Pobieranie próbek pojedynczych komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej: technika zbierania komórek docelowych z heterogenicznej populacji komórek

Streszczenie

Źródło: Chen S. et al. Wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu dla charakterystyki pojedynczej komórki. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film opisuje technikę uzyskiwania pojedynczej komórki z heterogenicznej populacji komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej. Pojedyncza wyizolowana komórka może być wykorzystana do dalszych badań genomicznych lub badań nad rakiem.

Protokół

1. Próbkowanie pojedynczej komórki

1. Mikrodysekcja laserowa
   UWAGA: Pojedyncze komórki zostaną dodane do 4,5 μl głównej mieszanki do lizy komórek (składniki zestawu WGA, tabela materiałów i odczynników) dla WGA.
   1. Przygotować główną mieszaninę do lizy komórek według Czyż i wsp., mieszając 5,0 μl buforu reakcyjnego, 1,3 μl oktylofenoksypolietylenu (10% roztwór), 1,3 μl glikolu 4-(1,1,3,3-tetrametylobutylo)fenylo-polietylenowego (roztwór 10%) lub 2,6 μl roztworu proteinazy K i 34,8 μl wody wolnej od RNazy/DNaz w celu otrzymania mieszanki głównej na 10 próbek (całkowita objętość 45 μL). Umieść mieszankę wzorcową na lodzie.
      nuta: Aby uzyskać więcej próbek, należy odpowiednio zwiększyć objętość.
   2. Powłoka UV szkiełka pokryte membraną nadają się do mikrodysekcji laserowej. Umieść szkiełka w urządzeniu sieciującym DNA i naświetlaj je na działanie najwyższego promieniowania UV przez około 10 minut.
   3. Zmontować szkiełko pokryte membraną w cytowirówce i cytowirować całą zawiesinę komórek przy 300 x g przez 5 min.
      nuta: W przypadku stosowania systemu w cieczy, w którym komórki są poddawane cytowirowaniu na szkiełku w roztworze, należy usunąć supernatant po cytowirowaniu i zastosować wirowanie na sucho przy 1140 x g przez 1 min.
   4. Bezpośrednio przystąp do mikrodysekcji laserowej lub pozostaw cytospiny do wyschnięcia na powietrzu przez noc i zamroź próbki w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.
   5. Odpipetować 4,5 μl wzorcowej mieszanki do lizy komórek do nasadki probówki PCR o pojemności 0,2 ml i pobrać pojedyncze komórki za pomocą mikrodysekcji laserowej.
   6. Wyjmij probówkę do PCR z mikroskopu mikrodystrekcyjnego laserowego i zamknij probówkę. Zebrać cały płyn na dnie probówki przez krótkie wirowanie i umieścić próbkę na lodzie.
   7. Kontynuować z jednokomórkowym WGA lub przechowywać wyizolowane próbki w temperaturze -80 °C przez okres do 1 miesiąca przed dalszym przetwarzaniem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
McCoy's 5A Medium (1x) suplement z L-Glutaminą	Thermo Fisher Naukowy	16600-082	Pożywka hodowlana stosowana do komórek HT-29, dostosować pożywkę hodowlaną do linii komórkowej używanej do eksperymentów
Roztwór buforowy HEPES (1 m)	PAA (Agencja Ochrony	S11-001	Suplement do pożywki McCoy's 5A
Złota surowica bydlęca płodu	PAA (Agencja Ochrony	A15-151	Suplement do pożywki modyfikowanej McCoy's 5a
Penicylina-Streptomycyna (100x)	Biowest (Zachód Biologi	L0018-100	Suplement do pożywki modyfikowanej McCoy's 5a
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x PBS)	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy 10010-015
Dokładności	Biowest (Zachód Biologi	L0950-100	Roztwór do odrywania komórek (hodowla komórkowa)
Kąpiel wodna	Język niemiecki	Typ 1003	Służy do roztworów do wstępnego podgrzewania
inkubator	Thermo Fisher Naukowy		Służy do inkubacji komórek (hodowla komórkowa)
50 ml probówek reakcyjnych	Firma VWR	525-0403
Mieszalnik rolkowy	Stuart Naukowy	Zobacz materiał SRT6D	Służy do mocowania komórek do drutu, jednocześnie zapobiegając osadzaniu się komórek
Zestaw do proliferacji komórek CellTrace CFSE	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał C34554	Służy do oznaczania żywych komórek (znacznik cytoplazmatyczny)
Hoechst 33342	Zobacz materiał H3570	Thermo Fisher Naukowy	Służy do barwienia DNA (przeciwbarwienie nukleinowe)
Wirówka (wyposażona w 15 ml i 50 ml probówek reakcyjnych)	Thermo Fisher Naukowy	Heraeus Megafuge 40R	Służy do komór do peletowania
Obserwator Z1 (Mikroskop fluorescencyjny/mikrodyparacyjny laserowy)	Mikroobrazowanie Carla Zeissa		Mikroskop odwrócony (immunofluorescencyjny) zdolny do mikrodysekcji laserowej; Mikroskopy fluorescencyjne muszą być w stanie wykryć Hoechst 33342 (filtr DAPI) i CFSE (filtr FITC)
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503-50G	Służy do powlekania powierzchni szklanych/plastikowych
Minishaker MS1	Sigma-Aldrich	Z404039	Służy do wirowania
Detektor CANCER03 DC03	Gilupi powiedział:	GIL003	Funkcjonalizowany przewód zdolny do izolowania i odłączania komórek EpCAMpositive (określanych również jako catch&release, C&R)
Igły strzykawkowe (G20)	Firma VWR	613-0554	Służy do nakłuwania gumowych zaślepek w celu umożliwienia przeprowadzenia przez nie niefunkcjonalnej części C&R
Komora Neubauera	Roth	T729.1	Służy do liczenia komórek
Pipety Pasteura 150 mm	Wolak	Zobacz materiał D810	Służy do nakładania ogniw na małą objętość do C&R
Smarowidło	Dako Dako	S2002	Stosowany na szkiełkach do utrzymywania zawiesiny komórek na miejscu
Wytrząsarka do płyt Delfia	Perkin Elmer	Numer katalogowy: 1296-003	Służy do mieszania podczas odłączania komórek
Probówki 1,5 ml	Eppendorf	30 125 150
Zestaw Ampli1 WGA	Biosystemy krzemowe		Do zamówienia za pośrednictwem Silicon Biosystems
0,2 ml probówek do PCR	Biozym	Numer katalogowy: 710920
Cytowirówka i sprzęt	Hettich powiedział:	Uniwersalny 32	Używaj cytowirówki pod ręką
Termocykler	Bio-Rad	Diada silnika DNA	Można używać każdego termocyklera z podgrzewaną pokrywą
Mikrowirówka	Roth	CX73.1	Używaj wirówki biurkowej pod ręką
Drukarka UV Stratalinker 1800	Podstęp	400072	Użyj sieciownika DNA pod ręką

T T powiedział: powiedział: powiedział: osób