykcyjnych badań toksykologicznych (Greenhough i wsp. 2010). Ludzkie hepatocyty reprezentują obecny złoty standard oceny toksyczności leków, ale są ograniczonym zasobem, który wykazuje zmienną funkcję. W związku z tym rutynowo stosuje się unieśmiertelnione linie komórkowe i modele tkanek zwierzęcych ze względu na ich obfitość. Chociaż oba źródła mają charakter informacyjny, są one ograniczone przez słabe funkcjonowanie, zmienność gatunków i/lub niestabilność w kulturze (Dalgetty i in. 2009). Pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC) są atrakcyjnym alternatywnym źródłem ludzkich komórek podobnych do hepatocytów (HLC) (Medine i wsp. 2010). PSC są zdolne do samoodnawiania się i różnicowania do wszystkich typów komórek somatycznych występujących u osób dorosłych, a tym samym stanowią potencjalnie niewyczerpane źródło zróżnicowanych komórek. Opracowaliśmy procedurę, która jest prosta, wysoce wydajna, podatna na automatyzację i daje funkcjonalne ludzkie HLC (Hay i in. 2008 ; Fletcher i wsp. 2008 ; Hannoun i wsp. 2010 ; Payne i wsp. 2011 oraz Hay i wsp. 2011). Wierzymy, że nasza technologia doprowadzi do skalowalnej produkcji HLC do odkrywania leków, modelowania chorób, budowy urządzeń pozaustrojowych i być może terapii transplantacyjnych opartych na komórkach.

Protokół

1. Wstępne przygotowanie wszystkich zapasów chemicznych i powlekanie wyrobów z tworzyw sztucznych

Wszystkie kroki należy przeprowadzić w kapturze do hodowli tkanek w warunkach aseptycznych.

1. Przygotowanie ludzkiego zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (hbFGF)
   1. Przygotuj 10% roztwór BSA w PBS i przefiltruj przez filtr 0,22 μm.
   2. Z 10% roztworu BSA przygotuj 0,2% roztwór BSA.
   3. Dodać 10 ml 0,2% roztworu BSA/100 μg hbFGF.
   4. Wstępnie zwilż filtr 0,22 μm, filtrując 5 ml 10% roztworu BSA przez filtr. Wyrzuć 10 ml płynu do płukania BSA.
   5. Przefiltruj hbFGF przez wstępnie umyty filtr.
   6. Porcję hbFGF należy umieścić w sterylnych eppendorfach i przechowywać w temperaturze -20°C.
2. Przygotowanie ludzkiego roztworu podstawowego Activin A
   1. Dodaj 1 ml 0,2% BSA do strzykawki i wstępnie zwilż filtr.
   2. Rozcieńczyć aktywinę A w 0,2% BSA do stężenia podstawowego 100 μg/ml.
   3. Przefiltrować roztwór Activiny A i podwielokrotność w sterylnych eppendorfach, przechowywać w temperaturze -20°C.
3. Przygotowanie roztworu podstawowego myszy Wnt3a
   1. Dodać 200 μl PBS do fiolki 2 μg Wnt3a do stężenia podstawowego 10 μg/ml.
   2. Podwielokrotność podawania w sterylnych eppendorfach i przechowywać w temperaturze -20°C.
4. Przygotowanie roztworu podstawowego HGF dla ludzi (1000X)
   1. Rozcieńczyć HGF w PBS do stężenia podstawowego 10 μg/ml.
   2. Przefiltrować roztwór HGF i podwielokrotność w sterylnych eppendorfach, przechowywać w temperaturze -20°C.
5. Przygotowanie roztworu podstawowego onkostatyny M (1000X)
   1. Rozcieńczyć OSM w PBS do stężenia podstawowego 20 μg/ml.
   2. Przefiltrować roztwór OSM i podwielokrotność w sterylnych eppendorfach, przechowywać w temperaturze -20°C.
6. Powlekanie wyrobów z tworzyw sztucznych z kultur bakteriami Matrigel
   1. Rozmrozić 10 ml butelkę magazynową Matrigel przez noc w temperaturze 4°C na lodzie, a następnie dodać 10 ml KO-DMEM. Dobrze wymieszać za pomocą schłodzonych pipet i przechowywać 1 ml porcji w temperaturze -20°C.
   2. Rozmrażać porcję Matrigelu w temperaturze 4°C przez co najmniej 2 godziny lub przez noc, aby uniknąć tworzenia się żelu.
   3. Dodaj 5 ml zimnego KO-DMEM do matrycy, dobrze wymieszaj pipetą.
   4. Uzupełnić do 15 ml zimnym KO-DMEM i wymieszać za pomocą pipety.
   5. Dodać matrigel do płytki lub kolby, która ma być pokryta (tabela (i))

Talerz / Kolba Objętość / studzienka lub kolba Płytka 12-dołkowa 0,5 ml na studzienkę Płytka 6-dołkowa 1 ml na studzienkę 25 cm² kolby 2 ml na kolbę

Tabela 1. Zalecane objętości matrycy do powlekania typowych wyrobów z tworzyw sztucznych do hodowli hESC.

