Artykuł metodologiczny

Obrazowanie wapniowe odpowiedzi wywołanych zapachami w płacie antennym Drosophila

27.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2976

⸱

14 marca 2012

 ,  ,  , 
1Center for Integrative Genomics, University of Lausanne, 2Department of Biology, University of Konstanz

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy uznaną technikę pomiaru i analizy odpowiedzi wapniowych wywołanych zapachami w płacie antennym żywych Drosophila melanogaster.

Streszczenie

Płatek czułkowy jest głównym centrum węchowym w mózgu owadów i stanowi anatomiczny oraz funkcjonalny odpowiednik opuszki węchowej kręgowców1-5. Informacje węchowe ze świata zewnętrznego są przekazywane do płatka czułkowego przez sensoryczne neurony węchowe (OSNs), które segregują się do odrębnych obszarów neuropila zwanych kłębuszkami, w zależności od specyficznego receptora węchowego, który eksponują. Tutaj aksony OSN tworzą synapsy zarówno z lokalnymi neuronami interneuronami (LNs), których wypustki mogą unerwiać wiele różnych kłębuszków, jak i z neuronami projekcyjnymi (PNs), które przekazują informacje węchowe do wyższych ośrodków węchowych mózgu.

Obrazowanie optyczne aktywności OSN, LN i PN w płacie antennym – tradycyjnie z wykorzystaniem syntetycznych wskaźników wapnia (np. calcium green, FURA-2) lub barwników wrażliwych na napięcie (np. RH414) – od dawna stanowi ważną technikę pozwalającą zrozumieć, w jaki sposób bodźce zapachowe są reprezentowane jako przestrzenne i czasowe wzorce aktywności kłębków u wielu gatunków owadów6-10. Opracowanie genetycznie kodowanych reporterów aktywności neuronalnej, takich jak fluorescencyjne wskaźniki wapnia G-CaMP11,12 i Cameleon13, bioluminescencyjny wskaźnik wapnia GFP-aequorin14,15 lub reporter transmisji synaptycznej synapto-pHluorin16, sprawiło, że układ węchowy muszki owocówki, Drosophila melanogaster, stał się szczególnie podatny na obrazowanie neurofizjologiczne, co uzupełnia jej kompleksowo opisane właściwości molekularne, elektrofizjologiczne i neuroanatomiczne2,4,17. Reportery te mogą być selektywnie ekspresowane za pomocą binarnych systemów kontroli transkrypcyjnej (np. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, system Q21) w określonych populacjach neuronów w obrębie obwodów węchowych, aby z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową przeanalizować, w jaki sposób wywołana zapachami aktywność neuronalna jest reprezentowana, modulowana i przekształcana22-24.

Opisujemy tutaj metody przygotowania i analizy służące do pomiaru odpowiedzi wywołanych zapachami w płacie antennalnym Drosophila z wykorzystaniem G-CaMP25-27. Przygotowanie zwierzęcia jest małoinwazyjne i może być dostosowane do obrazowania z użyciem fluorescencji w szerokim polu, mikroskopii konfokalnej oraz dwufotonowej.

Protokół

1. Montaż bloku mocującego

  1. Blok montażowy z pleksiglasu (Rycina 1A) powinien zostać wykonany zgodnie z dokładnymi specyfikacjami podanymi w schemacie (dostępnym pod adresem
    http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint), aby umożliwić łatwy montaż i sekcję muchy. Wkręć śruby od tyłu, ale nie wysuwaj ich poza przednią część bloku; ich pozycja zostanie dostosowana podczas przygotowania zwierzęcia (patrz pkt 2.7).
  2. Za pomocą wiertła precyzyjnego wykonaj wgłębienie w górnej krawędzi okrągłej komory dla muchy, pogłębiając je pod powierzchnią, aby stworzyć miejsce na ciało muchy, zmniejszając w tym punkcie grubość bloku.
  3. Przetnij skalpelem miedzianą siatkę prostopadle i blisko dna szczeliny, aby utworzyć „kołnierz”. Upewnij się, że dwie powstałe klapy są wyrównane, co ułatwi włożenie muchy.
  4. Za pomocą wykałaczki nałóż małą kroplę superkleju na blok montażowy nad okrągłą komorą dla muchy. Połóż miedzianą siatkę na kleju i ustaw ją tak, aby szczelina znajdowała się w centrum bloku (Rycina 1A). Delikatnie dociśnij i usuń nadmiar kleju. Za pomocą pęsety dodaj niewielkie krople kleju pod klapami po obu stronach i zagnij siatkę nad przednią częścią bloku tak, aby szczelina była skierowana prosto w dół. Upewnij się, że górna krawędź siatki jest zrównana z blokiem. Pozostaw do całkowitego wyschnięcia.
  5. Złóż uchwyt drutu: przetnij plastikowe szkiełko podstawne na pół i usuń środkowy fragment, aby uzyskać kształt litery „U”. Użyj wosku pszczelego, aby przykleić odcinek drutu w poprzek górnej części litery „U”; nie napinaj drutu zbyt mocno.
  6. Wykonaj osłonę antenną: zrób otwór w plastikowym szkiełku podstawnym za pomocą dziurkacza. Przytnij krawędzie szkiełka do wymiarów 0.5 x 0.7 cm. Przyklej perforowane szkiełko do taśmy klejącej, a następnie nanieś kroplę etanolu na taśmę widoczną przez otwór, aby usunąć klej.

2. Przygotowanie zwierząt

  1. Muchy o odpowiednim genotypie – tzn. posiadające pożądaną kombinację transgenów „drivera” i reportera aktywności – powinny być w wieku od 1 do 3 tygodni; kutykula młodszych much jest zbyt miękka i trudna do rozcięcia. Gdy eksperymenty wymagają bezpośredniego porównania różnych genotypów, a w celu ujednolicenia poziomów ekspresji transgenów, muchy powinny być w tym samym wieku, aby uniknąć różnic fizjologicznych związanych z wiekiem. Jeśli płeć nie ma znaczenia, zaleca się używanie samic, ponieważ mają one większe głowy i są łatwiejsze w manipulacji.
  2. Znieczul muchy poprzez schłodzenie na lodzie.
  3. Wprowadź pojedynczą muchę do bloku montażowego. Trzymając muchę za staw skrzydła, wsuń ją powierzchnią grzbietową wzdłuż szczeliny miedzianej siatki tak, aby zwisała na szyi (Rysunek 1B-C). W razie potrzeby obróć ją, aż będzie skierowana głową w dół.
  4. Umieść cienki kolec kaktusa przed głową muchy, aby zapobiec jej ucieczce (Rysunek 1B-C). Umieść kolec kaktusa przed trąbką, aby zapobiec jej ruchom. Przymocuj kolec kaktusa do bloku za pomocą wosku pszczelapsed. Upewnij się, że czubek głowy znajduje się na poziomie górnej krawędzi bloku.
  5. Przymocuj głowę muchy do bloku małą kroplą kalafonii (rozpuszczonej w etanolu). Umieść blok w nawilżonym pojemniku i pozostaw kalafonię do utwardzenia na około jedną godzinę.
  6. Używając pęsety, odciągnij płytkę antenalną do przodu i umieść drut na uchwycie (stroną woskową na zewnątrz; patrz 1.5) w fałdzie kutykuli między anteną a głową. Przymocuj uchwyt do przodu bloku za pomocą wosku pszczelapsed.
  7. Używając śrub wbudowanych w blok, delikatnie pchnij uchwyt drutu do przodu, aby stworzyć przestrzeń między płytką antenalną a głową.
  8. Umieść osłonę antenalną (patrz 1.6) nad głową muchy, pozycjonując otwór centralnie. Przymocuj ją woskiem pszczelapsed do górnej części bloku montażowego.
  9. Za pomocą noża-dzielnika wytnij mały otwór w taśmie na osłonie, odsłaniając kutykulę głowy muchy za anteną. Otwór nie powinien wykraczać poza oczy, aby zapobiec wyciekom z preparatu.
  10. Uszczelnij otwór między taśmą a kutykulą silikonem dwuskładnikowym. Usuń nadmiar silikonu z wierzchu głowy muchy.
  11. Nanieś kroplę soli Ringera dla Drosophila (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 36 mM sacharozy, 5 mM HEPES, pH 7.3) na głowę. Upewnij się, że nie ma wycieków: anteny powinny pozostać całkowicie suche. Używając ostrza szafirowego, przetnij kutykulę. Najpierw lekko nacinaj wzdłuż fałdu kutykuli bezpośrednio za anteną, następnie tnij wzdłuż oczu i przez ocelli z tyłu. Na koniec zagnij fragment kutykuli po naciętej krawędzi i przetnij od spodu, aby uniknąć przecięcia nerwów antenalnych.
  12. Ostrożnie usuń gruczoły i tchawki za pomocą cienkiej pęsety. Wielokrotnie płucz solą Ringera dla Drosophila, pozostawiając dużą kroplę na głowie.

3. Podawanie bodźca zapachowego

  1. Strzykawki zapachowe: za pomocą czystej pęsety umieść wkład z celulozy w plastikowej strzykawce o pojemności 2 ml i nanieś na niego (używając końcówek z filtrem) 20 μl zapachu, rozcieńczonego zgodnie z potrzebą w odpowiednim rozpuszczalniku, przesuwając wkład głęboko do cylindra za pomocą końcówki pipety. Zamknij i zakapsluj strzykawkę do czasu użycia. Świeże rozcieńczenia zapachów należy przygotowywać co najmniej raz na 3 miesiące (lub częściej w przypadku zapachów wysoce lotnych i/lub często używanych), a nowe wkłady do strzykawek zapachowych należy przygotować bezpośrednio przed każdą sesją rejestracyjną. Nie należy używać wkładów zapachowych w więcej niż trzech stymulacjach, ponieważ stężenie zapachu może ulec spadkowi.
  2. Olfaktometr wykonany na zamówienie (Rycina 2): główny strumień powietrza (1 l/min) jest kierowany przez rurkę teflonową (średnica wewnętrzna 0,4 mm); 27 cm przed wylotem tej rurki dodawany jest pomocniczy strumień powietrza (1 l/min). Oba strumienie powietrza są wytwarzane przez pompy membranowe, a szybkość przepływu jest regulowana przez dwa niezależne przepływomierze. Strumienie powietrza mogą być nawilżane poprzez przepuszczanie ich przez wodę w butelkach myjących gazy, przy czym należy uważać, aby uniknąć nadmiernego nawilżenia (tj. powyżej ~60%). Pomocniczy strumień powietrza jest kierowany albo przez strzykawkę zapachową, albo przez pustą strzykawkę: strzykawki są połączone z przepływem powietrza za pomocą igły strzykawki (średnica zewnętrzna 1,2 mm) przebijającej tłok. Do przełączania między czystym powietrzem a bodźcem zapachowym służy trójdrożny zawór magnetyczny sterowany przez jednostkę sterującą zaworami (np. Harvard Apparatus VC6).

4. Obrazowanie in vivo

  1. Opisujemy tutaj obrazowanie przy użyciu pionowego mikroskopu fluorescencyjnego (np. pionowy mikroskop ze stałym stolikiem Zeiss Axio Examiner D1) wyposażonego w obiektyw wodny 20x (np. Zeiss W "Plan-Apochromat" 20x/1,0 M27 DIC) (Rysunek 2). Do obrazowania z użyciem G-CaMP (podbudzenie/emisja: 48/509 nm) należy zastosować blok filtrów o następujących parametrach: filtr podbudzenia 450-490 nm, lustro dichroiczne (T495LP) oraz filtr emisji 50-50 nm (Chroma ET). Umieść blok montażowy z muchą pod mikroskopem. Ustaw wylot olfaktometru w odległości około 0,5 cm przed czułkami muchy.
  2. Obniż obiektyw, aż dotknie roztworu Ringera na głowie muchy. Patrząc przez okular przy oświetleniu w polu jasnym, ustaw preparat tak, aby otwór w torebce głowy znajdował się w centrum i jego krawędzie były w ostrości. Przełącz na światło fluorescencyjne i reguluj ostrość, aż zobaczysz znakowane neurony (widoczne dzięki podstawowej zielonej fluorescencji G-CaMP).
  3. Dokonaj precyzyjnego ustawienia ostrości na interesujące kępki (glomeruli), wykonując zdjęcia za pomocą kamery o ładunkach sprzężonych (CCD) (np. system kamery cyfrowej CoolSNAP-HQ2) zamontowanej na mikroskopie, korzystając z odpowiedniego oprogramowania do akwizycji (np. Metafluor) (Rysunek 3A). Przymknij przysłonę w torze światła oświetlającego, aby ograniczyć światło podbudzenia do obrazowanego obszaru.
  4. Aby zarejestrować aktywność wywołaną zapachem, ustaw częstotliwość akwizycji na 4 Hz i dostosuj czas ekspozycji tak, aby uzyskać wartości fluorescencji w zakresie dynamicznym kamery CCD, lecz nie niższe niż 10 (jednostek arbitralnych), przy rozdzielczości dynamicznej co najmniej 12 bitów. Czas ekspozycji nie powinien przekraczać 100 ms, jeśli to możliwe, aby zredukować fotowyblakanie G-CaMP. Jeśli rozdzielczość przestrzenna kamery na to pozwala, można zwiększyć binning (liczbę studni na chipie, które zostaną połączone w jeden cyfrowy piksel), aby skrócić czas ekspozycji. Uzyskujemy obrazy o wymiarach 350x25 pikseli (przy binningu 2x2), co odpowiada 210x135 μm w preparacie. Ustawienia te są optymalne do rejestracji odpowiedzi kępek indukowanych zapachem dla G-CaMP z dobrą rozdzielczością przestrzenną i czasową, przy jednoczesnym ograniczeniu wyblakania reportera.
  5. Ustaw parametry pomiaru. Zazwyczaj rejestrujemy sygnał przez 10 sekund (tj. 40 klatek), przy czym stymulacja zapachem rozpoczyna się zazwyczaj 4 sekundy po rozpoczęciu okresu akwizycji (klatka 15) i trwa jedną sekundę (do klatki 19). Preparat z muchy można zazwyczaj przetestować z maksymalnie 25-30 różnymi bodźcami zapachowymi, co często jest ograniczone przez nieodwracalny spadek sygnału fluorescencyjnego reportera w wyniku fotowyblakania. Interwał między bodźcami będzie zależał od obserwowanej siły odpowiedzi oraz tempa fotowyblakania. Odpowiednią długość interwału między bodźcami w celu uniknięcia adaptacji sensorycznej można określić w przybliżeniu poprzez wielokrotną prezentację zapachu kontrolnego dodatniego (jeśli jest znany) w eksperymentach próbnych. Włączanie tego zapachu co około 10 bodźców w danej serii pozwala na weryfikację utrzymania żywotności i spójnej reaktywności preparatu.

