Barwienie ujemne oczyszczonych egzosomów: procedura wizualizacji morfologii egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Streszczenie

Źródło: Jung, M. K. et al. Przygotowanie próbki i obrazowanie egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film opisuje procedurę negatywnego barwienia oczyszczonych egzosomów. Ujemnie barwione egzosomy są obrazowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Ta technika pomaga uwidocznić morfologię egzosomów.

Protokół

1. Negatywne barwienie

1. Wyładowanie jarzeniowe cienkie siatki miedziane EM o siatce 200 mesh pokryte folią węglową przez 1 minutę za pomocą rozładowania żarzenia.
2. Utrwal oczyszczone egzosomy za pomocą 1 ml 2% paraformaldehydu (PFA) przez 5 min.
   UWAGA: Opary paraformaldehydu są toksyczne. Wszystkie prace należy wykonywać w wentylowanym dygestorium.
3. Załaduj 5-7 μL roztworu zawiesiny egzosomu na siatkę i inkubuj przez 1 minutę. Jeśli stężenie egzosomu jest zbyt wysokie, rozcieńczyć stężenie do połowy do jednej piątej.
4. Natychmiast zabarwić ~20 kroplami przefiltrowanego 1% roztworu octanu uranylu (UA) na powierzchni siatki EM za pomocą strzykawki.
5. Usunąć nadmiar roztworu UA z siatki, stykając krawędź siatki z bibułą filtracyjną.
6. Szybko spłucz siatkę kroplą wody. Ten krok usunie nadmiar roztworu barwiącego.
7. Umieść siatkę na stole, przytrzymując ją pęsetą, a następnie częściowo przykryj siatkę naczyniem hodowlanym do wyschnięcia przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
8. Przechowuj siatkę w skrzynce siatkowej EM do przyszłej obserwacji przez TEM przy napięciu 80 kV.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Octan uranylu	Ems	Numer katalogowy: 22400	Niebezpieczna substancja chemiczna
Transmisyjna mikroskopia elektronowa	JEOL (o rany)	JEM2200FS
Wyładowca żaru	JEOL (o rany)	JFC1100E
Paraformaldehyd	Ems	Numer katalogowy: 19210
Formvar z powłoką węglową Copper Siatka (200 oczek)	Ems	FCF200-CU
Formvar z powłoką węglową Nickel Siatka (200 oczek)	Ems	FCF200-NI