6. 6. Inkubować powlekaną płytkę lub kolbę przez noc w temperaturze 4°C lub pokojowej przez 1 godzinę przed użyciem.
   7. Płytki lub kolby, które zostały pokryte matrigelem, można przechowywać w temperaturze 4°C przez okres do 1 tygodnia. Powinny być wyraźnie oznaczone datą ich powlekania. W ciągu tygodnia należy wyrzucić wszystkie płytki lub kolby, które nie zostały użyte.
      1. Przed użyciem pozwól, aby powlekany pojemnik do hodowli osiągnął temperaturę pokojową w kapturze do hodowli tkankowych.
      2. Bezpośrednio przed użyciem należy odessać matrigel i dodać zawiesinę komórkową do studzienki lub kolby.

2. Rutynowa konserwacja kultur hESC i charakterystyka

1. Resuscytacja linii hESC
   1. Usunąć hESC z magazynu ciekłego azotu i szybko rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37°C.
   2. Ostrożnie przenieść zawiesinę komórkową do sterylnej probówki zawierającej kilka ml ciepłej pożywki.
   3. Granuluj komórki przez wirowanie @ niska prędkość przez 5 min (1000 obr./min).
   4. Odessać supernatant i bardzo delikatnie zawiesić komórki w ciepłym podłożu ES i rozłożyć na warstwie zasilającej MEF.
   5. Codziennie podawaj komórki świeżą pożywką ES, a po subkonfluencji komórki wymagają pasażowania.
2. Rutynowa konserwacja hESC
   Komórki ES hoduje się na płytkach lub kolbach pokrytych matrigelem. Komórki muszą być badane i karmione codziennie:
   1. Zbadaj pod mikroskopem pod kątem zanieczyszczeń, morfologii komórek i konfluencji.
   2. Zassać zużyte podłoże.
   3. Dodać odpowiednią objętość świeżej pożywki kondycjonowanej fibromnatami embrionalnymi myszy (MEF-CM) + ludzkiego bFGF (stężenie końcowe 4 ng / ml) lub innej pożywki wolnej od surowicy⁶.
3. Komórki pasażujące z kolagenazą
   Linie hESC (H1, H9 i RCM-1) będą osiągać zbieg co 5-7 dni po przejściu w stosunku podziału 1:3. Wczesne pasażowanie hESC w obecności zrębu rośnie wolniej, a czas na matrycy może stać się ważnym czynnikiem. Ludzkie EKM nie powinny być pozostawione dłużej niż 14 dni na tym samym matrycy ze względu na degradację matrycy i w tym przypadku może być konieczne przejście komórek w stosunku podziału 1:1 lub 1:2, jeśli komórki są subkonkurencyjne.
   