5. Przetwarzanie i analiza danych

Dane są przetwarzane przy użyciu programu ImageJ (z wtyczką Mac biophotonics, www.macbiophotonics.ca) oraz specjalnie napisanych programów w środowiskach Matlab i R w następujący sposób:

  1. Koryguj artefakty wynikające z ruchu próbki: wyrównaj wszystkie obrazy odpowiadające jednej preparacji zwierzęcia (np. 30 pomiarów po 40 klatek każdy), korzystając z trybu „rigid body” wtyczki StackReg/TurboReg (bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg) w programie ImageJ. Krok ten jest niezbędny do usunięcia przesunięć pozycji znakowanych neuronów względem ramki akwizycji w obrębie oraz pomiędzy pomiarami. Możliwe jest jednak usunięcie przesunięć jedynie w płaszczyźnie xy. Dane należy odrzucić w przypadku wystąpienia silnych zmian ostrości.
  2. Podziel stos obrazów na poszczególne 10-sekundowe (40-klatkowe) pomiary.
  3. Koryguj artefakty wyblaknięcia: ekspozycja na światło fluorescencyjne powoduje spadek fluorescencji podczas pojedynczego pomiaru10. W niektórych przypadkach istotne jest skorygowanie tego spadku przed analizą danych. Dla każdego pomiaru oblicz klatkę tła. Powinna ona stanowić średnią z kilku klatek przed wystąpieniem bodźca (np. klatki 6-14). Podziel każdą klatkę przez tę klatkę tła, aby uzyskać względne zmiany fluorescencji. Oblicz średnią wartość względnej fluorescencji dla każdej klatki, uśredniając wszystkie piksele w obszarze znakowanym przez G-CaMP. Dopasuj funkcję podwójnej wykładniczej do krzywej średniej fluorescencji, nadając większą wagę klatkom przed bodźcem i zerową wagę czasowi odpowiedzi na zapach (w naszym przypadku 20 klatek po wystąpieniu bodźca). Odejmij dopasowaną krzywą od krzywej względnej fluorescencji każdego piksela. Pomnóż skorygowane klatki przez klatkę tła, aby ponownie uzyskać dane surowe. Tego rodzaju korekcja może prowadzić do modyfikacji dynamiki odpowiedzi, jeśli sygnał nie powróci do poziomu bazowego do końca pomiaru (np. w przypadku wywołania odpowiedzi hamujących lub bardzo silnych odpowiedzi pobudzających) (Rysunek 4). Choć korekcja artefaktów wyblaknięcia jest przydatna w wielu przypadkach, interpretacja parametrów czasowych powinna być przeprowadzona z ostrożnością, jeśli zastosowano korekcję wyblaknięcia.
  4. Oblicz względną zmianę fluorescencji (ΔF/F) dla każdej klatki każdego pomiaru według wzoru (Fi-F0)/F0*10, gdzie F0 to klatka tła (patrz pkt 5.3), a Fi to wartość fluorescencji dla i-tej klatki pomiaru.
  5. Oblicz średnie ΔF/F w obrębie okrągłego obszaru zainteresowania (ROI) w kłębuszku (Rysunek 3B) o średnicy 10 pikseli, aby uzyskać ślady aktywności (Rysunek 5A). W razie potrzeby przekształć te ślady w mapy ciepła za pomocą programu ImageJ (Rysunek 5A).
  6. Oblicz amplitudę szczytową odpowiedzi, odejmując średnie ΔF/F z czterech klatek przed stymulacją od średniego ΔF/F z czterech klatek w szczycie odpowiedzi. Tę samą procedurę stosuje się zarówno do ilustrowania przestrzennych wzorców odpowiedzi (patrz Rysunek 3B), jak i do ilościowego określenia amplitudy odpowiedzi w określonych obszarach zainteresowania u różnych much (patrz Rysunek 5B). Szczytową odpowiedź można również określić ilościowo poprzez całkowanie pola pod krzywą w czasie trwania bodźca lub uśrednianie klatek wokół maksimum odpowiedzi.

