Method Article

Pobieranie próbek pojedynczych komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej: technika zbierania komórek docelowych z heterogenicznej populacji komórek

April 30th, 2023

In This Article

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Chen S. et al. Wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu dla charakterystyki pojedynczej komórki. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film opisuje technikę uzyskiwania pojedynczej komórki z heterogenicznej populacji komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej. Pojedyncza wyizolowana komórka może być wykorzystana do dalszych badań genomicznych lub badań nad rakiem.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Próbkowanie pojedynczej komórki

  1. Mikrodysekcja laserowa
    UWAGA: Pojedyncze komórki zostaną dodane do 4,5 μl głównej mieszanki do lizy komórek (składniki zestawu WGA, tabela materiałów i odczynników) dla WGA.
    1. Przygotować główną mieszaninę do lizy komórek według Czyż i wsp., mieszając 5,0 μl buforu reakcyjnego, 1,3 μl oktylofenoksypolietylenu (10% roztwór), 1,3 μl glikolu 4-(1,1,3,3-tetrametylobutylo)fenylo-polietylenowego (roztwór 10%) lub 2,6 μl roztworu proteinazy K i 34,8 μl wody wolnej od RNazy/DNaz w celu otrzymania mieszanki głównej na 10 próbek (całkowita....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
McCoy's 5A Medium (1x) suplement z L-GlutaminąThermo Fisher Naukowy16600-082Pożywka hodowlana stosowana do komórek HT-29, dostosować pożywkę hodowlaną do linii komórkowej używanej do eksperymentów
Roztwór buforowy HEPES (1 m)PAA (Agencja OchronyS11-001Suplement do pożywki McCoy's 5A
Złota surowica bydlęca płoduPAA (Agencja OchronyA15-151Suplement do pożywki modyfikowanej McCoy's 5a
Penicylina-Streptomycyna (100x)Biowest (Zachód BiologiL0018-100Suplement do pożywki modyfikowanej McCoy's 5a
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x PBS)Thermo Fisher NaukowyNumer katalogowy 10010-015
DokładnościBiowest (Zachód BiologiL0950-100Roztwór do odrywania komórek (hodowla komórkowa)
Kąpiel wodnaJęzyk niemieckiTyp 1003Służy do roztworów do wstępnego podgrzewania
inkubatorThermo Fisher NaukowySłuży do inkubacji komórek (hodowla komórkowa)
50 ml probówek reakcyjnychFirma VWR525-0403
Mieszalnik rolkowyStuart NaukowyZobacz materiał SRT6DSłuży do mocowania komórek do drutu, jednocześnie zapobiegając osadzaniu się komórek
Zestaw do proliferacji komórek CellTrace CFSEThermo Fisher NaukowyZobacz materiał C34554Służy do oznaczania żywych komórek (znacznik cytoplazmatyczny)
Hoechst 33342Zobacz materiał H3570Thermo Fisher NaukowySłuży do barwienia DNA (przeciwbarwienie nukleinowe)
Wirówka (wyposażona w 15 ml i 50 ml probówek reakcyjnych)Thermo Fisher NaukowyHeraeus Megafuge 40RSłuży do komór do peletowania
Obserwator Z1 (Mikroskop fluorescencyjny/mikrodyparacyjny laserowy)Mikroobrazowanie Carla ZeissaMikroskop odwrócony (immunofluorescencyjny) zdolny do mikrodysekcji laserowej; Mikroskopy fluorescencyjne muszą być w stanie wykryć Hoechst 33342 (filtr DAPI) i CFSE (filtr FITC)
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA4503-50GSłuży do powlekania powierzchni szklanych/plastikowych
Minishaker MS1Sigma-AldrichZ404039Służy do wirowania
Detektor CANCER03 DC03Gilupi powiedział:GIL003Funkcjonalizowany przewód zdolny do izolowania i odłączania komórek EpCAMpositive (określanych również jako catch&release, C&R)
Igły strzykawkowe (G20)Firma VWR613-0554Służy do nakłuwania gumowych zaślepek w celu umożliwienia przeprowadzenia przez nie niefunkcjonalnej części C&R
Komora NeubaueraRothT729.1Służy do liczenia komórek
Pipety Pasteura 150 mmWolakZobacz materiał D810Służy do nakładania ogniw na małą objętość do C&R
SmarowidłoDako DakoS2002Stosowany na szkiełkach do utrzymywania zawiesiny komórek na miejscu
Wytrząsarka do płyt DelfiaPerkin ElmerNumer katalogowy: 1296-003Służy do mieszania podczas odłączania komórek
Probówki 1,5 mlEppendorf30 125 150
Zestaw Ampli1 WGABiosystemy krzemoweDo zamówienia za pośrednictwem Silicon Biosystems
0,2 ml probówek do PCRBiozymNumer katalogowy: 710920
Cytowirówka i sprzętHettich powiedział:Uniwersalny 32Używaj cytowirówki pod ręką
TermocyklerBio-RadDiada silnika DNAMożna używać każdego termocyklera z podgrzewaną pokrywą
MikrowirówkaRothCX73.1Używaj wirówki biurkowej pod ręką
Drukarka UV Stratalinker 1800Podstęp400072Użyj sieciownika DNA pod ręką
T T powiedział: powiedział: powiedział: osób

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser Capture MicrodissectionSingle Cell IsolationCytocentrifuge TechniqueCell Suspension PreparationMembrane Coated SlideUV Light TreatmentCell Lysis Master MixPCR Tube CollectionHeterogeneous Cell PopulationTarget Cell Harvesting

Related Articles