Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Solidna generacja komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych populacji komórek macierzystych

47.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2969

⸱

26 października 2011

 ,  ,  ,  , 
1Medical Research Council Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł skupi się na generowaniu ludzkiej endodermy wątrobowej z populacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.

Streszczenie

Pomimo postępu w modelowaniu toksyczności leków dla ludzi, wiele związków zawodzi podczas badań klinicznych z powodu nieprzewidzianych skutków ubocznych. Koszty badań klinicznych są znaczne, dlatego tak ważne jest, aby na wczesnym etapie opracowywania i wdrażania większej liczby predykcyjnych badań toksykologicznych (Greenhough i wsp. 2010). Ludzkie hepatocyty reprezentują obecny złoty standard oceny toksyczności leków, ale są ograniczonym zasobem, który wykazuje zmienną funkcję. W związku z tym rutynowo stosuje się unieśmiertelnione linie komórkowe i modele tkanek zwierzęcych ze względu na ich obfitość. Chociaż oba źródła mają charakter informacyjny, są one ograniczone przez słabe funkcjonowanie, zmienność gatunków i/lub niestabilność w kulturze (Dalgetty i in. 2009). Pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC) są atrakcyjnym alternatywnym źródłem ludzkich komórek podobnych do hepatocytów (HLC) (Medine i wsp. 2010). PSC są zdolne do samoodnawiania się i różnicowania do wszystkich typów komórek somatycznych występujących u osób dorosłych, a tym samym stanowią potencjalnie niewyczerpane źródło zróżnicowanych komórek. Opracowaliśmy procedurę, która jest prosta, wysoce wydajna, podatna na automatyzację i daje funkcjonalne ludzkie HLC (Hay i in. 2008 ; Fletcher i wsp. 2008 ; Hannoun i wsp. 2010 ; Payne i wsp. 2011 oraz Hay i wsp. 2011). Wierzymy, że nasza technologia doprowadzi do skalowalnej produkcji HLC do odkrywania leków, modelowania chorób, budowy urządzeń pozaustrojowych i być może terapii transplantacyjnych opartych na komórkach.

Protokół

1. Wstępne przygotowanie wszystkich zapasów chemicznych i powlekanie wyrobów z tworzyw sztucznych

Wszystkie kroki należy przeprowadzić w kapturze do hodowli tkanek w warunkach aseptycznych.

  1. Przygotowanie ludzkiego zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (hbFGF)
    1. Przygotuj 10% roztwór BSA w PBS i przefiltruj przez filtr 0,22 μm.
    2. Z 10% roztworu BSA przygotuj 0,2% roztwór BSA.
    3. Dodać 10 ml 0,2% roztworu BSA/100 μg hbFGF.
    4. Wstępnie zwilż filtr 0,22 μm, filtrując 5 ml 10% roztworu BSA przez filtr. Wyrzuć 10 ml płynu do płukania BSA.
    5. Przefiltruj hbFGF przez wstępnie umyty filtr.
    6. Porcję hbFGF należy umieścić w sterylnych eppendorfach i przechowywać w temperaturze -20°C.
  2. Przygotowanie ludzkiego roztworu podstawowego Activin A
    1. Dodaj 1 ml 0,2% BSA do strzykawki i wstępnie zwilż filtr.
    2. Rozcieńczyć aktywinę A w 0,2% BSA do stężenia podstawowego 100 μg/ml.
    3. Przefiltrować roztwór Activiny A i podwielokrotność w sterylnych eppendorfach, przechowywać w temperaturze -20°C.
  3. Przygotowanie roztworu podstawowego myszy Wnt3a
    1. Dodać 200 μl PBS do fiolki 2 μg Wnt3a do stężenia podstawowego 10 μg/ml.
    2. Podwielokrotność podawania w sterylnych eppendorfach i przechowywać w temperaturze -20°C.
  4. Przygotowanie roztworu podstawowego HGF dla ludzi (1000X)
    1. Rozcieńczyć HGF w PBS do stężenia podstawowego 10 μg/ml.
    2. Przefiltrować roztwór HGF i podwielokrotność w sterylnych eppendorfach, przechowywać w temperaturze -20°C.
  5. Przygotowanie roztworu podstawowego onkostatyny M (1000X)
    1. Rozcieńczyć OSM w PBS do stężenia podstawowego 20 μg/ml.
    2. Przefiltrować roztwór OSM i podwielokrotność w sterylnych eppendorfach, przechowywać w temperaturze -20°C.
  6. Powlekanie wyrobów z tworzyw sztucznych z kultur bakteriami Matrigel
    1. Rozmrozić 10 ml butelkę magazynową Matrigel przez noc w temperaturze 4°C na lodzie, a następnie dodać 10 ml KO-DMEM. Dobrze wymieszać za pomocą schłodzonych pipet i przechowywać 1 ml porcji w temperaturze -20°C.
    2. Rozmrażać porcję Matrigelu w temperaturze 4°C przez co najmniej 2 godziny lub przez noc, aby uniknąć tworzenia się żelu.
    3. Dodaj 5 ml zimnego KO-DMEM do matrycy, dobrze wymieszaj pipetą.
    4. Uzupełnić do 15 ml zimnym KO-DMEM i wymieszać za pomocą pipety.
    5. Dodać matrigel do płytki lub kolby, która ma być pokryta (tabela (i))
Talerz / Kolba Objętość / studzienka lub kolba Płytka 12-dołkowa 0,5 ml na studzienkę Płytka 6-dołkowa 1 ml na studzienkę 25 cm2 kolby 2 ml na kolbę