6. Reprezentatywne wyniki

Powyższe protokoły wykorzystano do rejestracji i analizy odpowiedzi wywołanych kwasem propionowym u muszek wykazujących ekspresję G-CaMP1.628 pod kontrolą promotora koreceptora węchowego IR8a, który jest aktywny w kilku różnych populacjach OSN29,30 (ryciny 3-5). Stymulacja 1% kwasem propionowym wywołuje wzrost fluorescencji G-CaMP – wskazujący na wzrost poziomu wewnątrzkomórkowego wapnia – w OSN unerwiających dwa kłębki, DC4 i DP1l (rycina 3B). Na rycinie 5 przedstawiamy różne sposoby prezentacji danych z wielu muszek: ślady aktywności linii, mapy ciepła oraz wykres słupkowy odpowiedzi szczytowych. Odpowiedzi wywołane kwasem propionowym charakteryzują się odmiennymi amplitudami szczytowymi i dynamiką czasową w kłębkach DC4 i DP1l. Ponadto, choć odpowiedzi są zazwyczaj silne, w obu kłębkach można zaobserwować zmienność między poszczególnymi osobnikami (patrz: mapy ciepła na rycinie 5A). Ilościowe określenie odpowiedzi szczytowych (rycina 5B) umożliwia proste porównanie statystyczne między różnymi kłębkami i różnymi substancjami zapachowymi u różnych zwierząt. Jednak odpowiedzi wapniowe wywołane zapachami mogą wykazywać niejednorodną dynamikę czasową, a określanie ich wielkości za pomocą pojedynczej wartości pomija tę złożoność.

Układ eksperymentalny do neurobiologii owadów; schemat z siatką miedzianą, kolcem kaktusa, płatem antenalnym.
Rycina 1. Schemat bloku montażowego (A) przed i (B) po wprowadzeniu muchy oraz (C) widok z góry w dużym powiększeniu (zaadaptowano z31).

Schemat olfaktometru z źródłem światła, kamerą CCD oraz fluorescencją w płatach antenowych do analizy zapachów.
Rysunek 2. Schemat układu eksperymentalnego.

Odpowiedź płata antenalnego na kwas propionowy, schemat obrazowania wapnia, analiza szczytowej amplitudy %ΔF/F.
Rysunek 3. (A) Widok z góry preparatu muchy po kroku 2.8 (panel lewy) oraz surowy obraz fluorescencyjny płatów antenowych oznakowanych G-CaMP1.6 (Genotyp: Promotor IR8a:GAL4; UAS:G-CaMP1.6). Kłębuszki DC4 i DP1l można odróżnić na podstawie ich morfologii, wielkości oraz położenia; są one zaznaczone odpowiednio kolorem czerwonym i niebieskim.
(B) Obraz w kolorach przedstawiający odpowiedź na kwas propionowy (1% v/v). Obraz odpowiada wartości ΔF/F dla szczytu odpowiedzi, obliczonej zgodnie z opisem w kroku 5.6 (patrz również Rys. 5A). Skala kolorów po lewej stronie wskazuje wartość %ΔF/F. Czarne okręgi wskazują położenie i rozmiar obszaru zainteresowania (ROI) wykorzystanego do kwantyfikacji odpowiedzi (patrz Rys. 5).

