Ekstrakcja prostaty z układu moczowo-płciowego myszy: technika oddzielania gruczołu krokowego od innych narządów moczowych i płciowych u samców myszy

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Rozwarstwienie układu moczowo-płciowego (UGS)

UWAGA: Schemat jest przedstawiony na rysunku 1.

1. Poddaj eutanazji 3-miesięcznego samca myszy C57BL/6 przy użyciu metody eutanazji wziewnej CO₂ lub innej zatwierdzonej techniki.
   nuta: Myszy w wieku od 3 do 12 miesięcy mogą być z powodzeniem wykorzystane w eksperymencie. Starsze myszy (> 6 miesięcy) najprawdopodobniej będą miały więcej tłuszczu wokół UGS, który będzie musiał zostać usunięty. Identyfikacja i oddzielenie płatów jest często trudne u myszy młodszych niż 3 miesiące. Do eksperymentu można również użyć innych szczepów.
2. Połóż mysz na plecach i zabezpiecz nogi za pomocą szpilek, tak aby brzuszna strona zwierzęcia była odsłonięta.
3. Spryskaj brzuch myszy 70% etanolem i wytrzyj go do czysta.
   nuta: Golenie włosów na brzuchu przed rozcięciem nie jest wymagane.
4. Podnieś skórę z brzucha wraz z warstwą mięśniową za pomocą pary średnio kleszczy i wykonaj odwrócone nacięcie w kształcie litery Y na brzuchu za pomocą nożyczek.
   1. Najpierw wykonaj proste nacięcie ostrymi nożyczkami od momentu tuż nad penisem do mostka (ryc. 2a).
   2. Ciąć od podstawy nacięcia w kierunku każdego palca u nogi, aż do ud (ryc. 2b). Odchyl skórę po obu stronach i na dole, aby view cały obszar brzucha (Rysunek 2c-e).
      nuta: Rozmiar cięcia różni się w zależności od wieku i rozmiaru myszy. Wielkość początkowego prostego nacięcia może wynosić od 1,5 do 4 cm, w zależności od wielkości myszy.
5. Przesuń się nad innymi narządami, aby odsłonić PMG. Podnieś i przesuń brązowo-żółte jelita (ryc. 2f). Podnieś kleszczem poduszeczki tłuszczowe brzucha (nieprzezroczystą białą, gąbczastą tkankę) i przesuń je na boki (ryc. 2g).
   nuta: PMG obejmuje pęcherzyki nasienne, cewkę moczową, prostatę, przewód nasieniowodowy (nasieniowód) i pęcherz moczowy. Można go rozpoznać po charakterystycznej parze nieprzezroczystych białych półkolistych łuków (które są pęcherzykami nasiennymi), z wypełnionym płynem workiem pęcherza moczowego przyczepionym do podstawy. Półprzezroczysta tkanka znajdująca się tuż pod pęcherzykami nasiennymi to prostata.
6. Zlokalizuj PMG, mocno chwyć pęcherz moczowy kleszczami i podnieś cały PMG do góry z brzucha myszy.
   nuta: Jeśli pęcherz jest pełny, najpierw opróżnij go małą strzykawką, aby zapewnić lepszy chwyt kleszczykami i zmniejszyć ryzyko pęknięcia pęcherza.
7. Kontynuując podciąganie na pęcherzu, wsuń nożyczki pod pęcherz i prostatę aż do kręgosłupa i wykonaj cięcie. Przeciąć wszelkie pozostałe połączenia z jamą brzuszną (ryc. 2h i 2i). Uważaj, aby nie ciąć zbyt blisko PMG, aby uniknąć przypadkowego przecięcia tkanki prostaty.
   nuta: Podczas wykonywania cięcia pod PMG nożyczki należy wsunąć aż do tyłu myszy, tak aby nacięcie zatrzasnęło również kręgosłup. Metoda ta powoduje przecięcie prawie wszystkich połączeń między PMG a jamą brzuszną za jednym wycinkiem, skracając czas potrzebny na wydobycie tkanki od myszy.
8. Usuń PMG i umieść go w 2-6 ml (wystarczająco dużo, aby pokryć tkankę) soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub zmodyfikowanej pożywki Eagle firmy Dulbecco (DMEM, wysoka glukoza) na 6-centymetrowej szalce Petriego (ryc. 2j i 2k) i przenieś do mikroskopu preparacyjnego (powiększenie 10x).
   nuta: Zmień media preparacyjne zgodnie z wymaganiami w pozostałych krokach.

Rycina 1: Schematyczny schemat blokowy przedstawiający rozwarstwienie układu moczowo-płciowego myszy i izolację prostaty. Schemat blokowy dla kroków protokołu opisanych w sekcjach 1

Rysunek 2: Analiza PMG myszy. Obrazy krok po kroku z sekcji PMG od 3-miesięcznej myszy: (a i b) wykonywanie nacięć, (c-e) odciąganie skóry w celu odsłonięcia okolicy brzucha, (f) przesuwanie jelit, (g) przesuwanie poduszeczek tłuszczowych w jamie brzusznej, (h i i) ekstrakcja PMG z jamy brzusznej, (j) wyekstrahowany PMG, (k) wyekstrahowany PMG z różnymi narządami i tkankami oznaczonymi w następujący sposób: SV (żółty) = pęcherzyki nasienne; P (czerwony) = prostata; F (fioletowy) = tłuszcz; V (jasnoniebieski) = nasieniowód; i B (zielony) = pęcherz moczowy.