Tabela 1. Zalecane objętości matrycy do powlekania typowych wyrobów z tworzyw sztucznych do hodowli hESC.

    1. Inkubować powlekaną płytkę lub kolbę przez noc w temperaturze 4°C lub pokojowej przez 1 godzinę przed użyciem.
    2. Płytki lub kolby, które zostały pokryte matrigelem, można przechowywać w temperaturze 4°C przez okres do 1 tygodnia. Powinny być wyraźnie oznaczone datą ich powlekania. W ciągu tygodnia należy wyrzucić wszystkie płytki lub kolby, które nie zostały użyte.
      1. Przed użyciem pozwól, aby powlekany pojemnik do hodowli osiągnął temperaturę pokojową w kapturze do hodowli tkankowych.
      2. Bezpośrednio przed użyciem należy odessać matrigel i dodać zawiesinę komórkową do studzienki lub kolby.

2. Rutynowa konserwacja kultur hESC i charakterystyka

  1. Resuscytacja linii hESC
    1. Usunąć hESC z magazynu ciekłego azotu i szybko rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37°C.
    2. Ostrożnie przenieść zawiesinę komórkową do sterylnej probówki zawierającej kilka ml ciepłej pożywki.
    3. Granuluj komórki przez wirowanie @ niska prędkość przez 5 min (1000 obr./min).
    4. Odessać supernatant i bardzo delikatnie zawiesić komórki w ciepłym podłożu ES i rozłożyć na warstwie zasilającej MEF.
    5. Codziennie podawaj komórki świeżą pożywką ES, a po subkonfluencji komórki wymagają pasażowania.
  2. Rutynowa konserwacja hESC
    Komórki ES hoduje się na płytkach lub kolbach pokrytych matrigelem. Komórki muszą być badane i karmione codziennie:
    1. Zbadaj pod mikroskopem pod kątem zanieczyszczeń, morfologii komórek i konfluencji.
    2. Zassać zużyte podłoże.
    3. Dodać odpowiednią objętość świeżej pożywki kondycjonowanej fibromnatami embrionalnymi myszy (MEF-CM) + ludzkiego bFGF (stężenie końcowe 4 ng / ml) lub innej pożywki wolnej od surowicy6.
  3. Komórki pasażujące z kolagenazą
    Linie hESC (H1, H9 i RCM-1) będą osiągać zbieg co 5-7 dni po przejściu w stosunku podziału 1:3. Wczesne pasażowanie hESC w obecności zrębu rośnie wolniej, a czas na matrycy może stać się ważnym czynnikiem. Ludzkie EKM nie powinny być pozostawione dłużej niż 14 dni na tym samym matrycy ze względu na degradację matrycy i w tym przypadku może być konieczne przejście komórek w stosunku podziału 1:1 lub 1:2, jeśli komórki są subkonkurencyjne.

    Inkubacja enzymów
    1. Wszystkie kroki należy przeprowadzić w kapturze do hodowli tkankowych w warunkach aseptycznych.
    2. Upewnij się, że istnieje nowe naczynie lub kolba pokryta matryżelem przygotowane zgodnie z sekcją 1.6.
    3. Zdecyduj o żądanym współczynniku podziału komórek. Na decyzję o współczynniku podziału składa się wiele czynników:
      1. Wysoki poziom zrębu przy małej liczbie kolonii: może być pasażowany z powrotem do mniejszego rozmiaru studzienki lub może być pasażowany 1:1, co pozwoli pozbyć się części zrębu, a tym samym zwiększyć stosunek kolonii do zrębu, sprzyjając wzrostowi hESC.
      2. Wysoki poziom zrębu z dużymi koloniami, w zależności od liczby kolonii, może być przebyty 1:1 lub 1:2, jeśli jest wystarczająca liczba dużych kolonii hESC.
      3. Typowe rosnące hESC z niewielkim zrębem lub bez zrębu i/lub pewnym zróżnicowaniem mogą być pasażowane 1:2 lub 3.
      4. Odessać pożywkę ze studzienki lub kolby.
      5. Przemyć raz 2 ml PBS (-MgCl2, -CaCl2).
      6. Dodać odpowiednią objętość kolagenazy (200 U/ml rozcieńczonej w KO-DMEM) i inkubować w temperaturze 37°C przez 2-5 minut. Od 2 minut regularnie badaj pod mikroskopem (odstępy 1-minutowe). W momencie, gdy zróżnicowane komórki zaczynają się unosić, a kolonie zaczynają się podnosić na krawędzi, komórki są gotowe do przejścia.
    Scraping i łączenie komórek macierzystych
    1.  
      1. Odessać kolagenazę.
      2. Przemyć raz 2 ml PBS (-MgCl2, -CaCl2).
      3. Dodać odpowiednią objętość MEF-CM w zależności od proporcji podziału i za pomocą skrobaka do komórek fizycznie usunąć komórki z powierzchni studzienki lub kolby, a następnie delikatnie rozcierać, pipetując w górę i w dół 2-3 razy za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Ważne jest, aby hESC były przechowywane w skupiskach komórek i nie były rozbijane na pojedyncze komórki.
    Powtarzanie komórek macierzystych wątroby
    1.  
      1. Otrzymaną zawiesinę komórek należy ponownie przesiać na nowe kolby lub studzienki pokryte matriżelem.
      2. Uzupełnić objętość MEF-CM do 4 ml na dołek na płytce 6-dołkowej.
      3. Umieszczając komórki w inkubatorze, należy zamieszać pojemnik do hodowli tkankowej, aby zapewnić jak najbardziej równomierne rozmieszczenie kolonii, ponieważ kolonie mają tendencję do osadzania się w środku płytki/kolby do hodowli tkankowej, co wpływa na ponowne posiew i różnicowanie komórek.
  4. Rutynowa charakterystyka populacji hESC za pomocą cytometrii przepływowej
    1. Populacje hESC są badane za pomocą cytometrii przepływowej raz w miesiącu pod kątem markerów komórek macierzystych, takich jak Oct 3/4, Tra 1-60 i SSEA-4.
    2. Populacje hESC są usuwane z ich substratu w postaci zawiesin pojedynczych komórek po 5-minutowym traktowaniu trypsyną/EDTA (Invitrogen).
    3. Zawiesić pojedyncze komórki w 1x106 komórek/ml w PBS uzupełnionym 0,1% BSA i 0,1% azydkiem sodu.
    4. Preparaty komórkowe należy inkubować w temperaturze 4°C z odpowiednimi przeciwciałami przez 40 minut.
    5. Przemyć komórki dwukrotnie PBS uzupełnionym 0,1% BSA i 0,1% azydkiem sodu w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała i ponownego zawieszenia do końcowej objętości 100 μl i analizy metodą cytometrii przepływowej.
    6. Dane dla 30000-40000 zdarzeń "na żywo" są pozyskiwane dla każdej próbki za pomocą cytometru FACS Calibre wyposażonego w laser 488 nm i analizowane za pomocą oprogramowania CellQuest (Becton Dickinson, San Jose, CA). Niebarwione komórki są dołączane jako kontrole. Martwe i apoptotyczne komórki wraz ze szczątkami wykluczono z analizy za pomocą elektronicznej bramki na żywo przy parametrach rozproszenia do przodu i rozpraszania bocznego.