   Inkubacja enzymów
   1. Wszystkie kroki należy przeprowadzić w kapturze do hodowli tkankowych w warunkach aseptycznych.
   2. Upewnij się, że istnieje nowe naczynie lub kolba pokryta matryżelem przygotowane zgodnie z sekcją 1.6.
   3. Zdecyduj o żądanym współczynniku podziału komórek. Na decyzję o współczynniku podziału składa się wiele czynników:
      1. Wysoki poziom zrębu przy małej liczbie kolonii: może być pasażowany z powrotem do mniejszego rozmiaru studzienki lub może być pasażowany 1:1, co pozwoli pozbyć się części zrębu, a tym samym zwiększyć stosunek kolonii do zrębu, sprzyjając wzrostowi hESC.
      2. Wysoki poziom zrębu z dużymi koloniami, w zależności od liczby kolonii, może być przebyty 1:1 lub 1:2, jeśli jest wystarczająca liczba dużych kolonii hESC.
      3. Typowe rosnące hESC z niewielkim zrębem lub bez zrębu i/lub pewnym zróżnicowaniem mogą być pasażowane 1:2 lub 3.
      4. Odessać pożywkę ze studzienki lub kolby.
      5. Przemyć raz 2 ml PBS (-MgCl₂, -CaCl₂).
      6. Dodać odpowiednią objętość kolagenazy (200 U/ml rozcieńczonej w KO-DMEM) i inkubować w temperaturze 37°C przez 2-5 minut. Od 2 minut regularnie badaj pod mikroskopem (odstępy 1-minutowe). W momencie, gdy zróżnicowane komórki zaczynają się unosić, a kolonie zaczynają się podnosić na krawędzi, komórki są gotowe do przejścia.
   Scraping i łączenie komórek macierzystych
   3.  
      6. Odessać kolagenazę.
      7. Przemyć raz 2 ml PBS (-MgCl₂, -CaCl₂).
      8. Dodać odpowiednią objętość MEF-CM w zależności od proporcji podziału i za pomocą skrobaka do komórek fizycznie usunąć komórki z powierzchni studzienki lub kolby, a następnie delikatnie rozcierać, pipetując w górę i w dół 2-3 razy za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Ważne jest, aby hESC były przechowywane w skupiskach komórek i nie były rozbijane na pojedyncze komórki.
   Powtarzanie komórek macierzystych wątroby
   3.  
      9. Otrzymaną zawiesinę komórek należy ponownie przesiać na nowe kolby lub studzienki pokryte matriżelem.
      10. Uzupełnić objętość MEF-CM do 4 ml na dołek na płytce 6-dołkowej.
      11. Umieszczając komórki w inkubatorze, należy zamieszać pojemnik do hodowli tkankowej, aby zapewnić jak najbardziej równomierne rozmieszczenie kolonii, ponieważ kolonie mają tendencję do osadzania się w środku płytki/kolby do hodowli tkankowej, co wpływa na ponowne posiew i różnicowanie komórek.
4. Rutynowa charakterystyka populacji hESC za pomocą cytometrii przepływowej
   1. Populacje hESC są badane za pomocą cytometrii przepływowej raz w miesiącu pod kątem markerów komórek macierzystych, takich jak Oct 3/4, Tra 1-60 i SSEA-4.
   2. Populacje hESC są usuwane z ich substratu w postaci zawiesin pojedynczych komórek po 5-minutowym traktowaniu trypsyną/EDTA (Invitrogen).
   3. Zawiesić pojedyncze komórki w 1x10⁶ komórek/ml w PBS uzupełnionym 0,1% BSA i 0,1% azydkiem sodu.
   4. Preparaty komórkowe należy inkubować w temperaturze 4°C z odpowiednimi przeciwciałami przez 40 minut.
   5. Przemyć komórki dwukrotnie PBS uzupełnionym 0,1% BSA i 0,1% azydkiem sodu w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała i ponownego zawieszenia do końcowej objętości 100 μl i analizy metodą cytometrii przepływowej.
   6. Dane dla 30000-40000 zdarzeń "na żywo" są pozyskiwane dla każdej próbki za pomocą cytometru FACS Calibre wyposażonego w laser 488 nm i analizowane za pomocą oprogramowania CellQuest (Becton Dickinson, San Jose, CA). Niebarwione komórki są dołączane jako kontrole. Martwe i apoptotyczne komórki wraz ze szczątkami wykluczono z analizy za pomocą elektronicznej bramki na żywo przy parametrach rozproszenia do przodu i rozpraszania bocznego.

3. Różnicowanie hESC do endodermy wątrobowej

1. Przygotowanie pożywek do różnicowania hESC do endodermy wątroby. Całe przygotowanie pożywek powinno odbywać się w kapturze do hodowli tkankowych w warunkach aseptycznych.
   1. Przygotowanie podłoża gruntującego RPMI:B27 do różnicowania endodermy
      1. W przypadku pożywki RPMI-B27 wymieszaj RPMI 1640 (500 ml) i B27 (50x, 10 ml)
      2. Zamieszaj, aby wymieszać składniki.
      3. Dodaj wszystkie składniki do jednostki filtrującej i przefiltruj w próżni, przechowuj w temperaturze 4 °C.
   2. Przygotowanie pożywki SR-DMSO do różnicowania hepatocytów
      1. W przypadku pożywki SR-DMSO wymieszaj 80% KO-DMEM, 20% KO-SR, 0,5% L-glutaminy, 1% aminokwasów endogennych, 0,1 mM β-merkaptoetanolu i 1% DMSO.
      2. Przefiltrować roztwór w próżni, przechowywać w temperaturze 4 °C i porcji oraz w razie potrzeby przechowywać w temperaturze -20 °C.
      3. Użyć 4 ml na zagłębienie płytki 6-dołkowej i 6 ml na kolbę T25.
   3. Przygotowanie pożywki L15 do dojrzewania hepatocytów
      1. W przypadku pożywki L-15 wymieszaj 500 ml pożywki Leibovitz L-15, bulionu z fosforanu tryptozy (stężenie końcowe 8,3%), inaktywowaną termicznie płodową surowicę bydlęcą (stężenie końcowe 8,3%), 10 μM hydrokortyzonu 21-hemibursztynian, 1 μM insuliny (trzustka bydlęca), 1% L-glutaminy, 0,2% kwasu askorbinowego.
      2. Przefiltrować roztwór w próżni, przechowywać w temperaturze 4 °C i porcji oraz w razie potrzeby przechowywać w temperaturze -20 °C.
   4. Przygotowanie końcowego podłoża gruntującego RPMI:B27
      1. Dozować wymaganą objętość pożywki gruntującej do eksperymentu (1 ml na dołek płytki 6-dołkowej i 2 ml na kolbę T25).
      2. Dodaj aktywinę A do końcowego stężenia 100 ng/ml.
      3. Dodać rekombinowany Wnt3a do końcowego stężenia 50 ng/ml.
      4. Dobrze wymieszaj, a podłoże jest teraz gotowe do użycia.
      5. Ta końcowa pożywka powinna być codziennie przygotowywana na świeżo.
   5. Przygotowanie końcowej pożywki do dojrzewania L-15
      1. Dozować wymaganą objętość pożywki L-15 do eksperymentu (4 ml na dołek płytki 6-dołkowej i 6 ml na kolbę T25).
      2. Dodać HGF do końcowego stężenia 10 ng/ml.
      3. Dodać OSM do końcowego stężenia 20 ng/ml.
      4. Dobrze wymieszaj, a podłoże jest teraz gotowe do użycia.
      5. Ta końcowa pożywka powinna być codziennie przygotowywana na świeżo.
2. Gruntowanie hESC do ostatecznej endodermy
   1. Hodować hESC (H1, H9 i RCM-1) i rozmnażać na płytkach pokrytych matryżelem z mysim fibroblastem zarodkowym MEF-CM uzupełnionym bFGF.
   2. Zainicjuj różnicowanie wątroby, gdy hESC osiągną poziom konfluencji około 30%-60% (w zależności od linii hESC), zastępując MEF-CM pożywką kondycyjną (RPMI 1640-B27 uzupełnioną 100 ng/ml aktywiny A i 50 ng/ml Wnt3a.
   3. Komórki są hodowane w pożywce kondycjonującej przez 3 dni (zmiana pożywki co 24 godziny), a końcowa pożywka kondycjonująca z aktywiną A i Wnt3a jest przygotowywana na świeżo każdego dnia.
   4. Po 72 godzinach w pożywce gruntowej należy zmienić pożywkę na drugą pożywkę różnicującą (SR-DMSO) na 5 dni (zmiana pożywki co 48 godzin).
   5. W dniu 8 hodowli komórki w pożywce dojrzewającej i podtrzymującej (L-15) uzupełnione 10 ng / ml hHGF i 20 ng / ml OSM przez 9 dni (zmiana pożywki co 48 godzin). Pożywka do dojrzewania i utrzymania z hHGF i OSM jest przygotowywana na świeżo każdego dnia.
   6. Komórki stopniowo wykazują zmiany morfologiczne od kolczastego / trójkątnego kształtu do charakterystycznej morfologii wątroby wykazującej wielokątny wygląd (ryc. 2A).
   7. Schemat różnicowania wątrobowo-komórkowego:

