Wstrzyknięcie komórek rakowych do gruczołu krokowego: technika dostarczania komórek rakowych w celu ustalenia ortotopowego modelu myszy raka prostaty

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przedoperacyjne przygotowanie myszy

UWAGA: Myszy domowe w uniwersyteckim obiekcie dla zwierząt przez co najmniej tydzień przed operacją, aby umożliwić odpowiednią adaptację i zminimalizować stres zwierząt. Kroki 1.1-1.6 są wykonywane przez asystenta chirurga. Wszystkie kolejne czynności chirurgiczne wykonywane są przez chirurga przy użyciu sterylnych rękawiczek i narzędzi chirurgicznych o sterylnej technice.

1. Znieczulenie myszy izofluranem (2-5% do indukcji przez komorę, 1-3% do utrzymania przez stożek nosowy). Sprawdź pełną indukcję przez utratę odruchu szczypania palców u stóp.
2. Zważyć myszy i podać co najmniej 0,05 mg/kg przeciwbólowego buprenorfiny s.c.
   nuta: Waga myszy ≥20 g jest idealna do udanych iniekcji dodokrokowych.
3. Nałóż smar maści okulistycznej na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
4. Ogol całe futro z brzucha.
5. Wysterylizuj brzuch przez trzy rundy okrężnego nakładania peelingu chirurgicznego za pomocą sterylnych, nieprzywierających płatków, a następnie sterylnych chusteczek nasączonych alkoholem. Pozostaw brzuch do wyschnięcia.
   nuta: Do pozostałej części zabiegu chirurgicznego należy używać wyłącznie sterylnych rękawiczek i narzędzi chirurgicznych do kontaktu ze wysterylizowanym brzuchem myszy.
6. Przenieś mysz leżąc na wznak na czystą powierzchnię na poduszce grzewczej bezpośrednio pod obiektywem czystego mikroskopu operacyjnego.
7. Przykryj mysz sterylną serwetą z małym otworem wyciętym nad brzuchem.

2. Wstrzyknięcie do gruczołu krokowego

UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki chirurgiczne w sterylnych warunkach. Regulacja mikroskopu, umieszczenia myszy lub innego niesterylnego przedmiotu musi być wykonana z dodatkową pomocą.

