1. Posiewanie posortowanych komórek nabłonka prostaty do pierwotnej hodowli organoidów myszy — CZAS: 2-3 godziny (z wyłączeniem przygotowania płytki pokrytej poli-HEMA)
UWAGA: Płytki są pokryte Poly-HEMA, aby zapobiec tworzeniu się kolonii 2D na powierzchni studni pod żelem matrycowym. Przygotuj płytki pokryte poli-HEMA 1 dzień przed posiewem posortowanych komórek podstawnego lub luminalnego nabłonka prostaty w hodowli organoidów myszy. Rozmrozić 1 ml podwielokrotności żelu matrycowego o zredukowanym czynniku wzrostu, zwanego dalej żelem matrycowym, na lodzie 2 godziny przed etapem 1.1. Y-27632 (inhibitor ROCK) należy dodać do pożywek organoidowych myszy bezpośrednio przed krokiem 1.1. Wykonaj kroki 1.1-1.8 na lodzie.
- Osadzać komórki w probówkach okrągłodennych o pojemności 5 ml przez odwirowanie przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.
- Przemyć osad komórkowy w 500 μl pożywki z organoidów mysich (Tabela 1).
- Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.
- Zawiesić w pożywkach organoidowych myszy przy gęstości komórek 1,000 komórek/μl.
- Aby przygotować mieszanki wzorcowe, wymieszaj komórki nabłonkowe zawieszone w mysich pożywkach organoidowych z żelem macierzowym, aby uzyskać końcową mieszaninę zawierającą 25% komórek/pożywki i 75% żelu matrycowego. Komórki podstawne są zwykle siane w stężeniu 100-2,000 komórek/80 μl, podczas gdy komórki luminalne są zwykle siane w stężeniu 2,000-10,000 komórek/80 μl. Gęstość posianych komórek różni się w zależności od dnia przewidywanego pobrania materiału i pożądanej dalszej aplikacji.
UWAGA: Schłodzić probówkę (probówki) o odpowiedniej wielkości dla oczekiwanej objętości mieszanki głównej 5 minut przed przygotowaniem mieszanki głównej. Aby upewnić się, że żel matrycowy nie stwardnieje podczas przenoszenia, konieczne jest schłodzenie końcówki pipety poprzez odpipetowanie żelu matrycowego 3-4 razy przed przeniesieniem go do nowej probówki.
- Dodać 80 μl mieszaniny żelu matrycowego i komórek do dołka na płytce 24-dołkowej. Zaleca się pipetowanie kropli na dolną połowę ściany studni, unikając bezpośredniego kontaktu z powłoką Poly-HEMA. Po dodaniu żelu matrycowego należy zakręcić płytką, aby mieszanina żelu matrycowego i komórek utworzyła pierścień wokół krawędzi studzienki.
- Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C 5% CO2 prawą stroną do góry na 10 minut, aby żel matrycowy częściowo stwardniał.
UWAGA: Ogrzewanie pożywki z organoidów mysich należy rozpocząć w temperaturze 37 °C natychmiast po umieszczeniu płytki 24-dołkowej w inkubatorze.
- Po inkubacji przez 10 minut odwróć 24-dołkową płytkę do góry nogami i inkubuj przez dodatkowe 50 minut, aby żel matrycowy całkowicie stwardniał.
- Dodaj kroplami 350 μl wstępnie podgrzanej pożywki z organoidów mysich do środka każdej studzienki.
UWAGA: Aby zachować integralność żelu matrycowego, ważne jest, aby unikać pierścienia żelowego matrycy podczas dodawania pożywki.
- Po dodaniu pożywki umieścić 24-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C 5% CO2 .
2. Uzupełnianie pożywki z organoidów mysich — CZAS: 10-15 minut na płytkę 24-dołkową
UWAGA: Istniejące nośniki powinny być wymieniane na nowe media co 48 godzin. Przed każdą zmianą pożywki należy wstępnie podgrzać pożywkę organoidową myszy. Nie jest konieczne dodawanie inhibitora ROCK do pożywek używanych do uzupełniania.
- Przechyl 24-dołkową płytkę pod kątem 45° i delikatnie usuń istniejące media ze środka każdej studzienki za pomocą pipety P1000, unikając pierścienia żelowego matrycy.
- Dodać 350 μl wstępnie podgrzanej pożywki z organoidów mysich, jak w kroku 1.9. Zaleca się dodanie większej objętości pożywki (do 1 ml) do organoidów hodowanych dłużej niż 5 dni, aby zapobiec szybkiemu wyczerpaniu kluczowych składników odżywczych i czynników wzrostu.
Tabela 1: Instrukcje dotyczące przygotowania pożywki organoidowej dla myszy
|
składnik
| koncentracja
|
| B-27 | 1x (rozcieńczyć od 50x koncentratu) |
| GlutaMAX | 1x (rozcieńczyć od 100x koncentratu) |
| N-acetylo-L-cysteina | 1,25 mM |
| Normocin (Normocyna) | 50 μg/ml |
| Rekombinowany ludzki EGF, wolny od zwierząt | 50 ng/ml |
| Rekombinowany ludzki Noggin | 100 ng/ml |
| Pożywki kondycjonowane R-spondyną 1 | 10% kondycjonowane media |
| A83-01 | 200 nM |
| Protokół DHT | 1 nM |
| Dichlorowodorek Y-27632 (inhibitor ROCK) | 10 μM |
| Zaawansowany DMEM/F-12 | Nośnik bazowy |
| Pożywka kondycjonowana R-spondyną 1 jest generowana zgodnie z opisem w Drost et al. Po dodaniu wszystkich składników przefiltruj sterylizację mysich pożywek organoidowych za pomocą filtra 0,22 μm. Inhibitor ROCK dodaje się tylko podczas tworzenia hodowli i pasażowania organoidów. |