3. Różnicowanie hESC do endodermy wątrobowej

  1. Przygotowanie pożywek do różnicowania hESC do endodermy wątroby. Całe przygotowanie pożywek powinno odbywać się w kapturze do hodowli tkankowych w warunkach aseptycznych.
    1. Przygotowanie podłoża gruntującego RPMI:B27 do różnicowania endodermy
      1. W przypadku pożywki RPMI-B27 wymieszaj RPMI 1640 (500 ml) i B27 (50x, 10 ml)
      2. Zamieszaj, aby wymieszać składniki.
      3. Dodaj wszystkie składniki do jednostki filtrującej i przefiltruj w próżni, przechowuj w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotowanie pożywki SR-DMSO do różnicowania hepatocytów
      1. W przypadku pożywki SR-DMSO wymieszaj 80% KO-DMEM, 20% KO-SR, 0,5% L-glutaminy, 1% aminokwasów endogennych, 0,1 mM β-merkaptoetanolu i 1% DMSO.
      2. Przefiltrować roztwór w próżni, przechowywać w temperaturze 4 °C i porcji oraz w razie potrzeby przechowywać w temperaturze -20 °C.
      3. Użyć 4 ml na zagłębienie płytki 6-dołkowej i 6 ml na kolbę T25.
    3. Przygotowanie pożywki L15 do dojrzewania hepatocytów
      1. W przypadku pożywki L-15 wymieszaj 500 ml pożywki Leibovitz L-15, bulionu z fosforanu tryptozy (stężenie końcowe 8,3%), inaktywowaną termicznie płodową surowicę bydlęcą (stężenie końcowe 8,3%), 10 μM hydrokortyzonu 21-hemibursztynian, 1 μM insuliny (trzustka bydlęca), 1% L-glutaminy, 0,2% kwasu askorbinowego.
      2. Przefiltrować roztwór w próżni, przechowywać w temperaturze 4 °C i porcji oraz w razie potrzeby przechowywać w temperaturze -20 °C.
    4. Przygotowanie końcowego podłoża gruntującego RPMI:B27
      1. Dozować wymaganą objętość pożywki gruntującej do eksperymentu (1 ml na dołek płytki 6-dołkowej i 2 ml na kolbę T25).
      2. Dodaj aktywinę A do końcowego stężenia 100 ng/ml.
      3. Dodać rekombinowany Wnt3a do końcowego stężenia 50 ng/ml.
      4. Dobrze wymieszaj, a podłoże jest teraz gotowe do użycia.
      5. Ta końcowa pożywka powinna być codziennie przygotowywana na świeżo.
    5. Przygotowanie końcowej pożywki do dojrzewania L-15
      1. Dozować wymaganą objętość pożywki L-15 do eksperymentu (4 ml na dołek płytki 6-dołkowej i 6 ml na kolbę T25).
      2. Dodać HGF do końcowego stężenia 10 ng/ml.
      3. Dodać OSM do końcowego stężenia 20 ng/ml.
      4. Dobrze wymieszaj, a podłoże jest teraz gotowe do użycia.
      5. Ta końcowa pożywka powinna być codziennie przygotowywana na świeżo.
  2. Gruntowanie hESC do ostatecznej endodermy
    1. Hodować hESC (H1, H9 i RCM-1) i rozmnażać na płytkach pokrytych matryżelem z mysim fibroblastem zarodkowym MEF-CM uzupełnionym bFGF.
    2. Zainicjuj różnicowanie wątroby, gdy hESC osiągną poziom konfluencji około 30%-60% (w zależności od linii hESC), zastępując MEF-CM pożywką kondycyjną (RPMI 1640-B27 uzupełnioną 100 ng/ml aktywiny A i 50 ng/ml Wnt3a.
    3. Komórki są hodowane w pożywce kondycjonującej przez 3 dni (zmiana pożywki co 24 godziny), a końcowa pożywka kondycjonująca z aktywiną A i Wnt3a jest przygotowywana na świeżo każdego dnia.
    4. Po 72 godzinach w pożywce gruntowej należy zmienić pożywkę na drugą pożywkę różnicującą (SR-DMSO) na 5 dni (zmiana pożywki co 48 godzin).
    5. W dniu 8 hodowli komórki w pożywce dojrzewającej i podtrzymującej (L-15) uzupełnione 10 ng / ml hHGF i 20 ng / ml OSM przez 9 dni (zmiana pożywki co 48 godzin). Pożywka do dojrzewania i utrzymania z hHGF i OSM jest przygotowywana na świeżo każdego dnia.
    6. Komórki stopniowo wykazują zmiany morfologiczne od kolczastego / trójkątnego kształtu do charakterystycznej morfologii wątroby wykazującej wielokątny wygląd (ryc. 2A).
    7. Schemat różnicowania wątrobowo-komórkowego:

