Wysokowydajna, zautomatyzowana platforma do rozwoju linii komórkowych do produkcji leków białkowych

Summary

Opisana jest wysokoprzepustowa, zautomatyzowana platforma rozwoju linii komórkowych do produkcji leków białkowych. Wdrożenie BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager i systemu obsługi cieczy TECAN Freedom EVO wykazało znaczny wzrost mocy przerobowych w rozwoju linii komórkowych przy poprawie jakości linii komórkowych i wysokiej odtwarzalności.

Abstract

Szybko rozwijający się przemysł biofarmaceutyczny wymaga szybkiego rozwoju wysoce wydajnych i niezawodnych systemów produkcyjnych, aby sprostać rosnącemu zapotrzebowaniu na dostawy leków. Tworzenie linii produkcyjnych komórek produkcyjnych tradycyjnie wiązało się z operacjami ręcznymi, które są pracochłonne, o niskiej przepustowości i podatne na błędy ludzkie. Przedstawiamy tutaj zintegrowaną, wysokowydajną i zautomatyzowaną platformę do rozwoju linii produkcyjnych komórek do produkcji leków białkowych.

Połączenie BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager i systemu obsługi cieczy TECAN Freedom EVO umożliwiło wysokoprzepustowy i bardziej efektywny proces rozwoju linii komórkowych. W tej operacji produkcyjne komórki gospodarza są najpierw transfekowane wektorem ekspresyjnym przenoszącym gen będący przedmiotem zainteresowania ¹, a następnie poddawane działaniu środka selekcyjnego. Stabilnie transfekowane komórki są następnie barwione znakowanym fluorescencyjnie przeciwciałem anty-ludzkim IgG, a następnie poddawane analizie cytometrii przepływowej ^2-4. Wysoce produktywne komórki są wybierane na podstawie intensywności fluorescencji i izolowane przez sortowanie pojedynczych komórek na BD FACSAria. Tworzenie kolonii od stadium pojedynczej komórki zostało wykryte pod mikroskopem, a seria cyfrowych zdjęć poklatkowych została wykonana przez CloneSelect Imager w celu udokumentowania historii linii komórkowych. Po uformowaniu się pojedynczych klonów, klony te zostały przebadane pod kątem produktywności za pomocą testu ELISA przeprowadzonego w systemie obsługi cieczy TECAN Freedom EVO. Około 2 000 - 10 000 klonów może być przesiewanych w jednym cyklu operacyjnym przy obecnej konfiguracji systemu.

To zintegrowane podejście zostało wykorzystane do wygenerowania linii komórkowych jajnika chomika chińskiego (CHO) o wysokiej produkcji do produkcji terapeutycznych przeciwciał monoklonalnych (mAb), jak również ich białek fuzyjnych. Dzięki różnym typom sond detekcyjnych metoda ta może być wykorzystana do opracowania innych terapii białkowych lub może być zastosowana do innych produkcyjnych systemów gospodarza. W porównaniu z tradycyjną procedurą ręczną, ta zautomatyzowana platforma wykazała zalety w postaci znacznie zwiększonej wydajności, zapewnionej klonalności, identyfikowalności w historii linii komórkowej z elektroniczną dokumentacją i znacznie zmniejszonego prawdopodobieństwa popełnienia błędu przez operatora.

Protocol

1. Transfekcja komórek gospodarza

1. Nasiona 2 x 10⁶ komórek CHO-DXB11 w kolbie hodowlanej komórek T75 Corning w 15 ml pożywki wzrostowej (MEMa z nukleotydami i nukleozydami (Gibco, numer katalogowy 12571) uzupełnionej 10% napromieniowaną γ charakteryzującą się płodową surowicą bydlęcą (cFBS) (HyClone, numer katalogowy SH30071.03) i 10 ml/l 45% roztworu glukozy (Sigma, numer katalogowy G8769)) na jeden dzień przed transfekcją.
2. W czasie transfekcji należy przygotować kompleksy transfekcyjne w następujący sposób:
   1. Rozcieńczyć 8 μg DNA w 800 μl pożywki wzrostowej bez surowicy w sterylnej probówce do mikrowirówki. Delikatnie wymieszaj.
   2. Rozcieńczyć 40 μl Lipofektaminy (Invitrogen 18324012) w 800 μl pożywki wzrostowej bez surowicy w probówce z polistyrenu.
   3. Dodać rozcieńczone DNA do rozcieńczonej lipopektaminy. Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
3. Usunąć pożywkę wzrostową z komórek w T75 i zastąpić 6,4 ml pożywki wzrostowej bez surowicy. Dodać 1,6 ml kompleksów transfekcji do kolby. Delikatnie wymieszaj, kołysząc talerzem.
4. Inkubować komórki w temperaturze 37°C w inkubatorze CO₂ przez 6 godzin.
5. Dodać 8 ml pożywki wzrostowej do kolby i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO_{2 przez} noc.
6. Usunąć pożywkę przez aspirację i dodać świeżą pożywkę wzrostową do kolby. Inkubować komórki w temperaturze 37°C w inkubatorze CO_{2 przez} noc.
7. Zastąp pożywkę wzrostową pożywką selekcyjną (pożywka MEMa bez nukleotydów i nukleozydów (Gibco, numer katalogowy 12561) uzupełniona 10% napromieniowaną γ dializowaną płodową surowicą bydlęcą (dFBS) (Hyklon, numer katalogowy SH30079.03) i 10 ml/l 45% roztworu glukozy (Sigma, numer katalogowy G8769)).
8. Inkubować komórki w temperaturze 37°C w inkubatorze CO₂ przez 2-3 tygodnie.

