Perfuzja wątroby myszy in vivo: metoda podawania roztworu do wątroby gryzoni przez żyłę wrotną

Streszczenie

Źródło: Cabral, F., et al. Oczyszczanie hepatocytów i sinusoidalnych komórek śródbłonka z perfuzji wątroby myszy. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film opisuje procedurę perfuzji wątroby myszy przez żyłę wrotną za pomocą roztworu kolagenazy przed izolacją komórek wątroby.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie

1. Przygotowanie roztworów i pożywek hodowlanych
   1. Przygotować wszystkie pożywki hodowlane i bufor zgodnie z tabelą materiałów.
2. Przygotowanie instrumentów
   1. Ustawić łaźnię wodną (>10 l) o temperaturze 42 °C, pompę perystaltyczną o zmiennej prędkości obrotowej i zaciski do trzymania kolb. Przygotuj zakrzywione nożyczki i kleszcze (ryc. 1).
   2. Na łaźni wodnej lub w jej sąsiedztwie ułóż blachę do pieczenia (około 38 x 26 cm) z podkładką styropianową (stożkowy ruszt o pojemności 50 ml), pokrytą chłonnym podkładem pociętym na kawałek o wymiarach 20 x 20 cm (ryc. 1).
   3. Umieść kawałek taśmy maskującej (5–8 cm) w pobliżu. Umieść w pobliżu poliestrową nić do szycia o długości 20 cm, która jest przycięta i gotowa do użycia. Zaopatrzyć się w plastikowy cewnik z wysuwaną igłą (7 mm x 19 mm, ryc. 1).
3. Przygotowanie wyrobów szklanych
   1. Za pomocą zacisków umieścić i unieruchomić kolbę o pojemności 1 l w łaźni wodnej zawierającej 200 ml 1x PBS z korkiem zawierającym dwie pipety o pojemności 1 ml wprowadzane do roztworu. Gumowy korek jest nacięty, aby umożliwić recyrkulację płynu w obiegu zamkniętym.
   2. Za pomocą kolejnego zacisku umieścić kolbę o pojemności 125 ml zawierającą 45 ml buforu 2 wraz z korkiem zawierającym dwie pipety o pojemności 1 ml, z których jedna znajduje się w cieczy w pobliżu dna kolby, a druga, która pozostaje nad cieczą i wdmuchuje tlen do kolby.
      nuta: Każda pipeta w korkach będzie wyposażona w adapter szybkiego odłączania przymocowany do końca, który ułatwia wymianę rurki. Tlen będzie delikatnie przepływał do obu kolb przez pipetę umieszczoną w korku, który nie jest zanurzony w cieczy.
   3. Odłóż na bok dwie sterylne naczynia krystalizujące.