Wykres odpowiedzi zapachowej przedstawiający korekcję wybielania, zmianę ΔF/F% oraz porównanie danych w sygnale fluorescencji.
Rycina 4. Korekcja wybielania sygnału reportera fluorescencyjnego. Przykłady efektu korekcji wybielania opisanej w kroku 5.3. Dane próbkowania na lewym panelu można skorygować bez znaczących zmian w kształcie odpowiedzi. Dane próbkowania na prawym panelu są w dużym stopniu zmienione przez korekcję wybielania, prawdopodobnie dlatego, że sygnał spada i utrzymuje się poniżej poziomu bazowego po zakończeniu stymulacji zapachowej.

Wykresy zmian fluorescencji; analiza odpowiedzi na zapach, DC4 vs DP1l, z amplitudą szczytową ΔF/F %.
Rysunek 5. (A) Góra: dynamika czasowa odpowiedzi wapniowych kłaczków DC4 (lewo) i DP1l (prawo) na kwas propionowy (1% v/v). Czarne linie przedstawiają medianę średniego ΔF/F w obrębie obszaru zainteresowania (patrz Ryc. 3B) dla ośmiu zwierząt. Szara powierzchnia wskazuje zakres między pierwszym a trzecim kwartylem rozkładu. Przedstawienie wartości mediany i kwartyli dostarcza więcej informacji o zmienności i rozkładzie obserwowanych odpowiedzi niż średnia i błąd standardowy. Zielone i purpurowe ramki wskazują klatki uśrednione w celu obliczenia odpowiedzi szczytowych przedstawionych na Ryc. 3B i ilościowo określonych na Ryc. 5B. Dół: mapy ciepła przedstawiają dane dotyczące odpowiedzi dla wszystkich poszczególnych zwierząt w osobnych rzędach, gdzie wartości ΔF/F są reprezentowane przez skalę kolorystyczną (skrajna prawa strona). Poziome czarne paski wskazują czas i czas trwania bodźca. (B) Mediany odpowiedzi szczytowych na kwas propionowy dla ośmiu zwierząt w kłaczkach DC4 i DP1l. Słupki błędów wskazują zakres między pierwszym a trzecim kwartylem rozkładu.

Dyskusja

Opisane tutaj metody preparowania i analizy mogą być wykorzystane do badania odpowiedzi wywołanych zapachami w dowolnej populacji neuronów w płacie antenalnym (OSNs, LN i PNs), dla której dostępny jest odpowiedni transgen sterujący. Choć opisujemy zastosowanie tej metody z użyciem mikroskopu fluorescencyjnego, obrazowanie optyczne tego preparatu można równie dobrze przeprowadzić za pomocą mikroskopii konfokalnej lub dwufotonowej22,32. Instrumenty te eliminują problem rozpraszania światła występujący w mikroskopii szerokopolowej, co może obniżać rozdzielczość obrazów, zwłaszcza gdy reporter jest ekspresjonowany przez dużą liczbę neuronów. Preparat ten zazwyczaj pozwala na rejestrację odpowiedzi wywołanych zapachami przez co najmniej pół godziny, jednak czas ten może być znacznie dłuższy lub krótszy w zależności od liczby i czasu trwania rejestrowanych pomiarów, czasu ekspozycji dla każdej klatki oraz odstępu między bodźcami. Ponadto wzbudzenie dwufotonowe może ograniczyć fotoblaknięcie reportera fluorescencyjnego, a także fototoksyczność komórkową, co pozwala na prowadzenie pomiarów przez dłuższe okresy czasu22,32.

Niezależnie od wyboru mikroskopu, ruch mózgu muchy wewnątrz kapsuły głowowej jest najczęstszym problemem podczas obrazowania w nienaruszonych zwierzętach. Chociaż korekcja ruchu może rozwiązać drobne problemy (krok 5.1), zazwyczaj lepiej jest rejestrować dane wyłącznie z bardzo stabilnych preparatów. Strategie ograniczające artefakty ruchowe obejmują: (i) odpowiednie unieruchomienie trąbki muchy za pomocą kolca kaktusa; (ii) unieruchomienie nóg muchy poprzez przymocowanie ich do stolika eikosanem (przed krokiem 2.6) (eikosan można stopić w temperaturze ~37 °C; w tym celu należy użyć srebrnego drutu, aby wydłużyć i zwęzić końcówkę lutownicy); (iii) nacięcie przełyku (widocznego pomiędzy nerwami czułkowymi) za pomocą cienkiej pęsety.