figure-protocol-1

4. Charakterystyka endodermy wątrobowej pochodzącej z hESC

  1. Barwienie immunologiczne
    1. Przemyć HLC pochodzące z hESC PBS dwukrotnie, po 1 minutę każde płukanie.
    2. Utrwalić HLC za pomocą 4% PFA przez 20 minut w temperaturze pokojowej (komórki można przechowywać w PBS w temperaturze 4°C i barwić w późniejszym terminie). Ogniwa można również utrwalać lodowatym metanolem przez 10 minut w temperaturze -20°C.
    3. Umyj komórki dwukrotnie PBS, po 5 minut każde mycie.
    4. Inkubować komórki przez 2 minuty w temperaturze pokojowej ze 100% etanolem do barwienia jądrowego (ten etap nie jest wymagany, jeśli stosuje się utrwalanie metanolem).
    5. Umyj komórki dwukrotnie PBS, po 5 minut każde mycie.
    6. Zablokuj komórki za pomocą PBS/T (0,1% tween)/10% BSA na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    7. Usunąć bufor blokujący i dodać odpowiednie przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w PBS/T (0,1% tween)/1% BSA i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C z mieszaniem.
    8. Umyj komórki 3 razy PBS/T (0,1% tween)/1% BSA w temperaturze pokojowej, po 5 minut każde mycie.
    9. Dodać do komórek odpowiednie wtórne przeciwciało Alexa Fluor (1:400) rozcieńczone w PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności z mieszaniem.
    10. Umyj komórki 3 razy PBS, po 5 minut każde mycie.
    11. Zamontuj każdą studzienkę za pomocą MOWIOL 4-88 i DAPI (1:1000). Przykryj studzienkę szkiełkiem nakrywkowym, delikatnie dociskając szkiełko nakrywkowe, aby upewnić się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostało usunięte i przechowywać w temperaturze 4°C w ciemności.
  2. Izolacja i ekstrakcja RNA
    1. Przemyć HLC pochodzące z hESC PBS i aspiratem.
    2. Dodać 1 ml odczynnika TRIZOL i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    3. Zeskrob komórki i umieść w 1,5 ml eppendorf (przechowywać w temperaturze -80°C do późniejszego wykorzystania, jeśli to wymagane).
    4. Dodać 0,5 ml chloroformu do eppendorfa i wymieszać przez odwrócenie; upewnij się, że odbywa się to w dygestorium.
    5. Odwirować roztwór z prędkością 13 000 obr./min przez 15 minut w temperaturze 4°C.
    6. Zbierz warstwę wodną i umieść w czystym eppendorfie, upewnij się, że nie ma zanieczyszczeń z interfejsu.
    7. Dodaj 1 ml izopropanolu i wymieszaj, odwracając, pozostaw w temperaturze pokojowej na 10 minut, aby wytrącić RNA.
    8. Wirować z prędkością 13 000 obr./min przez 10 minut w temperaturze 4°C.
    9. Odessać supernatant i upewnić się, że nie naruszyć osadu RNA. Umyć 0,5 ml 70% etanolu i pozostawić w temperaturze pokojowej na 5 minut.
    10. Wirować z prędkością 8 000 obr./min przez 5 minut w temperaturze 4°C.
    11. Zassać etanol i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na 5-10 minut.
    12. Gdy cały etanol odparuje, zawiesić granulat w 30 μl wody dejonizowanej. Przechowuj RNA w temperaturze -80°C do późniejszego wykorzystania.
    13. Określ ilościowo stężenie RNA za pomocą nanokropli.
  3. PCR z odwrotną transkrypcją
    1. Przygotuj reakcję przy użyciu wcześniej wyizolowanego RNA (200 ng), losowych heksamerów, nukleotydów (10 mM), odwrotnej transkryptazy i odpowiedniego buforu w cienkościennym 0,5 ml eppendorfie.
    2. Ustaw ujemną RT, powyższą reakcję bez odwrotnej transkryptazy.
    3. Umieść probówki w termocyklerze, maszynie do PCR i ustaw następujący program:
      1. 37°C - 5 minut (1 cykl)
      2. 42°C - 1 godzina (1 cykl)
      3. 95°C - 5 minut (1 cykl)
    4. Przechowuj cDNA w temperaturze -20°C do późniejszego wykorzystania, jeśli zajdzie taka potrzeba.
  4. TAQMAN ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy odwrotnej transkryptazy Zbierz komórki w różnych punktach czasowych w całym protokole różnicowania. Ekstrahować RNA i przeprowadzić qPCR z odwrotną transkrypcją przy użyciu następujących starterów i protokołu Test na żądanie (Applied Biosystems):
    1. paź 4 Hs03005111_g1
    2. Nanog Hs02387400_g1
    3. Albumina Hs00910225_m1
    4. Alfa-fetoproteina Hs00173490_m1

Dla izolacji i ekstrakcji RNA patrz sekcja 3.3.2

  1. Odwrotna transkrypcja i TAQMAN qPCR
    1. Weź 1 μg RNA i dokonaj odwrotnej transkrypcji do cDNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji Superscript III firmy Invitrogen, zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. 1 μl cDNA użytego w 25 μl reakcji TAQMAN składającej się z odpowiednich starterów z Applied Biosystems, 18S rybosomalnych starterów kontrolnych i 2x platynowego qPCR supermix UDG firmy Invitrogen z roxem i odpowiednią objętością wody.
    3. Dobrze wymieszać i umieścić 10 μl każdej próbki w dwóch dołkach z 96 lub 384-dołkową płytką qPCR.
    4. Po załadowaniu wszystkich próbek wraz z odpowiednimi kontrolami) należy uszczelnić płytkę i przeprowadzić analizę na maszynie Applied Biosystems 7900HT TAQMAN.
    5. Wyniki są wyrażone jako wyrażenie względne dla próbki kontrolnej.
  1. Analiza funkcjonalna testów cytochromu P450 endodermy wątroby pochodzącej z hESC - http://www.promega.com/tbs/tb325/tb325.pdf
    1. Inkubować dzień 17 hESC uzyskany w HE ze specyficznym substratem przez 5 godzin w temperaturze 37°C (n=3). Użyć pożywki do hodowli tkankowych jako kontroli ujemnej i inkubować w temperaturze 37°C przez 5 godzin.
    2. Zebrać supernatanty i przeprowadzić test zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Zmierzyć względne poziomy podstawowej aktywności i znormalizować do białka na mg, zgodnie z testem BCA (http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=02020101).

