$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Rozwarstwienie układu moczowo-płciowego (UGS)
UWAGA: Schemat jest przedstawiony na rysunku 1.
- Poddaj eutanazji 3-miesięcznego samca myszy C57BL/6 przy użyciu metody eutanazji wziewnej CO2 lub innej zatwierdzonej techniki.
nuta: Myszy w wieku od 3 do 12 miesięcy mogą być z powodzeniem wykorzystane w eksperymencie. Starsze myszy (> 6 miesięcy) najprawdopodobniej będą miały więcej tłuszczu wokół UGS, który będzie musiał zostać usunięty. Identyfikacja i oddzielenie płatów jest często trudne u myszy młodszych niż 3 miesiące. Do eksperymentu można również użyć innych szczepów.
- Połóż mysz na plecach i zabezpiecz nogi za pomocą szpilek, tak aby brzuszna strona zwierzęcia była odsłonięta.
- Spryskaj brzuch myszy 70% etanolem i wytrzyj go do czysta.
nuta: Golenie włosów na brzuchu przed rozcięciem nie jest wymagane.
- Podnieś skórę z brzucha wraz z warstwą mięśniową za pomocą pary średnio kleszczy i wykonaj odwrócone nacięcie w kształcie litery Y na brzuchu za pomocą nożyczek.
- Najpierw wykonaj proste nacięcie ostrymi nożyczkami od momentu tuż nad penisem do mostka (ryc. 2a).
- Ciąć od podstawy nacięcia w kierunku każdego palca u nogi, aż do ud (ryc. 2b). Odchyl skórę po obu stronach i na dole, aby view cały obszar brzucha (Rysunek 2c-e).
nuta: Rozmiar cięcia różni się w zależności od wieku i rozmiaru myszy. Wielkość początkowego prostego nacięcia może wynosić od 1,5 do 4 cm, w zależności od wielkości myszy.
- Przesuń się nad innymi narządami, aby odsłonić PMG. Podnieś i przesuń brązowo-żółte jelita (ryc. 2f). Podnieś kleszczem poduszeczki tłuszczowe brzucha (nieprzezroczystą białą, gąbczastą tkankę) i przesuń je na boki (ryc. 2g).
nuta: PMG obejmuje pęcherzyki nasienne, cewkę moczową, prostatę, przewód nasieniowodowy (nasieniowód) i pęcherz moczowy. Można go rozpoznać po charakterystycznej parze nieprzezroczystych białych półkolistych łuków (które są pęcherzykami nasiennymi), z wypełnionym płynem workiem pęcherza moczowego przyczepionym do podstawy. Półprzezroczysta tkanka znajdująca się tuż pod pęcherzykami nasiennymi to prostata.
- Zlokalizuj PMG, mocno chwyć pęcherz moczowy kleszczami i podnieś cały PMG do góry z brzucha myszy.
nuta: Jeśli pęcherz jest pełny, najpierw opróżnij go małą strzykawką, aby zapewnić lepszy chwyt kleszczykami i zmniejszyć ryzyko pęknięcia pęcherza.
- Kontynuując podciąganie na pęcherzu, wsuń nożyczki pod pęcherz i prostatę aż do kręgosłupa i wykonaj cięcie. Przeciąć wszelkie pozostałe połączenia z jamą brzuszną (ryc. 2h i 2i). Uważaj, aby nie ciąć zbyt blisko PMG, aby uniknąć przypadkowego przecięcia tkanki prostaty.
nuta: Podczas wykonywania cięcia pod PMG nożyczki należy wsunąć aż do tyłu myszy, tak aby nacięcie zatrzasnęło również kręgosłup. Metoda ta powoduje przecięcie prawie wszystkich połączeń między PMG a jamą brzuszną za jednym wycinkiem, skracając czas potrzebny na wydobycie tkanki od myszy.
- Usuń PMG i umieść go w 2-6 ml (wystarczająco dużo, aby pokryć tkankę) soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub zmodyfikowanej pożywki Eagle firmy Dulbecco (DMEM, wysoka glukoza) na 6-centymetrowej szalce Petriego (ryc. 2j i 2k) i przenieś do mikroskopu preparacyjnego (powiększenie 10x).
nuta: Zmień media preparacyjne zgodnie z wymaganiami w pozostałych krokach.