Oprócz zastosowanego tutaj G-CaMP1.6 dostępnych jest wiele zoptymalizowanych wersji G-CaMP oraz innych wskaźników wapnia, które różnią się stosunkiem sygnału do szumu, fluorescencją bazową i dynamiką czasową12,28,33. Precyzyjny wybór sensora powinien uwzględniać wszystkie te właściwości, rodzaj analizowanych neuronów oraz badane zagadnienie biologiczne. Obecne sensory raportują zmiany poziomu wapnia, które dość dobrze korelują z potencjałami czynnościowymi12,34, a ich dalsze udoskonalanie, w połączeniu z rosnącą liczbą specyficznych genetycznych linii sterujących35, będzie nadal zwiększać potencjał obrazowania optycznego aktywności neuronalnej w nienaruszonej muszce.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Pragniemy podziękować Silke Sachse i Beate Eisermann za pomoc w opracowaniu tej metodologii, Pablo Traversie za przygotowanie projektów bloku montażowego oraz Danieli Pelz za udostępnienie schematu zamieszczonego na rysunku 1. Jesteśmy wdzięczni Silke Sachse, Pavan Ramdye i Raphael Rytz za uwagi do manuskryptu. R. Bell otrzymuje wsparcie w ramach stypendium doktoranckiego Boehringer Ingelheim Foundation. Badania w laboratorium R. Bentona są finansowane z grantu European Research Council Starting Independent Researcher oraz przez Swiss National Science Foundation.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolec kaktusaCentrum ogrodnicze~7 mm długości, cienki, niezbyt elastyczny
KalafoniaSklep z instrumentami strunowymi
Dwuskładnikowy silikonWorld Precision Instruments, Inc.KWIK-SIL
Niestandardowy pleksiglasowy blok montażowyfigure-materials-1 Dostępne schematy
Siatki miedzianeSiatki AtheneG20-5Zazwyczaj stosowane do próbek do mikroskopii elektronowej.
ŚrubySklep z artykułami budowlanymiśrednica 2 mm
Plastikowe szkiełka nakrywkiPlano GmbHL41932 x 2 mm
Głowice lutowniczeConrad Electronics830283-62
Stabilizowany zasilaczConrad Electronics511407-62
Cienki drutIsabellenhütteIsa-ohm0,013 mm
EikosanSigma-Aldrich21,927-4
MikroskopCarl Zeiss, Inc.Axioexaminer D1
kamera CCDVisitron SystemsCoolSnap HQ
MetafluorSystemy VisitronOprogramowanie do akwizycji danych
MonochromatorVisitron SystemsVisichrome
Łamliwe ostrzaFine Science Tools10050-00
Uchwyt do ostrzaWorld Precision Instruments, Inc.14134
Ostrze szafiroweWorld Precision Instruments, Inc.500314Ostrze dwustronne 1 mm
Membranowe pompy gazoweKNF NeubergerNMP 830 KVE
Uchwyt do ostrzy szafirowychWorld Precision Instruments, Inc.500317
Zawór trójdrożnyLee CompanyLFAA12018HKonfiguracja E
Rotametr 50 ml/minAnalyt-MTC12-08SA
Rotametr 5 l/minAnalyt-MTC102-08SA
Wosk pszczeliTechnika Siladent209212
Wkład z celulozyKettenbach31003
PęsetaPlano GmbHT5130Biologia Dumont #5
StrzykawkiBD Biosciences3009282 ml, Discardit II, 2 sztuki
IgłyBraun Sterican46651201,2 mm średnicy zewnętrznej