2. Klonowanie za pomocą sortowania komórek aktywowanego cytometrią przepływową

1. Wyjąć komórki z kolby i odwirować z prędkością 800 obr./min przez 5 minut w temperaturze 4°C.
2. Ponownie zawiesić komórki w pożywce selekcyjnej uzupełnionej 2% albuminą surowicy bydlęcej i znakowanym fluorescencyjnie przeciwciałem anty-ludzkim IgG w rozcieńczeniu 1:20.
3. Inkubować na lodzie przez 15-30 minut, a następnie dwukrotnie przemyć zimnym PBS. Zawieś komórki w 1x PBS w probówce polipropylenowej.
4. Przygotuj się do aseptycznego sortowania na BD FACSAria. Przygotować 96-dołkową płytkę do hodowli komórkowej, która zawiera 200 μl pożywki selekcyjnej w każdym dołku.
5. W asepcie załadować probówkę komórkami i przeanalizować na BD FACSAria, zapisać wyniki odpowiednio dla komórek barwionych i niebarwionych.
6. Ustaw bramki i ustawienia, aby posortować pojedyncze komórki o pożądanym profilu barwienia fluorescencyjnego na 96-dołkową płytkę (płytki).
   1. Transfekowane komórki są najpierw analizowane na podstawie rozproszenia do przodu w porównaniu z rozproszeniem bocznym. Bramka dla żywych komórek jest tworzona na podstawie rozproszenia do przodu, które mierzy rozmiar komórki, oraz rozproszenia bocznego, które mierzy złożoność lub ziarnistość komórki.
   2. Komórki, które wpadają w tę bramkę, są następnie badane pod kątem barwienia PE. Bramka ujemna PE jest ustawiana dla niebarwionych komórek transfekowanych lub barwionych komórek gospodarza. Gdy barwione transfekowane komórki są badane przez FACS, bramka "High PE" jest następnie wyznaczana tak, aby obejmowała górne 5% wszystkich komórek, które są dodatnie pod kątem barwienia PE.
7. Inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 37°C przez dwa tygodnie.

3. Dokumentacja tworzenia kolonii za pomocą CloneSelect Imager

Udokumentuj tworzenie kolonii na 96-dołkowych płytkach na CloneSelect Imager w dniu 0, dniu 3, dniu 7 i dniu 13 po sortowaniu FACS. Dokumentacja obrazu zapewni wybór klonów pochodzących z pojedynczej komórki. Krytycznym krokiem w tej dokumentacji jest prawidłowe dostosowanie płaszczyzny ogniskowej do pomiaru dnia 0, ponieważ w tym momencie w każdym dołku znajduje się tylko jedna komórka. Bardzo ważne jest, aby obrazy tych pojedynczych komórek były ostre, a próba dostosowania ostrości na nich może być w najlepszym razie myląca. Płaszczyzna ogniskowej może się znacznie różnić w zależności od marki płyt, a być może nawet w zależności od partii tej samej marki. W związku z tym należy użyć z góry określonej płaszczyzny ogniskowej. Można to osiągnąć, koncentrując się na testowych mikrokulkach lub komórkach o dużej gęstości osadzonych na płytkach z tej samej partii, która jest używana. Alternatywnie można do tego celu użyć w pełni wyrośniętych talerzy z tej samej partii. Po sortowaniu metodą FACS ważne jest również, aby pozwolić komórkom osiąść na co najmniej 2 godziny przed obrazowaniem, aby zostały "utrwalone" na płytce.