Uwagi

  1. Wszystkie objętości są oparte na formacie płytki 6-dołkowej. Dostosuj odpowiednio objętości dla wymaganej płytki lub kolby.
  2. Wszystkie podłoża do zalewania, różnicowania i dojrzewania są przed użyciem filtrowane w próżni.
  3. Pożywkę do gruntowania, różnicowania i dojrzewania przechowuje się w temperaturze 4°C nie dłużej niż 2 tygodnie. Oceń, ile pożywki jest potrzebne do eksperymentu, a pozostałą pożywkę podnieść, a następnie przechowywać w temperaturze -20°C do wykorzystania w przyszłości.
  4. Matrigel jest przygotowywany zgodnie z instrukcjami producenta; 1 ml porcji można przechowywać w temperaturze -20°C do czasu użycia.
  5. Czynniki wzrostu po przygotowaniu i dodatkach mogą być przechowywane w temperaturze -20°C, a po rozmrożeniu mogą być przechowywane w temperaturze 4°C nie dłużej niż 2 tygodnie.
  6. Przeciwciałem pierwszorzędowym zwykle stosowanym do charakteryzowania HLC pochodzących z hESC jest albumina (1:250, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO).

5. Reprezentatywne wyniki:

Charakterystyka hESC zachowana przed różnicowaniem wątroby

Aby scharakteryzować status komórek macierzystych hESC H9 użytych w badaniu, zbadaliśmy szereg parametrów. Komórki wykazywały morfologię hESC, małe, ciasno upakowane komórki rosnące w określonych koloniach (Figura 1A) i wyrażały pluripotencjalne markery genów komórek macierzystych, Oct-3/4 i Nanog (Figura 1B). Nie znaleźliśmy istotnych różnic w ekspresji tych genów w porównaniu z kontrolą pozytywną linii H7 hESC. Ponadto 90,1% populacji hESC było dodatnich dla markera komórek macierzystych SSEA-4 (Figura 1C).

zróżnicowanie hESC do endodermy wątrobowej

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste mogą być efektywnie różnicowane do endodermy wątrobowej in vitro (Hay i inni 2008). W 9 dniu różnicowania pobrano komórki i oceniono różnicowanie hESC do HLC. Jak wcześniej informowano, hESC wykazywały szereg głębokich zmian morfologicznych, a do 9 dnia wykazywały wczesną morfologię hepatocytów, rozwijając wielokątny wygląd (Figura 2A). Ponadto zaobserwowano regulację w dół Oct-3/4 w ciągu 9-dniowego kursu czasowego (Rysunek 2B). W przeciwieństwie do tego, transkrypty wątrobowe AFP i albumina były regulowane w górę (Figura 2C) od 7 dnia.

Dojrzewanie in vitro endodermy wątrobowej

Endoderma wątrobowa została opracowana in vitro zgodnie z ustaloną procedurą (Hay i wsp. 2008). W ostatnim dniu różnicowania hodowle poddano barwieniu immunologicznemu na obecność markerów wątroby ludzkiej: albuminy, AFP i E-kadheryny. Wydajność HLC przy użyciu naszej procedury wynosi zazwyczaj 90% (Hay i wsp. 2008 ; Hanoun i wsp. 2010 ; Payne i wsp. 2011). HLC zabarwione dodatnio na obecność albuminy, alfa-fetoproteiny i E-kadheryny (ryc. 3).

figure-protocol-2
Rysunek 1. Charakterystyka komórek macierzystych wykorzystanych w tym badaniu. (A) Obrazy z mikroskopii kontrastu fazowego reprezentatywne dla morfologii hESC obserwowanej w hodowli przy 4- i 10-krotnym powiększeniu. Obrazy zostały wykonane za pomocą mikroskopu odwróconego Nikon TE3000/U (B), hodowane hESC to Octamer (Oct-3/4) dodatni i Nanog dodatni. HESC H7 stosowano jako kontrolę poziomu ekspresji genów pluripotencji. Ekspresja względna odnosi się do fałd indukcji w porównaniu z endogenną kontrolą genu, β-2-mikroglobuliną. (C) Wykresy FACS pokazują poziomy ekspresji markerów powierzchniowych hESC, w tym antygeny embrionalne specyficzne dla danego stadium SSEA 4.

figure-protocol-3
Rysunek 2. (A) Reprezentatywne obrazy morfologii endodermy wątroby pochodzącej z hESC w 9. dniu różnicowania obserwowanego w hodowli, przy powiększeniach x4 i x10 w mikroskopii z kontrastem fazowym. (B) Charakterystyka zmian w ekspresji genów. RNA wyekstrahowano, a cDNA przeanalizowano za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy, wykazując postępującą regulację w dół ekspresji genów niezróżnicowanych komórek (Oct-3/4) i (C) regulację w górę ekspresji genów hepatocytów (albuminy i α-fetoproteiny). Ekspresja względna odnosi się do fałd indukcji w porównaniu z endogenną kontrolą genu, β-2-mikroglobuliną w dniu 0 różnicowania. P<0,05 jest oznaczane *, a P<0,001 jest oznaczane *** mierzone za pomocą testu t uczniów w porównaniu z ludzkimi komórkami macierzystymi w dniu 0. Słupki błędów reprezentują 1 odchylenie standardowe.

figure-protocol-4
Rysunek 3. Charakterystyka endodermy wątrobowej pochodzącej z komórek macierzystych hESC
Immunocytochemia wykazująca ekspresję markerów hepatocytów, albuminy, AFP i E-kadheryny w endodermie wątroby pochodzącej z hESC (H9). Przeprowadzono kontrole ujemne z odpowiednią immunoglobuliną G (IgG) i pokazano obrazy przedstawicieli.

figure-protocol-5
Rysunek 4. HLC pochodzące z hESC (H9) wykazują aktywność metaboliczną. W dniu 17 H9 różnicowane do HLC wykazywały aktywność metaboliczną CYP3A (n = 6).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opracowaliśmy prosty, jednorodny i wysoce odtwarzalny model in vitro , aby wygenerować skalowalne poziomy ludzkich HLC. Nasz model został zweryfikowany przez szereg współpracujących z nami zewnętrznych laboratoriów. Rutynowo charakteryzujemy HLC pochodzące z komórek macierzystych, korzystając z naszego wewnętrznego zestawu narzędzi markerów rozwojowych i testów funkcjonalnych specyficznych dla wątroby (z których większość jest dostępna na rynku). Krytycznymi etapami naszego procesu są: utrzymanie pluripotencji k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Dr Hay był wspierany przez stypendium RCUK, dr West był wspierany przez Departament Chirurgii, dr Medine był wspierany przez grant z BHF Core Fund, Pan Baltasar Lucendo-Villarin był wspierany przez studia doktoranckie MRC. Dr Zhou otrzymał stypendium od rządu chińskiego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze

Płytki i kolby powlekające Matrigel

  1. Matrigel (10 mL, BD Biosciences, Wielka Brytania); przechowywać w temperaturze -20°C.
  2. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, Wielka Brytania); przechowywać w 4°C.
  3. Płytki do hodowli tkankowych (6 dołków, 12 well, Corning, Wielka Brytania)
  4. Kolba do hodowli tkankowych (25 cm2 wentylowana, Corning, Wielka Brytania)

hESC Maintenance

  1. Mysza pożywka kondycjonowana fibroblastami embrionalnymi (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, Stany Zjednoczone); przechowywać w temperaturze -20°C.
  2. BSA roztwór (50 ml, Sigma Aldrich, Wielka Brytania); przechowywać w temperaturze 4°C.
  3. Ludzki podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (100 μ g, Peprotech, Stany Zjednoczone); przechowywać w temperaturze -20°C.

Pasażowanie hESC za pomocą kolagenazy

  1. Studzienka zlewająca lub kolba hESCs.
  2. Studzienki lub kolby pokryte Matrigelem, w zależności od potrzeb.
  3. Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (-MgCl2, -CaCl2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, Wielka Brytania); przechowywać w temperaturze pokojowej.
  4. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, Wielka Brytania); przechowywać w 4°C.
  5. Mysza pożywka kondycjonowana fibroblastami embrionalnymi (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, Stany Zjednoczone).
  6. Ludzki zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (100 μ g, Peprotech, USA).

Różnicowanie hESC do endodermy wątrobowej

  1. RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, Wielka Brytania); przechowywać w 4°C.
  2. B27 Suplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, Wielka Brytania); przechowywać w temperaturze -20°C.
  3. Activin A (2 μ g, Peprotech, Stany Zjednoczone); przechowywać w temperaturze -20°C.
  4. Rekombinowana mysz Wnt3a (2 μ g, R & D Systems, Stany Zjednoczone); przechowywać w temperaturze -20°C.
  5. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, Wielka Brytania); przechowywać w 4°C.
  6. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, Wielka Brytania); przechowywać w temperaturze -20°C.
  7. Aminokwasy endogenne (100 mL, Gibco, Invitrogen, Wielka Brytania); przechowywać pod adresem 4°C.
  8. β-Mercapt– tanol (10 ml, Gibco, Invitrogen, Wielka Brytania); przechowywać pod adresem 4°C.
  9. DMSO (Sigma Aldrich, Wielka Brytania); przechowywać w temperaturze pokojowej
  10. Leibovitz L-15 pożywka hodowlana (500 ml, Sigma Aldrich, Wielka Brytania); przechowywać w 4°C.
  11. bulion fosforanowo-tryptozowy (100 mL, Sigma Aldrich, Wielka Brytania); przechowywać pod adresem 4°C.
  12. F– tal surowica bydlęca, inaktywowana termicznie (500 mL, Gibco, Invitrogen, Wielka Brytania); przechowywać w temperaturze -20°C.
  13. Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, Wielka Brytania); przechowywać w temperaturze -20°C.
  14. Insulin (trzustka bydlęca) (100 mg, Sigma Aldrich, Wielka Brytania); przechowywać w temperaturze -20°C.
  15. L-Glutamina (100 mL, Gibco, Invitrogen, Wielka Brytania); przechowywać w temperaturze -20°C.
  16. Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, Wielka Brytania); przechowywać w temperaturze -20°C.
  17. Human HGF (10 μ g, Peprotech, Stany Zjednoczone); przechowywać w temperaturze -20°C.
  18. Rekombinowana ludzka onkostatyna M (OSM) (50 μ g, R & D Systems, Stany Zjednoczone); przechowywać w temperaturze -20°C.
  19. Jednostka filtrująca napędzana strzykawką 0,22 μ m (Millipore, UK)

Charakterystyka endodermy wątrobowej pochodzącej z hESC

Immunostaining

  1. Sól fizjologiczna z buforu fosforanowego (-MgCl2, -CaCl2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, Wielka Brytania); przechowywać w temperaturze pokojowej.
  2. PBST, PBS składa się z 0,1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, Wielka Brytania).
  3. Paraformaldehyd (PFA) (Sigma-Aldrich, Wielka Brytania) składa się z PBS, przechowuj -20°C.
  4. Glycerol (Sigma-Aldrich, Wielka Brytania), przechowuj w temperaturze pokojowej.
  5. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), przechowywać w temperaturze pokojowej.
  6. Ethanol
  7. Serum (AbD Serotech, Wielka Brytania), przechowywać w temperaturze -20°C.
  8. Przeciwciało wtórne, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, Wielka Brytania).
  9. MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) składa się z Tris HCL i glicerolu zgodnie z instrukcjami producenta. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Wielka Brytania) dodaje się do roztworu MOWIOL w rozcieńczeniu 1:1000.
Przeciwciała pierwotne
Antygen* TypDostawcaRozcieńczenie
ALBMouse monoklonalnySigma Aldrich1/500
E-CadherinMouse monoklonalnyMillipore1/100
&alfa;-fetoproteinaMysz monoklonalnaSigma1/500
SSEA-4 FITCMysz monoklonalnaBiolegend1/100
IgGMysi monoklonalnyDAKO1/500
Przeciwciała wtórne
Przeciw mysim koniugatom FITCGoat MonoclonalInvitrogen1/400

Tabela 2. Przeciwciała stosowane do immunobarwienia endodermy wątroby pochodzącej z hESC, zastosowane stężenia, gatunki, w których zostały wyhodowane i firmy, od których zostały zakupione.

Analiza funkcjonalna endodermy wątrobowej i normalizacji (na białko mg)

Biała płaska płytka testowa 96 dołków z płaskim dnem (BD Biosciences, Wielka Brytania).

  • BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Wielka Brytania).
  • Przezroczysta 96-dołkowa płytka testowa (IWAKI, Wielka Brytania)

    • Bibliografia

    1. Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology. J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).
    2. Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism. Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).
    3. Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice. Liver International. 31, 254-262 (2011).
    4. Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening. Toxicology. 278, 250-255 (2010).
    5. Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery. Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).
    6. Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation. Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).
    7. Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).
    8. Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).
    9. Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment. Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).

    Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

    Przedruki i uprawnienia

    Tagi

    ludzkie embrionalne kom rki macierzysteendoderma definitywnaendoderma w trobowaprotok r nicowaniacytometria przep ywowaWestern blotimmunofluorescencjametabolizm lek wmikroskopia w kontra cie fazowym
    Solidna generacja komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych populacji komórek macierzystych
    Skontaktuj się z nami
    Poleć bibliotece

    Prywatność

    Warunki korzystania z usługi

    Zasady

    Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.