1. Wykonaj około 1 cm nacięcie zewnętrznej skóry wzdłuż linii środkowej brzucha powyżej penisa i gruczołów napletkowych (ryc. 1D).
2. Oddziel tkankę łączną między zewnętrzną skórą brzucha a wewnętrzną muskulaturą brzucha, otwierając nożyczki między warstwami.
3. Wykonaj podobne nacięcie na wewnętrznej stronie mięśni brzucha, używając kleszczy do podniesienia mięśni, aby uniknąć przebicia jelit lub pęcherza moczowego (ryc. 1D).
4. Zlokalizuj jeden z obustronnych pęcherzyków nasiennych (ryc. 1A, biały) / przednie płaty prostaty (ryc. 1A,), które często są tylne, boczne i nieco wyższe od pęcherza moczowego (ryc. 1A, żółty), ale może się to różnić u myszy. Przednie płaty prostaty są półprzezroczyste i przyczepione do mniejszej krzywizny białych pęcherzyków nasiennych.
5. Delikatnie podnieś końcówkę pęcherzyka nasiennego za pomocą kleszczy tkankowych Graefe, aby wytworzyć napięcie na tkance bez nakłuwania pęcherzyka nasiennego (ryc. 1E).
6. Wymieszać roztwór matrygelu Myc-CaP przez pipetowanie gentile (wykonywane przez asystenta chirurga), ponieważ komórki mogły się granulować, i powoli odessać 30 μl (1x10⁶ komórek) do igły, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
7. Ostrożnie wprowadzić skos igły równolegle do długiej osi przedniego płata prostaty. Powoli wstrzyknąć 30 μl do płatka, a następnie powoli wycofać igłę, aby zapobiec wyciekowi (ryc. 1F). Sprawdzić odpowiednie wstrzyknięcie poprzez obrzęk przedniego płata gruczołu krokowego (ryc. 1G).
8. Ostrożnie trzymaj pęcherzyk nasienny i płat prostaty na zewnątrz myszy przez około 30 sekund, aby umożliwić częściowe zestalenie się matrigelu w płacie. W tym czasie należy zebrać wszelkie wycieki roztworu komórkowego w jamie brzusznej za pomocą sterylnego aplikatora z poliestrową końcówką, aby zapobiec rozwojowi guza nieortotopowego bez naciskania na wstrzyknięty płat prostaty.
9. Ostrożnie włóż pęcherzyk nasienny i wstrzyknięty płat prostaty do jamy brzusznej, nie wywierając nacisku na płat. Wymień wszystkie uzewnętrznione tkanki.
10. Wykonuj szwy ciągłe, aby zamknąć wewnętrzne mięśnie brzucha za pomocą wchłanialnych szwów igłowych 5-0 vicryl z odwróconym cięciem.
11. Wykonaj szwy przerywane, aby zamknąć zewnętrzną skórę brzucha za pomocą niewchłanialnych szwów igłowych z odwróconego cięcia 4-0 z nylonu. nuta: Sterylizowane zszywki 9 mm mogą być również używane do zamykania zewnętrznej części skóry brzucha. Jednak w przeciwieństwie do szwów, zakłócają one wszelkie późniejsze sygnały obrazowania guza w bioluminescencji i fluorescencji.
12. Wyczyść wszystkie narzędzia sterylnymi chusteczkami z etanolu (otwieranymi przez asystenta chirurga) i umieść je w sterylizatorze z kulkami szklanymi na 30 sekund. Pozwól narzędziom wyschnąć przed użyciem na następnej myszy.
13. Przepłukać strzykawkę i igłę w sterylnym roztworze soli fizjologicznej (otwartym przez asystenta chirurga), aby zapobiec zatkaniu przez resztki matrigel.
    nuta: Asystent chirurga powinien być obecny przy wszystkich operacjach, wykonując wszystkie niesterylne przedoperacyjne przygotowanie myszy i pooperacyjną opiekę nad myszami, a także mieszając roztwór matrigelu Myc-CaP przed wstrzyknięciami. Aby zminimalizować czas, ponieważ każdy zabieg na myszy wewnątrzkrokowej będzie wymagał 20-30 minut, asystent chirurga może rozpocząć przygotowywanie następnej myszy, podczas gdy chirurg zszywa obecną mysz.

3. Pooperacyjna pielęgnacja myszy

1. Podać 1 mg/kg przeciwbólowego meloksykamu s.c. natychmiast, 24 godziny i 48 godzin po zabiegu.
2. Pozwól myszom dojść do siebie w klatce bez ściółki umieszczonej do połowy na poduszce grzewczej. Monitoruj myszy przez co najmniej 30 minut po operacji, aż odzyskają normalną mobilność i aktywność, po czym umieść je w czystej klatce z jedzeniem na podłodze klatki.
3. Ponadto codziennie monitoruj myszy pod kątem prawidłowego gojenia się ran, masy ciała, pielęgnacji i poruszania się po operacji. Podziel myszy na osobne klatki po otrzymaniu jakichkolwiek dowodów walki.
4. Usuń pozostałe szwy w ciągu 14 dni po zabiegu.

Rysunek 1: Przedni płat gruczołu krokowego, drenaż węzłów chłonnych i reprezentatywna technika wstrzykiwań do komórek gruczołu krokowego. Obrazy (A) prawego przedniego płata prostaty (, *), przyczepionego prawego pęcherzyka nasiennego (biały), prawego jądra i poduszeczki tłuszczowej (zielony) oraz pęcherza moczowego (żółty), (B) obustronnych węzłów chłonnych okołoaortalnych drenujących prostatę (pomarańczowy), (C) nożyczek do mikropreparacji, kleszczyków Graefe, kleszczyków do tkanek Graefe, uchwytu igły z obcinaczami do szwów oraz strzykawki 50 μL z igłą o rozmiarze 28 (od lewej do prawej), (D) nacięcia w linii środkowej, (E) eksternalizacja pęcherzyka nasiennego i przedniego płata prostaty, (F) wstrzyknięcie doprostaty i (G) obrzęk przedniego płata prostaty.