4. Charakterystyka endodermy wątrobowej pochodzącej z hESC

1. Barwienie immunologiczne
   1. Przemyć HLC pochodzące z hESC PBS dwukrotnie, po 1 minutę każde płukanie.
   2. Utrwalić HLC za pomocą 4% PFA przez 20 minut w temperaturze pokojowej (komórki można przechowywać w PBS w temperaturze 4°C i barwić w późniejszym terminie). Ogniwa można również utrwalać lodowatym metanolem przez 10 minut w temperaturze -20°C.
   3. Umyj komórki dwukrotnie PBS, po 5 minut każde mycie.
   4. Inkubować komórki przez 2 minuty w temperaturze pokojowej ze 100% etanolem do barwienia jądrowego (ten etap nie jest wymagany, jeśli stosuje się utrwalanie metanolem).
   5. Umyj komórki dwukrotnie PBS, po 5 minut każde mycie.
   6. Zablokuj komórki za pomocą PBS/T (0,1% tween)/10% BSA na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   7. Usunąć bufor blokujący i dodać odpowiednie przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w PBS/T (0,1% tween)/1% BSA i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C z mieszaniem.
   8. Umyj komórki 3 razy PBS/T (0,1% tween)/1% BSA w temperaturze pokojowej, po 5 minut każde mycie.
   9. Dodać do komórek odpowiednie wtórne przeciwciało Alexa Fluor (1:400) rozcieńczone w PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności z mieszaniem.
   10. Umyj komórki 3 razy PBS, po 5 minut każde mycie.
   11. Zamontuj każdą studzienkę za pomocą MOWIOL 4-88 i DAPI (1:1000). Przykryj studzienkę szkiełkiem nakrywkowym, delikatnie dociskając szkiełko nakrywkowe, aby upewnić się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostało usunięte i przechowywać w temperaturze 4°C w ciemności.
2. Izolacja i ekstrakcja RNA
   1. Przemyć HLC pochodzące z hESC PBS i aspiratem.
   2. Dodać 1 ml odczynnika TRIZOL i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
   3. Zeskrob komórki i umieść w 1,5 ml eppendorf (przechowywać w temperaturze -80°C do późniejszego wykorzystania, jeśli to wymagane).
   4. Dodać 0,5 ml chloroformu do eppendorfa i wymieszać przez odwrócenie; upewnij się, że odbywa się to w dygestorium.
   5. Odwirować roztwór z prędkością 13 000 obr./min przez 15 minut w temperaturze 4°C.
   6. Zbierz warstwę wodną i umieść w czystym eppendorfie, upewnij się, że nie ma zanieczyszczeń z interfejsu.
   7. Dodaj 1 ml izopropanolu i wymieszaj, odwracając, pozostaw w temperaturze pokojowej na 10 minut, aby wytrącić RNA.
   8. Wirować z prędkością 13 000 obr./min przez 10 minut w temperaturze 4°C.
   9. Odessać supernatant i upewnić się, że nie naruszyć osadu RNA. Umyć 0,5 ml 70% etanolu i pozostawić w temperaturze pokojowej na 5 minut.
   10. Wirować z prędkością 8 000 obr./min przez 5 minut w temperaturze 4°C.
   11. Zassać etanol i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na 5-10 minut.
   12. Gdy cały etanol odparuje, zawiesić granulat w 30 μl wody dejonizowanej. Przechowuj RNA w temperaturze -80°C do późniejszego wykorzystania.
   13. Określ ilościowo stężenie RNA za pomocą nanokropli.
3. PCR z odwrotną transkrypcją
   1. Przygotuj reakcję przy użyciu wcześniej wyizolowanego RNA (200 ng), losowych heksamerów, nukleotydów (10 mM), odwrotnej transkryptazy i odpowiedniego buforu w cienkościennym 0,5 ml eppendorfie.
   2. Ustaw ujemną RT, powyższą reakcję bez odwrotnej transkryptazy.
   3. Umieść probówki w termocyklerze, maszynie do PCR i ustaw następujący program:
      1. 37°C - 5 minut (1 cykl)
      2. 42°C - 1 godzina (1 cykl)
      3. 95°C - 5 minut (1 cykl)
   4. Przechowuj cDNA w temperaturze -20°C do późniejszego wykorzystania, jeśli zajdzie taka potrzeba.
4. TAQMAN ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy odwrotnej transkryptazy Zbierz komórki w różnych punktach czasowych w całym protokole różnicowania. Ekstrahować RNA i przeprowadzić qPCR z odwrotną transkrypcją przy użyciu następujących starterów i protokołu Test na żądanie (Applied Biosystems):
   1. paź 4 Hs03005111_g1
   2. Nanog Hs02387400_g1
   3. Albumina Hs00910225_m1
   4. Alfa-fetoproteina Hs00173490_m1