2. Procedura na zwierzętach

1. Podgrzać roztwory PBS i buforu 2 do temperatury 42 °C w łaźni wodnej i cyrkulować PBS przez co najmniej 20 ml/min w rurkach w obiegu zamkniętym, aby utrzymać ciepło w przewodach cieczy. Zanurzyć nadmiar rurki w łaźni wodnej tak, aby pozostał jak najbliżej 42 °C. Opróżnić męski koniec rurki do 1-litrowej kolby zawierającej PBS.
2. Umieścić wacik na podkładce chłonnej i dodać około 2 ml 30% izofluranu (wypełnionego glikolem polietylenowym 200, który zmniejsza szybkość parowania izofluranu) na wacik za pomocą pipety transferowej.
3. Podnieś mysz za ogon, umieść ją w jednym z krystalizujących się naczyń, a następnie szybko przewróć naczynie na wacik, aby mysz miała niewielką przestrzeń, w której może wdychać znieczulenie. Obserwuj częstość oddechów myszy i upewnij się, że mysz jest skutecznie pod narkozą.
   nuta: Częstość oddechów powinna być wolniejsza i głębsza, ogon wiotki, a łapy nie reagują na test szczypania w znieczuleniu; Dodatkowe informacje można znaleźć w wytycznych IACUC.
4. Podczas gdy mysz jest poddawana znieczuleniu (trwa to 1–2 minuty), przygotuj cylinder strzykawki o pojemności 10 ml, wyciągając tłok i wkładając mały wacik. Dodaj 1-2 ml 30% izofluranu za pomocą pipety transferowej do wacika wewnątrz beczki i połóż lufę otwartym końcem na stole, czekając, aż mysz straci przytomność.
5. Szybko zdejmij naczynie krystalizujące, odwróć mysz na plecy i umieść cylinder strzykawki na jego nosie. Dokładnie sprawdź częstość oddechów, szczypanie palców u nóg i wiotki ogon. Wszelkie reakcje na uszczypnięcie palca u nogi i wiotki ogon wskazują, że mysz nie jest w pełni znieczulona. Trzymaj lufę strzykawki nad pyskiem, aby zachować nieprzytomność.
6. Umieść pinezki w łapach myszy, z kończynami wyciągniętymi w pozycji leżącej. Zwilż brzuch i klatkę piersiową 70% izopropanolem lub etanolem.
7. Trzymając proste kleszcze w jednej ręce, podnieś skórę w pobliżu podstawy brzucha. Z drugiej strony nożyczkami przetnij skórę namiotu i otrzewną. Nacięcie powinno być poziome lub w poprzek podstawy skóry namiotu. Pamiętaj, aby przeciąć wszystkie warstwy skóry i otrzewnej, aby uzyskać dostęp do jelit. Przeciąć bocznie wokół brzucha aż do klatki piersiowej po obu stronach, nie nacinając żadnego z narządów.
8. Odetnij płat skóry, przecinając dolną klatkę piersiową. Przesuń jelita w prawo z tyłem kleszczy, aby odsłonić żyłę wrotną.
   nuta: Krwawienie ze zwierzęcia powinno być minimalne; Zwierzę powinno nadal oddychać i być w głębokim znieczuleniu.
9. Umieść zamknięte zakrzywione kleszcze pod żyłą wrotną między wątrobą a żyłą trzustkowo-dwunastniczą górną (strzałka ryc. 2).
10. Otwórz kleszcze, gdy znajdują się pod żyłą wrotną. Chwyć nić i ostrożnie przeciągnij ją tak, aby znalazła się wyśrodkowana pod żyłą wrotną. Zawiąż węzeł od góry wokół żyły wrotnej, nie zaciskając jej.
11. Umieść zakrzywione kleszcze pod żyłą wrotną i delikatnie pociągnij ją w kierunku ogona myszy, aby wyprostować żyłę (ryc. 3A).
12. Trzymając cewnik w drugiej ręce, umieść skos igły skierowany do góry i równolegle do dolnej części żyły wrotnej w pobliżu kleszczy (ryc. 3B).
13. Delikatnie nakłuć żyłę igłą (ryc. 3C). Upewnij się, że skos igły znajduje się w świetle żyły. Wycofaj igłę obciążoną sprężyną i kontynuuj wpychanie cewnika polimerowego przez żyłę, aż skos znajdzie się w pobliżu rozgałęzionego obszaru żylnego. To jest w wątrobie. Jeśli cewnik zostanie umieszczony prawidłowo, widoczny będzie wsteczny przepływ krwi. (Rysunek 3D).
14. Zaciśnij węzeł nad dłonią i pociągnij go w dół na cewniku, aby go ustabilizować. Natychmiast zmniejsz wydajność pompy z 20 ml/min do 4 ml/min i odetnij kolejne główne naczynie krwionośne w celu drenażu. Wytnij aortę brzuszną, aby uzyskać optymalne rezultaty.
15. Umieść męski koniec rurki na żeńskim końcu cewnika (Rysunek 4A). Upewnij się, że w przewodzie nie ma pęcherzyków powietrza. Należy uważać, aby cewnik nie został wepchnięty do wątroby lub z żyły. Umieszczenie nici nie jest konieczne, chociaż pomaga zapobiegać cofaniu się wody z żyły i pomaga utrzymać cewnik we właściwej pozycji (ryc. 4B, C).
16. Użyj taśmy maskującej, aby unieruchomić rurkę na podkładce. Użyj prostych kleszczy, aby ścisnąć naczynie krwionośne odpływu, aby kilkakrotnie napompować wątrobę, aby upewnić się, że cała krew odpłynęła (ryc. 4D).
    nuta: Standardowa taśma laboratoryjna może nie działać; Jednak taśma maskująca pozostanie przyklejona do podkładu, nawet w mokrych warunkach.

3. Perfuzja wątroby

1. Podczas przepłukiwania wątroby PBS, odmierz około 24 mg kolagenazy typu IV i umieść ją w kolbie zawierającej 45 ml buforu 2 w łaźni wodnej. Należy upewnić się, że płyn w kolbie został zawirowany tak, aby kolagenaza całkowicie się rozpuściła i umieścić kolbę z powrotem w zacisku tak, aby płyn zawierający część kolby był całkowicie zanurzony w wodzie.
2. Obserwuj zmianę koloru wątroby, gdy jest ona przepłukiwana PBS. Wymienić rurkę odpływową z kolby o pojemności 1 l na kolbę o pojemności 125 ml. Nie pozwól, aby pęcherzyki powietrza przedostały się do wątroby.
3. Gdy bufor perfuzyjny dotrze do wątroby, krótko ściśnij mocno naczynie krwionośne odpływu, aby wytworzyć ciśnienie w naczyniu i pozwól, aby ten płyn wypełnił wszystkie płaty wątroby. Należy pamiętać, aby nie odcinać drenażu zbyt długo, ponieważ może to spowodować pęknięcie cienkiej tkanki łącznej otaczającej wątrobę (kapsułkę Glissona) i zniszczyć perfuzję lub przepływ płynu w łożysku kapilarowym wątroby.
4. Pozwól, aby bufor 2 z kolagenazą przeniknął przez wątrobę, aż wszystkie 45 ml przepłynie przez tkankę.
   nuta: Jeśli się powiedzie, kapsułka Glissona powinna zostać oddzielona od miąższu lub tkanki wątroby, a sama wątroba powinna wyglądać na amorficzną.
5. Dodaj około 10 ml buforu 1 do drugiego naczynia krystalizującego i umieść je obok myszy.
6. Wyjmij cewnik i wyłącz pompę.
7. Prostymi kleszczami i nożyczkami odetnij wątrobę od myszy. Jeśli trawienie kolagenazy było bardzo wydajne, może być konieczne posiadanie pod ręką czystej, sterylnej łyżki, aby zgarnąć wątrobę myszy i umieścić ją w buforze 1.