Bibliografia

  1. Galizia, C. G., Rossler, W. Parallel olfactory systems in insects: anatomy and function. Annu. Rev. Entomol. 55, 399-420 (2010).
  2. Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular Architecture of Smell and Taste in Drosophila. Annu. Rev. Neurosci. 30, 505-533 (2007).
  3. Wilson, R. I., Mainen, Z. F. Early events in olfactory processing. Annu. Rev. Neurosci. 29, 163-201 (2006).
  4. Masse, N. Y., Turner, G. C., Jefferis, G. S. Olfactory information processing in Drosophila. Curr. Biol. 19, 700-713 (2009).
  5. Hansson, B. S., Anton, S. Function and morphology of the antennal lobe: new developments. Annu. Rev. Entomol. 45, 203-231 (2000).
  6. Galizia, C. G., Joerges, J., Kuttner, A., Faber, T., Menzel, R. A semi-in-vivo preparation for optical recording of the insect brain. J. Neurosci. Methods. 76, 61-69 (1997).
  7. Galizia, C. G., Menzel, R., Holldobler, B. Optical imaging of odor-evoked glomerular activity patterns in the antennal lobes of the ant Camponotus rufipes. Naturwissenschaften. 86, 533-537 (1999).
  8. Okada, K., Kanzaki, R., Kawachi, K. High-speed voltage-sensitive dye imaging of an in vivo insect brain. Neurosci. Lett. 209, 197-200 (1996).
  9. Carlsson, M. A., Knusel, P., Verschure, P. F., Hansson, B. S. Spatio-temporal Ca2+ dynamics of moth olfactory projection neurones. The European journal of neuroscience. 22, 647-657 (2005).
  10. Galizia, C. G., Vetter, R. S. Methods in Insect Sensory Neuroscience (Frontiers in Neuroscience). Christensen, T. A. 13, CRC Press. 349-392 (2005).
  11. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
  12. Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
  13. Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 2135-2140 (1999).
  14. Martin, J. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brulet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2, 275-275 (2007).
  15. Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. The Journal of Experimental Biology. 213, 4163-4173 (2010).
  16. Yuste, R., Miller, R. B., Holthoff, K., Zhang, S., Miesenbock, G. Synapto-pHluorins: chimeras between pH-sensitive mutants of green fluorescent protein and synaptic vesicle membrane proteins as reporters of neurotransmitter release. Methods Enzymol. 327, 522-546 (2000).
  17. Benton, R. Sensitivity and specificity in Drosophila pheromone perception. Trends Neurosci. 30, 512-519 (2007).
  18. Elliott, D. A., Brand, A. H. The GAL4 system : a versatile system for the expression of genes. Methods Mol. Biol. 420, 79-95 (2008).
  19. Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).
  20. Yagi, R., Mayer, F., Basler, K. Refined LexA transactivators and their use in combination with the Drosophila Gal4 system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16166-16171 (2010).
  21. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q System: A Repressible Binary System for Transgene Expression, Lineage Tracing, and Mosaic Analysis. Cell. 141, 536-548 (2010).
  22. Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112, 271-282 (2003).
  23. Fiala, A. Genetically expressed cameleon in Drosophila melanogaster is used to visualize olfactory information in projection neurons. Curr. Biol. 12, 1877-1884 (2002).
  24. Ng, M. Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly. Neuron. 36, 463-474 (2002).
  25. Sachse, S. Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit. Neuron. 56, 838-850 (2007).
  26. Pelz, D., Roeske, T., Syed, Z., de Bruyne, M., Galizia, C. G. The molecular receptive range of an olfactory receptor in vivo (Drosophila melanogaster Or22a). J. Neurobiol. 66, 1544-1563 (2006).
  27. Silbering, A. F., Galizia, C. G. Processing of odor mixtures in the Drosophila antennal lobe reveals both global inhibition and glomerulus-specific interactions. J. Neurosci. 27, 11966-11977 (2007).
  28. Reiff, D. F. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
  29. Abuin, L. Functional architecture of olfactory ionotropic glutamate receptors. Neuron. 69, 44-60 (2011).
  30. Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. B. Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila. Cell. 136, 149-162 (2009).
  31. Pelz, D. Functional characterization of Drosophila melanogaster Olfactory Receptor Neurons. , Freien Universitat Berlin. (2005).
  32. Ai, M. Acid sensing by the Drosophila olfactory system. Nature. 468, 691-695 (2010).
  33. Martin, J. R. In Vivo Brain Imaging: Fluorescence or Bioluminescence, Which to Choose? Journal of Neurogenetics. , 1-23 (2008).
  34. Jayaraman, V., Laurent, G. Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies. Front. Neural Circuits. 1, 3-3 (2007).
  35. Pfeiffer, B. D. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9715-9720 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

czujnik GCaMPneurony sensoryczne węchuneurony projekcyjnelokalne interneuronyaktywność kłębkówmikroskopia fluorescencyjnastymulacja zapachowa
Obrazowanie wapniowe odpowiedzi wywołanych zapachami w płacie antennym Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.