Dla izolacji i ekstrakcji RNA patrz sekcja 3.3.2

1. Odwrotna transkrypcja i TAQMAN qPCR
   1. Weź 1 μg RNA i dokonaj odwrotnej transkrypcji do cDNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji Superscript III firmy Invitrogen, zgodnie z instrukcjami producenta.
   2. 1 μl cDNA użytego w 25 μl reakcji TAQMAN składającej się z odpowiednich starterów z Applied Biosystems, 18S rybosomalnych starterów kontrolnych i 2x platynowego qPCR supermix UDG firmy Invitrogen z roxem i odpowiednią objętością wody.
   3. Dobrze wymieszać i umieścić 10 μl każdej próbki w dwóch dołkach z 96 lub 384-dołkową płytką qPCR.
   4. Po załadowaniu wszystkich próbek wraz z odpowiednimi kontrolami) należy uszczelnić płytkę i przeprowadzić analizę na maszynie Applied Biosystems 7900HT TAQMAN.
   5. Wyniki są wyrażone jako wyrażenie względne dla próbki kontrolnej.

5. Analiza funkcjonalna testów cytochromu P450 endodermy wątroby pochodzącej z hESC - http://www.promega.com/tbs/tb325/tb325.pdf
   1. Inkubować dzień 17 hESC uzyskany w HE ze specyficznym substratem przez 5 godzin w temperaturze 37°C (n=3). Użyć pożywki do hodowli tkankowych jako kontroli ujemnej i inkubować w temperaturze 37°C przez 5 godzin.
   2. Zebrać supernatanty i przeprowadzić test zgodnie z instrukcjami producenta.
   3. Zmierzyć względne poziomy podstawowej aktywności i znormalizować do białka na mg, zgodnie z testem BCA (http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=02020101).

Uwagi

1. Wszystkie objętości są oparte na formacie płytki 6-dołkowej. Dostosuj odpowiednio objętości dla wymaganej płytki lub kolby.
2. Wszystkie podłoża do zalewania, różnicowania i dojrzewania są przed użyciem filtrowane w próżni.
3. Pożywkę do gruntowania, różnicowania i dojrzewania przechowuje się w temperaturze 4°C nie dłużej niż 2 tygodnie. Oceń, ile pożywki jest potrzebne do eksperymentu, a pozostałą pożywkę podnieść, a następnie przechowywać w temperaturze -20°C do wykorzystania w przyszłości.
4. Matrigel jest przygotowywany zgodnie z instrukcjami producenta; 1 ml porcji można przechowywać w temperaturze -20°C do czasu użycia.
5. Czynniki wzrostu po przygotowaniu i dodatkach mogą być przechowywane w temperaturze -20°C, a po rozmrożeniu mogą być przechowywane w temperaturze 4°C nie dłużej niż 2 tygodnie.
6. Przeciwciałem pierwszorzędowym zwykle stosowanym do charakteryzowania HLC pochodzących z hESC jest albumina (1:250, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO).

5. Reprezentatywne wyniki:

Charakterystyka hESC zachowana przed różnicowaniem wątroby

Aby scharakteryzować status komórek macierzystych hESC H9 użytych w badaniu, zbadaliśmy szereg parametrów. Komórki wykazywały morfologię hESC, małe, ciasno upakowane komórki rosnące w określonych koloniach (Figura 1A) i wyrażały pluripotencjalne markery genów komórek macierzystych, Oct-3/4 i Nanog (Figura 1B). Nie znaleźliśmy istotnych różnic w ekspresji tych genów w porównaniu z kontrolą pozytywną linii H7 hESC. Ponadto 90,1% populacji hESC było dodatnich dla markera komórek macierzystych SSEA-4 (Figura 1C).

zróżnicowanie hESC do endodermy wątrobowej

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste mogą być efektywnie różnicowane do endodermy wątrobowej in vitro (Hay i inni 2008). W 9 dniu różnicowania pobrano komórki i oceniono różnicowanie hESC do HLC. Jak wcześniej informowano, hESC wykazywały szereg głębokich zmian morfologicznych, a do 9 dnia wykazywały wczesną morfologię hepatocytów, rozwijając wielokątny wygląd (Figura 2A). Ponadto zaobserwowano regulację w dół Oct-3/4 w ciągu 9-dniowego kursu czasowego (Rysunek 2B). W przeciwieństwie do tego, transkrypty wątrobowe AFP i albumina były regulowane w górę (Figura 2C) od 7 dnia.

Dojrzewanie in vitro endodermy wątrobowej

Endoderma wątrobowa została opracowana in vitro zgodnie z ustaloną procedurą (Hay i wsp. 2008). W ostatnim dniu różnicowania hodowle poddano barwieniu immunologicznemu na obecność markerów wątroby ludzkiej: albuminy, AFP i E-kadheryny. Wydajność HLC przy użyciu naszej procedury wynosi zazwyczaj 90% (Hay i wsp. 2008 ; Hanoun i wsp. 2010 ; Payne i wsp. 2011). HLC zabarwione dodatnio na obecność albuminy, alfa-fetoproteiny i E-kadheryny (ryc. 3).

Rysunek 1. Charakterystyka komórek macierzystych wykorzystanych w tym badaniu. (A) Obrazy z mikroskopii kontrastu fazowego reprezentatywne dla morfologii hESC obserwowanej w hodowli przy 4- i 10-krotnym powiększeniu. Obrazy zostały wykonane za pomocą mikroskopu odwróconego Nikon TE3000/U (B), hodowane hESC to Octamer (Oct-3/4) dodatni i Nanog dodatni. HESC H7 stosowano jako kontrolę poziomu ekspresji genów pluripotencji. Ekspresja względna odnosi się do fałd indukcji w porównaniu z endogenną kontrolą genu, β-2-mikroglobuliną. (C) Wykresy FACS pokazują poziomy ekspresji markerów powierzchniowych hESC, w tym antygeny embrionalne specyficzne dla danego stadium SSEA 4.

Rysunek 2. (A) Reprezentatywne obrazy morfologii endodermy wątroby pochodzącej z hESC w 9. dniu różnicowania obserwowanego w hodowli, przy powiększeniach x4 i x10 w mikroskopii z kontrastem fazowym. (B) Charakterystyka zmian w ekspresji genów. RNA wyekstrahowano, a cDNA przeanalizowano za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy, wykazując postępującą regulację w dół ekspresji genów niezróżnicowanych komórek (Oct-3/4) i (C) regulację w górę ekspresji genów hepatocytów (albuminy i α-fetoproteiny). Ekspresja względna odnosi się do fałd indukcji w porównaniu z endogenną kontrolą genu, β-2-mikroglobuliną w dniu 0 różnicowania. P<0,05 jest oznaczane *, a P<0,001 jest oznaczane *** mierzone za pomocą testu t uczniów w porównaniu z ludzkimi komórkami macierzystymi w dniu 0. Słupki błędów reprezentują 1 odchylenie standardowe.

Rysunek 3. Charakterystyka endodermy wątrobowej pochodzącej z komórek macierzystych hESC
Immunocytochemia wykazująca ekspresję markerów hepatocytów, albuminy, AFP i E-kadheryny w endodermie wątroby pochodzącej z hESC (H9). Przeprowadzono kontrole ujemne z odpowiednią immunoglobuliną G (IgG) i pokazano obrazy przedstawicieli.

Rysunek 4. HLC pochodzące z hESC (H9) wykazują aktywność metaboliczną. W dniu 17 H9 różnicowane do HLC wykazywały aktywność metaboliczną CYP3A (n = 6).

Dyskusja

Opracowaliśmy prosty, jednorodny i wysoce odtwarzalny model in vitro , aby wygenerować skalowalne poziomy ludzkich HLC. Nasz model został zweryfikowany przez szereg współpracujących z nami zewnętrznych laboratoriów. Rutynowo charakteryzujemy HLC pochodzące z komórek macierzystych, korzystając z naszego wewnętrznego zestawu narzędzi markerów rozwojowych i testów funkcjonalnych specyficznych dla wątroby (z których większość jest dostępna na rynku). Krytycznymi etapami naszego procesu są: utrzymanie pluripotencji k...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytki i kolby powlekające Matrigel Matrigel (10 mL, BD Biosciences, Wielka Brytania); przechowywać w temperaturze -20°C. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, Wielka Brytania); przechowywać w 4°C. Płytki do hodowli tkankowych (6 dołków, 12 well, Corning, Wielka Brytania) Kolba do hodowli tkankowych (25 cm2 wentylowana, Corning, Wielka Brytania) hESC Maintenance Mysza pożywka kondycjonowana fibroblastami embrionalnymi (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, Stany Zjednoczone); przechowywać w temperaturze -20°C. BSA roztwór (50 ml, Sigma Aldrich, Wielka Brytania); przechowywać w temperaturze 4°C. Ludzki podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (100 μ g, Peprotech, Stany Zjednoczone); przechowywać w temperaturze -20°C. Pasażowanie hESC za pomocą kolagenazy Studzienka zlewająca lub kolba hESCs. Studzienki lub kolby pokryte Matrigelem, w zależności od potrzeb. Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (-MgCl2, -CaCl2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, Wielka Brytania); przechowywać w temperaturze pokojowej. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, Wielka Brytania); przechowywać w 4°C. Mysza pożywka kondycjonowana fibroblastami embrionalnymi (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, Stany Zjednoczone). Ludzki zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (100 μ g, Peprotech, USA). Różnicowanie hESC do endodermy wątrobowej RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, Wielka Brytania); przechowywać w 4°C. B27 Suplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, Wielka Brytania); przechowywać w temperaturze -20°C. Activin A (2 μ g, Peprotech, Stany Zjednoczone); przechowywać w temperaturze -20°C. Rekombinowana mysz Wnt3a (2 μ g, R & D Systems, Stany Zjednoczone); przechowywać w temperaturze -20°C. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, Wielka Brytania); przechowywać w 4°C. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, Wielka Brytania); przechowywać w temperaturze -20°C. Aminokwasy endogenne (100 mL, Gibco, Invitrogen, Wielka Brytania); przechowywać pod adresem 4°C. β-Mercapt– tanol (10 ml, Gibco, Invitrogen, Wielka Brytania); przechowywać pod adresem 4°C. DMSO (Sigma Aldrich, Wielka Brytania); przechowywać w temperaturze pokojowej Leibovitz L-15 pożywka hodowlana (500 ml, Sigma Aldrich, Wielka Brytania); przechowywać w 4°C. bulion fosforanowo-tryptozowy (100 mL, Sigma Aldrich, Wielka Brytania); przechowywać pod adresem 4°C. F– tal surowica bydlęca, inaktywowana termicznie (500 mL, Gibco, Invitrogen, Wielka Brytania); przechowywać w temperaturze -20°C. Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, Wielka Brytania); przechowywać w temperaturze -20°C. Insulin (trzustka bydlęca) (100 mg, Sigma Aldrich, Wielka Brytania); przechowywać w temperaturze -20°C. L-Glutamina (100 mL, Gibco, Invitrogen, Wielka Brytania); przechowywać w temperaturze -20°C. Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, Wielka Brytania); przechowywać w temperaturze -20°C. Human HGF (10 μ g, Peprotech, Stany Zjednoczone); przechowywać w temperaturze -20°C. Rekombinowana ludzka onkostatyna M (OSM) (50 μ g, R & D Systems, Stany Zjednoczone); przechowywać w temperaturze -20°C. Jednostka filtrująca napędzana strzykawką 0,22 μ m (Millipore, UK) Charakterystyka endodermy wątrobowej pochodzącej z hESC Immunostaining Sól fizjologiczna z buforu fosforanowego (-MgCl2, -CaCl2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, Wielka Brytania); przechowywać w temperaturze pokojowej. PBST, PBS składa się z 0,1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, Wielka Brytania). Paraformaldehyd (PFA) (Sigma-Aldrich, Wielka Brytania) składa się z PBS, przechowuj -20°C. Glycerol (Sigma-Aldrich, Wielka Brytania), przechowuj w temperaturze pokojowej. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), przechowywać w temperaturze pokojowej. Ethanol Serum (AbD Serotech, Wielka Brytania), przechowywać w temperaturze -20°C. Przeciwciało wtórne, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, Wielka Brytania). MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) składa się z Tris HCL i glicerolu zgodnie z instrukcjami producenta. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Wielka Brytania) dodaje się do roztworu MOWIOL w rozcieńczeniu 1:1000. Przeciwciała pierwotne Antygen* Typ Dostawca Rozcieńczenie ALB Mouse monoklonalny Sigma Aldrich 1/500 E-Cadherin Mouse monoklonalny Millipore 1/100 &alfa;-fetoproteina Mysz monoklonalna Sigma 1/500 SSEA-4 FITC Mysz monoklonalna Biolegend 1/100 IgG Mysi monoklonalny DAKO 1/500 Przeciwciała wtórne Przeciw mysim koniugatom FITC Goat Monoclonal Invitrogen 1/400 Tabela 2. Przeciwciała stosowane do immunobarwienia endodermy wątroby pochodzącej z hESC, zastosowane stężenia, gatunki, w których zostały wyhodowane i firmy, od których zostały zakupione. Analiza funkcjonalna endodermy wątrobowej i normalizacji (na białko mg) Biała płaska płytka testowa 96 dołków z płaskim dnem (BD Biosciences, Wielka Brytania). BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Wielka Brytania). Przezroczysta 96-dołkowa płytka testowa (IWAKI, Wielka Brytania)