Wyniki

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie zestawu perfuzyjnego. Kolby są utrzymywane na miejscu za pomocą zacisków (nie pokazano); rurka zawierająca płyn jest zamieniana z kolby o pojemności 1 l na kolbę o pojemności 125 ml podczas zabiegu jest reprezentowana przez czerwoną przerywaną linię. Należy pamiętać, że podawany tlen nie dostaje się bezpośrednio do roztworów w kolbach. Korki pow...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 L kolba Erlenmeyera	Fisher Naukowy	Zobacz materiał S63274
Kolba Erlenmeyera 250 ml	Fisher Naukowy	Numer katalogowy S63271
Rurki silikonowe	Cole'a-Parmera	Numer katalogowy 96400-14	Rurka ta biegnie od kolb przez pompę do złącza T, a następnie do strzykawki o pojemności 1,0 ml, która jest podłączona do cewnika.
Rurki Tygon	Fisher Naukowy	Czynnik R3603	Używany jako adapter między 96400-14 a pipetami i złączem T. Może być również używany do przewodów tlenowych.
Łączniki teowe	Cole'a-Parmera	EW-06294-82
Szybkozłączki	Fisher Naukowy	Nr kat. 6150-0010
Zaciski zaciskowe	Fisher Naukowy	6165-0002
Pompa o zmiennej prędkości obrotowej Masterflex L/S; model 7553-70	Cole'a-Parmera	EW-07559-00	Pompa peryplastyczna o zmiennej prędkości obrotowej
Głowica pompy; model 7014-20	Cole'a-Parmera	EW-07014-20
Szklane pipety z podziałką 1,0 ml	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 13-678
Zakrzywione nożyczki bez ząbków	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 14069-12
Kleszcze Dumonta	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 11252-20
Zakrzywione kleszcze	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 13009-12
Strzykawka 10 ml	Fisher Naukowy	03-377-23	Potrzebna będzie tylko beczka ze strzykawką
Łyżka sterylizowana	Sklep z artykułami gospodarstwa domowego
Wacik (kulki)	Sklep z artykułami gospodarstwa domowego
Nić poliestrowa do szycia	Sklep z artykułami gospodarstwa domowego
Taśma maskująca	Sklep z artykułami gospodarstwa domowego
Pinezki na kciuki	Sklep z artykułami gospodarstwa domowego
Podkładka styropianowa	Stojak stożkowy 50 ml
Ciastko/blacha do pieczenia	Sklep z artykułami gospodarstwa domowego
Podkłady chłonne	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 14-206-64
Łaźnia wodna 19 L	Fisher Naukowy	TSCOL19
Osłonięty cewnik dożylny BD Insyte Autogaurd 24 mierniki	Becton Dickinson	381412	Plastikowy cetelek z wysuwaną igłą
Naczynia krystalizujące 100x50	Firma VWR	89000-290
Polistyrenowe szalki Petriego	Sigma Aldrich	P5481-500EA
Probówki stożkowe 50 ml	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 12-565-270
Pipety miarowe (5 ml)	Fisher Naukowy	170355
Pipety miarowe (25 ml)	Fisher Naukowy	170357
Filtr siatkowy EasyStrainer 100 μM	Greiner bio-one	Numer katalogowy: 542000	Filtr 100 μm
Filtr siatkowy EasyStrainer 40 μM	Greiner bio-one	Numer katalogowy: 542040	Filtr 40 μm
Odczynniki
nazwa	związek	Gramy (g/L)	Milimolowy (mM)
Bufor 1; pH 7,4	Zawartość NaCl	8.3	Rozdział 142
	Kcl	0,5	6.7
	HEPESY	2.4	10
	Bsa	15	0,226
Bufor 2; pH 7,4	Zawartość NaCl	3,9	66,74
	Kcl	0,5	6,71
	CaCl2	0,7	Godzina 6.31
	HEPESY	24	100
	Bsa	15	0,226
	Czerwień fenolowa	0,01	0,03
PBS; pH 7,4	Zawartość NaCl	8	Rozdział 137
Kcl	0,2	2.7
Na2HPO4-7H2O	Pytanie 1,15	4.3
KH2PO4	0,2	1.4
INNE ODCZYNNIKI
nazwa	firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolagenaza typu IV	Sigma Aldrich	Zobacz materiał C5138
Izofluran	Księga Abcam	ab144581

powiedział: powiedział: pkt. pkt. powiedział: szt. pkt. pkt. pkt. powiedział: pkt. powiedział: