Artykuł metodologiczny

Barwienie ujemne oczyszczonych egzosomów: procedura wizualizacji morfologii egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

30 kwietnia 2023

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Jung, M. K. et al. Przygotowanie próbki i obrazowanie egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film opisuje procedurę negatywnego barwienia oczyszczonych egzosomów. Ujemnie barwione egzosomy są obrazowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Ta technika pomaga uwidocznić morfologię egzosomów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Negatywne barwienie

  1. Wyładowanie jarzeniowe cienkie siatki miedziane EM o siatce 200 mesh pokryte folią węglową przez 1 minutę za pomocą rozładowania żarzenia.
  2. Utrwal oczyszczone egzosomy za pomocą 1 ml 2% paraformaldehydu (PFA) przez 5 min.
    UWAGA: Opary paraformaldehydu są toksyczne. Wszystkie prace należy wykonywać w wentylowanym dygestorium.
  3. Załaduj 5-7 μL roztworu zawiesiny egzosomu na siatkę i inkubuj przez 1 minutę. Jeśli stężenie egzosomu jest zbyt wysokie, rozcieńczyć stężenie do połowy do jednej piątej.
  4. Natychmiast zabarwić ~20 kroplami przefiltrowanego 1% roztworu octanu uranylu (UA) na powierzchni siatki EM za pomocą strzykawki.
  5. Usunąć nadmiar roztworu UA z siatki, stykając krawędź siatki z bibułą filtracyjną.
  6. Szybko spłucz siatkę kroplą wody. Ten krok usunie nadmiar roztworu barwiącego.
  7. Umieść siatkę na stole, przytrzymując ją pęsetą, a następnie częściowo przykryj siatkę naczyniem hodowlanym do wyschnięcia przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Przechowuj siatkę w skrzynce siatkowej EM do przyszłej obserwacji przez TEM przy napięciu 80 kV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Octan uranyluEmsNumer katalogowy: 22400Niebezpieczna substancja chemiczna
Transmisyjna mikroskopia elektronowaJEOL (o rany)JEM2200FS
Wyładowca żaruJEOL (o rany)JFC1100E
ParaformaldehydEmsNumer katalogowy: 19210
Formvar z powłoką węglową Copper
Siatka (200 oczek)		EmsFCF200-CU
Formvar z powłoką węglową Nickel
Siatka (200 oczek)		EmsFCF200-NI

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oczyszczanie egzosom wbarwienie octanem uranylufiksacja paraformaldehydemprzygotowanie siatek do EMtraktowanie wy adowaniem arowymadsorpcja egzosom wsuszenie siatek

Powiązane artykuły