Wysokoprzepustowa zautomatyzowana platforma do opracowywania linii komórkowych produkcyjnych dla białkowych produktów terapeutycznych

Podsumowanie

Opisano wysokoprzepustową, zautomatyzowaną platformę rozwoju linii komórkowych do produkcji białkowych leków terapeutycznych. Wdrożenie sortera komórek BD FACS Aria, obrazownika CloneSelect Imager oraz systemu do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO wykazało znaczące zwiększenie wydajności przetwarzania w procesie rozwoju linii komórkowych, przy jednoczesnej poprawie jakości linii komórkowych i wysokiej powtarzalności.

Streszczenie

Szybko rozwijający się przemysł biofarmaceutyczny wymaga sprawnego opracowywania wysoce wydajnych i niezawodnych systemów produkcyjnych, aby sprostać rosnącemu zapotrzebowaniu na dostawy leków. Tworzenie produkcyjnych linii komórkowych tradycyjnie opierało się na operacjach manualnych, które są pracochłonne, charakteryzują się niską przepustowością i są podatne na błędy ludzkie. Przedstawiamy w niniejszym opracowaniu zintegrowaną, zautomatyzowaną platformę wysokoprzepustową do opracowywania linii komórkowych przeznaczonych do produkcji białkowych terapeutyków.

Połączenie sortera komórek BD FACS Aria, systemu obrazowania CloneSelect Imager oraz systemu do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO umożliwiło stworzenie wysokoprzepustowego i bardziej efektywnego procesu rozwoju linii komórkowych. W tej procedurze komórki gospodarza produkcyjnego są najpierw transfekowane wektorem ekspresyjnym niosącym interesujący gen ¹, a następnie poddawane działaniu czynnika selekcyjnego. Komórki stabilnie transfekowane są następnie barwione przeciwciałem anty-IgG przeciwko ludzkim białkom znakowanym fluorescencyjnie, a następnie poddawane analizie cytometrycznej ^2-4. Wysoce produktywne komórki są wybierane na podstawie intensywności fluorescencji i izolowane poprzez sortowanie pojedynczych komórek za pomocą BD FACSAria. Tworzenie kolonii z etapu pojedynczej komórki było wykrywane mikroskopowo, a system CloneSelect Imager rejestrował serię cyfrowych obrazów time-lapse w celu dokumentacji historii linii komórkowej. Po utworzeniu się pojedynczych klonów, były one przesiewane pod kątem produktywności za pomocą testu ELISA wykonanego na systemie do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO. Przy obecnej konfiguracji systemu w jednym cyklu operacyjnym można przesiać od około 2 000 do 10 000 klonów.

To zintegrowane podejście zostało wykorzystane do generowania wysokowydajnych linii komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) do produkcji terapeutycznych przeciwciał monoklonalnych (mAb), a także ich białek fuzyjnych. Dzięki zastosowaniu różnych rodzajów sond detekcyjnych, metodę tę można wykorzystać do opracowywania innych białek terapeutycznych lub zastosować w innych systemach gospodarzy produkcyjnych. W porównaniu z tradycyjną procedurą ręczną, ta zautomatyzowana platforma wykazała zalety w postaci znacznie zwiększonej przepustowości, zapewnionej klonalności, możliwości prześledzenia historii linii komórkowej dzięki dokumentacji elektronicznej oraz znacznie mniejszego ryzyka błędów operatora.

Protokół

1. Transfekcja komórek gospodarza

1. Wysiać 2 x 10^6⁶ Komórki CHO-DXB11 w kolbie do hodowli komórek Corning T75 w 15 ml pożywki wzrostowej (MEMa z nukleotydami i nukleozydami (Gibco, numer katalogowy 12571), uzupełnionej o 10% scharakteryzowanej płodowej surowicy bydlęcej (cFBS) naświetlanej promieniami γ (HyClone, numer katalogowy SH30071.03) oraz 10 ml/L 45% roztworu glukozy (Sigma, numer katalogowy G8769)) na jeden dzień przed transfekcją.
2. W momencie transfekcji przygotować kompleksy transfekcyjne w następujący sposób:
   1. Rozcieńczać 8 μg DNA w 800 μl pożywki wzrostowej bez surowicy w sterylnej probówce do mikrocentryfugi. Delikatnie wymieszać.
   2. Rozcieńczyć 40 μl Lipofectamine (Invitrogen 18324012) w 800 μl pożywki wzrostowej bez surowicy w probówce polistyrenowej.
   3. Dodaj rozcieńczone DNA do rozcieńczonej Lipofectaminy. Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
3. Usunąć pożywkę wzrostową z komórek w kolbie T75 i zastąpić ją 6,4 ml pożywki wzrostowej bez surowicy. Do kolby dodać 1,6 ml kompleksów transfekcyjnych. Delikatnie wymieszać, kołysząc płytką.
4. Inkubować komórki w temperaturze 37°C w CO₂ inkubator przez 6 godzin.
5. Do kolby dodać 8 ml pożywki wzrostowej i inkubować w 37°C w CO₂ inkubator przez noc.
6. Usunąć medium poprzez aspirację i dodać do kolby świeże medium wzrostowe. Inkubować komórki w temperaturze 37°C w CO₂ inkubator przez noc.
7. Należy zastąpić pożywkę wzrostową pożywką selekcyjną (pożywka MEMa bez nukleotydów i nukleozydów (Gibco, numer katalogowy 12561) uzupełniona o 10% dializowanej płodowej surowicy bydlęcej (dFBS) naświetlanej promieniami γ (HyClone, numer katalogowy SH30079.03) oraz 10 ml/l 45% roztworu glukozy (Sigma, numer katalogowy G8769)).
8. Inkubować komórki w temperaturze 37°C w CO₂ inkubator przez 2-3 tygodnie.

2. Klonowanie metodą sortowania komórek aktywowanych za pomocą cytometrii przepływowej

1. Odzespój komórki z kolby i odwiruj przy 800 rpm przez 5 minut w temperaturze 4°C.
2. Resuspenduj komórki w medium selekcyjnym uzupełnionym o 2% albuminy surowicy bydlęcej oraz znakowane fluorescencyjnie przeciwciało anty-IgG przeciw ludzkie w rozcieńczeniu 1:20.
3. Inkubuj na lodzie przez 15-30 minut, a następnie przemyj dwukrotnie zimnym PBS. Resuspenduj komórki w 1x PBS w probówce polipropylenowej.
4. Przygotuj system do aseptycznej sortowności na urządzeniu BD FACSAria. Przygotuj płytkę hodowlano-komórkową 96-dołkową, zawierającą 200 μl medium selekcyjnego w każdym dołku.
5. Aseptycznie załaduj probówkę z komórkami i przeanalizuj na urządzeniu BD FACSAria, rejestrując wyniki odpowiednio dla komórek barwionych i niebarwionych.
6. Ustaw bramki i parametry w celu sortowania pojedynczych komórek o pożądanym profilu barwienia fluorescencyjnego do płytki (płytek) 96-dołkowych.
   1. Komórki transfekowane są najpierw analizowane pod kątem rozproszenia światła w przód (forward scatter) względem rozproszenia bocznego (side scatter). Bramka dla żywych komórek jest tworzona na podstawie rozproszenia w przód, które mierzy wielkość komórki, oraz rozproszenia bocznego, które mierzy złożoność lub ziarnistość komórki.
   2. Komórki mieszczące się w tej bramce są następnie badane pod kątem barwienia PE. Bramka dla PE-ujemnych jest ustawiana dla niebarwionych komórek transfekowanych lub barwionych komórek gospodarza. Podczas analizy barwionych komórek transfekowanych metodą FACS wyznacza się bramkę „High PE”, aby objęła górne 5% wszystkich komórek wykazujących pozytywne barwienie PE.
7. Inkubuj płytki w inkubatorze w temperaturze 37°C przez dwa tygodnie.

3. Dokumentacja tworzenia kolonii za pomocą urządzenia CloneSelect Imager

Dokumentuj powstawanie kolonii w płytkach 96-dołkowych za pomocą systemu CloneSelect Imager w dniu 0, 3, 7 i 13 po sortowaniu FACS. Dokumentacja obrazowa zapewni wybór klonów pochodzących z pojedynczej komórki. Krytycznym krokiem w tej dokumentacji jest prawidłowe ustawienie płaszczyzny ogniskowania dla pomiaru w dniu 0, ponieważ w tym czasie w każdym dołku znajduje się tylko jedna komórka. Bardzo ważne jest, aby obrazy tych pojedynczych komórek były ostre; próby regulacji ostrości bezpośrednio na nich mogą być w najlepszym razie mylące. Płaszczyzna ogniskowania może się znacząco różnić w zależności od marki płytek, a nawet między partiami tej samej marki. W związku z tym należy zastosować wcześniej określoną płaszczyznę ogniskowania. Można to osiągnąć poprzez ustawienie ostrości na mikrokulki testowe lub komórki o wysokiej gęstości naniesione na płytki z tej samej partii, która jest używana. Alternatywnie, do tego celu można wykorzystać całkowicie przerostłe płytki z tej samej partii. Po sortowaniu FACS ważne jest również pozostawienie komórek na minimum 2 godziny przed obrazowaniem, aby „ustabilizowały się” one w pozycji na płytce.

4. Przesiewanie i wybór wysokowydajnych klonów

1. Zadokumentuj pozycję próbek na odbiorczych 96-dołkowych płytkach analitycznych.
2. Przenieś aliquoty 20 μl supernatantu (rozcieńczając w razie potrzeby) na 96-dołkowe płytki analityczne za pomocą systemu do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO. Ta elastyczna i wydajna platforma robotyczna została przystosowana do tej oraz innych zautomatyzowanych prac nad kulturami komórkowymi. Stworzono specjalne programy, aby jak najlepiej wykorzystać i rozszerzyć możliwości robota Freedom EVO w procesie opracowywania linii komórkowych. Przykładem jest ustawienie systemu TECAN tak, aby interpretował dane z obrazowania CloneSelect Imager w celu pobierania próbek z dołków zawierających pojedyncze kolonie. Wymagane były inne programy do wykonywania dodatkowych zadań związanych z kulturą komórek, takich jak przygotowanie odpowiednich rozcieńczeń pobranych próbek, interpretacja, katalogowanie i pobieranie próbek z płytek oznakowanych ręcznie, jeśli było to wymagane, a także skalowanie klonów o wysokiej wydajności itp. Wiele z tych programów można łatwo zastosować zarówno do płytek 384-dołkowych, jak i do oryginalnego formatu 96-dołkowego.
3. Produkcję przeciwciał w próbkach analizuje się za pomocą kanapkowego testu ELISA do wykrywania ludzkiego IgG (Pierce, Rockford, IL) w systemie do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO.
   1. Próbki oraz standard (Human myeloma IgG1, kappa) (Sigma, St. Louis, MO) naniesiono na wcześniej powlekane płytki Bio Coat Anti-Human IgG Assay Plates (BD Biosciences, San Jose, CA).
   2. Płytki inkubowano w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, a następnie trzykrotnie przemyto buforem PBS.
   3. Do płytki dodano ImmunoPure Goat Anti-Human IgG, (Fc-gamma)-HRP (Pierce, Rockford, IL) w rozcieńczeniu 1:2000 i inkubowano przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.
   4. Płytki przemyto trzykrotnie buforem PBS przed dodaniem substratu ABTS (Pierce, Rockford, IL), a następnie odczytano je w czytniku płytek, mierząc absorbancję przy 405 nm w celu detekcji.
4. Wybierz wysoko wydajne klony i oceń ich produktywność w hodowli zawiesinowej. W przypadku hodowli typu fed-batch komórki szczepiono w stężeniu 0.3X106 cells/mL w medium wolnym od białek JRH ImMEDIAte ADVANTAGE 65578 (SAFC Biosciences, Lenexa, KS) uzupełnionym o 5 g/L hydrolizatu soi (DMV International, numer katalogowy SE50MAF-UF, numer partii ) i inkubowano w 37°C przy 7.5% CO₂. Hodowlę kontynuowano, uzupełniając o 2 g/L glukozy (Sigma, numer katalogowy G8769, numer partii 098K2329), gdy stężenie glukozy i mleczanu w kulturze spadło poniżej 2 g/L, oraz dodając 2 mM glutaminy (Gibco, numer katalogowy 25030, numer partii 568177), gdy poziom glutaminy spadł poniżej 200 mg/L (metabolity mierzone za pomocą Bioanalizatora YSI). Hodowle fed-batch zakończono w 14. dniu, a produkcję przeciwciał zmierzono metodą HPLC w fazie odwróconej.
5. Charakterystyka genetyczna klonów kandydujących za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH)⁵.

5. Reprezentatywne wyniki:

Przykład opracowywania klonów produkujących przeciwciała przy użyciu metody wysokoprzepustowej przedstawiono na Rysunku 1 i Rysunku 2. Pula przetransfekowanych komórek została zabarwiona fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem anty-human IgG (Rysunek 1A), a następnie przeanalizowana i posortowana na urządzeniu BD FACSAria (Rysunek 1B). Tworzenie kolonii na płytce 96-dołkowej obrazowano za pomocą CloneSelect Imager (Rysunek 1C). Nadpłyn z hodowli komórkowej pobierano z dołków zawierających pojedyncze kolonie i analizowano metodą ELISA na systemie do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO (Rysunek 1D). Wysoce produktywne klony zidentyfikowano wśród komórek wykazujących wyższy poziom przeciwciał powierzchniowych, co odzwierciedlało barwienie fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem anty-human IgG. Porównując klony wygenerowane z dwóch populacji początkowej puli przetransfekowanych komórek, zaobserwowano ogromną różnicę w produktywności w hodowli typu fed-batch (Rysunek 2). Dla dwóch najlepszych klonów wygenerowanych z populacji komórek o wysokiej ekspresji przeciwciał powierzchniowych (PE high) produktywność specyficzna wynosiła od 50-70 pg/cell/day. Natomiast produktywność przeciwciał wynosiła ~20 pg/cell/day dla dwóch najlepszych klonów wygenerowanych z populacji komórek o niskiej ekspresji przeciwciał powierzchniowych (PE low). Ponadto linie komórkowe opracowane za pomocą sortowania FACS są bardziej stabilne pod względem produkcji przeciwciał niż te, które zostały sklonowane poprzez ręczne rozcieńczanie limitujące (Rysunek 3A). Produktywność specyficzna najlepszego klonu, „Clone 1”, wygenerowanego przez ręczne rozcieńczanie limitujące, spadła z ~30 pcd do ~10 pcd po hodowli przez 80 podwojeń komórek. Z drugiej strony, najlepszy subklon wygenerowany przez sortowanie FACS, „Clone 2”, był w stanie utrzymać produktywność specyficzną na poziomie około 20 pcd przez co najmniej 100 podwojeń komórek. Za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) wykazaliśmy, że Clone 1 stanowił mieszaną populację fenotypu A (85%) i fenotypu B (15%). W przeciwieństwie do tego, klon sortowany przez FACS (clone 2) okazał się populacją bardziej jednorodną, w której 99,5% komórek okazało się być fenotypem A (Rysunek 3B).

Rysunek 1. Opracowanie linii komórkowych do produkcji przeciwciał monoklonalnych z komórek CHO. A) Barwienie powierzchniowe początkowej puli przetransfekowanych komórek przy użyciu przeciwciała anty-IgG ludzkiego znakowanego fluorescencyjnie. B) Sortowanie populacji komórek o wysokiej intensywności fluorescencji (PE high) i niskiej intensywności fluorescencji (PE low) do płytki 96-dołkowej. C) Dokumentowanie tworzenia kolonii od dnia 0 do dnia 13 po wysianiu przy użyciu systemu CloneSelect Imager. D) Przesiew klonów metodą ELISA.

Rycina 2. Poziom przeciwciał związanych z powierzchnią koreluje z produktywnością przeciwciał komórki. Klony o wysokim i niskim stopniu barwienia fluorescencyjnego zostały przekształcone w linie komórkowe i ocenione w hodowli typu fed-batch. Miano objętościowe oraz specyficzna produktywność zostały porównane dla dwóch najlepszych klonów z każdej populacji.

Rysunek 3. Klony wygenerowane poprzez sortowanie FACS wykazują wyższą homogeniczność genetyczną i stabilność klonalną. A) Stabilność produkcji przeciwciał w hodowli okresowej przez około 80 podwojeń komórek w czasie trwania hodowli. Δ, klon został wygenerowany metodą rozcieńczeń ograniczających, gdzie komórki zasiano w gęstości 2000 komórek/dołek, 1000 komórek/dołek oraz 500 komórek/dołek. , klon został wygenerowany metodą FACS w gęstości 1 komórki/dołek. B) Miejsce integracji transgenu w chromosomie komórki CHO zidentyfikowane za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ.

Dyskusja

Przedstawiliśmy zautomatyzowaną platformę do opracowywania linii komórkowych do produkcji, która umożliwia izolację wysoko wydajnych klonów, zapewniając jednocześnie klonalność i stabilność klonu. Zastosowanie barwienia przeciwciał powierzchniowych z następującym po nim sortowaniem komórek metodą FACSAria jest kluczowe dla uzyskania pojedynczych klonów o wysokiej wydajności produkcji przeciwciał. Nasze wyniki oraz inne doniesienia^2-4 sugerują, że poziom przeciwciał przejściowo eksponowanych na powierzchni komórki dobrze koreluje z wydajnością komórki. Zatem przeciwciało sprzężone z fluoresceiną może zostać użyte do rozpoznania produktu związanego z błoną i wspomagania izolacji wysoko wydajnych producentów. Alternatywnie, w celu ułatwienia selekcji wysoko wydajnych klonów za pomocą FACS stosowano koekspresję genów reporterowych oraz technologię mikrokropel żelowych^6-8. Oprócz izolacji wysoko wydajnych klonów za pomocą FACS, opracowano inne technologie służące do osiągnięcia tego samego celu. Należą do nich technologia CellSpot firmy Trellis Bioscience, która wykorzystuje systemy detekcji przeciwciał za pomocą mikrosfer oraz technologię skanowania laserowego do identyfikacji wysoko wydajnych klonów i eliminacji niepożądanych komórek, a także platformy Genetix ClonePix FL oraz StemCell Technologies ClonaCell EasyPick, które umożliwiają wysokoprzepustowe skanowanie produkcyjnych linii komórkowych przy użyciu fluorescencyjnego systemu detekcji przeciwciał. Zdecydowaliśmy się na wdrożenie metody klonowania FACS w oparciu o poziom przeciwciał związanych z powierzchnią, ponieważ łączy ona łatwość obsługi, selektywność ze względu na wydajność oraz klonalność.

Zastosowanie systemu do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO znacząco zwiększyło przepustowość screeningu, co umożliwiło wyselekcjonowanie klonów o wysokiej wydajności z znacznie większej puli komórek. Inna aparatura analityczna, taka jak HTRF, BioForte Octet, HPLC itp., stanowi również możliwe sposoby selekcji wysokowydajnych producentów i odrzucania tych o niskiej wydajności. Dzięki śledzeniu formowania się klonów za pomocą CloneSelect Imager wygenerowano niezbędną dokumentację potwierdzającą klonalność wraz z cyfrową historią linii komórkowej. Klonalność jest dodatkowo potwierdzana poprzez genetyczną charakterystykę pojedynczego miejsca integracji transgenu w chromosomie. W związku z tym można pominąć etap subklonowania, który zazwyczaj wykonuje się w celu zapewnienia klonalności. Pozwala to zaoszczędzić od 4 do 8 tygodni czasu w procesie opracowywania linii komórkowej. Podsumowując, wysokiej jakości linie komórkowe wygenerowane za pomocą zautomatyzowanej platformy wysokoprzepustowej wykazały wysoką produktywność, stabilność produkcji oraz udokumentowaną historię linii komórkowej, co powinno spełniać wymagania produkcji na dużą skalę oraz aktualne wymogi regulacyjne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sorter komórek BD FACS Aria™	BD Biosciences
Obrazownik CloneSelect™	Genetix
System do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO®	Tecan Group Ltd.