4. Selekcja i selekcja wysoce produktywnych klonów

1. Udokumentować położenie próbki na 96-dołkowych płytkach do oznaczania.
2. Przenieść podwielokrotności 20 μl supernatantu (w razie potrzeby rozcieńczyć) na 96-dołkowe płytki testowe za pomocą systemu obsługi cieczy TECAN Freedom EVO. Ta elastyczna i wydajna platforma robotyczna została przystosowana do tej i innych zautomatyzowanych prac związanych z hodowlą komórkową. Specjalne programy zostały napisane, aby jak najlepiej wykorzystać i zwiększyć możliwości robotyczne Freedom EVO w rozwoju linii komórkowych. Przykładem tego jest ustawienie TECAN tak, aby interpretował dane CloneSelect Imager w celu pobierania próbek z pojedynczymi koloniami. Inne programy były potrzebne do wykonania dodatkowych zadań związanych z hodowlą komórkową, takich jak odpowiednie rozcieńczenie pobranych próbek, interpretacja, katalogowanie i ręczne pobieranie próbek z płytek, jeśli było to wymagane, skalowanie klonów o wysokiej produkcji itp. Wiele z tych programów można łatwo zastosować do płytek 384-dołkowych, a także do oryginalnego formatu 96-dołkowego.
3. Produkcja przeciwciał w próbkach jest analizowana przez test ELISA z wykrywaniem ludzkiej IgG (Pierce, Rockford, IL) w systemie obsługi cieczy TECAN Freedom EVO.
   1. Próbki i wzorzec (szpiczak ludzki IgG1, kappa) (Sigma, St. Louis, MO) załadowano na wstępnie powlekane płytki testowe Bio Coat Anti-Human IgG (BD Biosciences, San Jose, CA).
   2. Płytki inkubowano w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, a następnie trzykrotnie płukano PBS.
   3. ImmunoPure Goat Anti-Human IgG, (Fc-gamma)-HRP (Pierce, Rockford, IL) dodano do płytki w rozcieńczeniu 1:2000 i inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej.
   4. Płytki przemyto trzykrotnie PBS przed dodaniem podłoża ABTS (Pierce, Rockford, IL) i odczytano je na czytniku płytek przy użyciu absorbancji przy 405 nm w celu wykrycia.
4. Wybierz wysoce produktywne klony i oceń produktywność w hodowli zawiesiny. W przypadku hodowli paszowej komórki inokulowano w ilości 0,3X106 komórek/ml w pożywce wolnej od białek JRH ImMEDIAte ADVANTAGE 65578 (SAFC Biosciences, Lenexa, KS) uzupełnionej hydrolizatem sojowym 5 g/l (DMV International, numer katalogowy SE50MAF-UF, numer partii) i inkubowano w temperaturze 37°C z 7,5% CO₂ . Hodowla była kontynuowana i była uzupełniana o 2 g/L glukozy (Sigma, numer katalogowy G8769, numer partii 098K2329), gdy stężenie glukozy i mleczanu w kulturze osiągało poniżej 2 g/L, a następnie karmiona 2 mM glutaminą (Gibco, numer katalogowy 25030, numer partii 568177), gdy poziom glutaminy osiągnął poniżej 200 mg/L (metabolity mierzone za pomocą YSI Bioanalyzer). Hodowle w serii paszowej zakończono w dniu 14, a produkcję przeciwciał mierzono za pomocą HPLC z odwróconą fazą.
5. Charakterystyka genetyczna potencjalnych klonów metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH)⁵.

5. Reprezentatywne wyniki:

Przykład tworzenia klonów wytwarzających przeciwciała metodą wysokoprzepustową jest pokazany na Rysunku 1 i Rysunku 2. Transfekowaną pulę komórek wybarwiono fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem anty-ludzkim IgG (Figura 1A), przeanalizowano i posortowano na BD FACSAria (Figura 1B). Formowanie się kolonii w płytce 96-dołkowej zostało zobrazowane za pomocą CloneSelect Imager (Rysunek 1C). Próbki supernatantu z hodowli komórkowej pobrano z dołków zawierających pojedynczą kolonię i oznaczono testem ELISA w systemie obsługi cieczy TECAN Freedom EVO (ryc. 1D). Wysoce produktywne klony znaleziono z komórek, które wykazywały wyższy poziom przeciwciał powierzchniowych odzwierciedlony przez barwienie fluorescencyjnie znakowaną anty-ludzką IgG. Porównując klony wygenerowane z dwóch populacji początkowej puli transfekowanych komórek, zaobserwowano ogromną różnicę w produktywności w hodowli karmionej partiami (ryc. 2). Dla dwóch pierwszych klonów wygenerowanych z populacji komórek o wysokiej ekspresji przeciwciał powierzchniowych (PE high), specyficzna produktywność wahała się od 50-70 pg/komórkę/dzień. Natomiast produktywność przeciwciał wynosiła ~20 pg/komórkę/dzień dla dwóch najlepszych klonów wygenerowanych z populacji komórek o niskiej ekspresji przeciwciał powierzchniowych (PE low). Co więcej, linie komórkowe opracowane przez sortowanie FACS są bardziej stabilne pod względem produkcji przeciwciał niż te, które zostały sklonowane przez ręczne rozcieńczenie wapnowania (Figura 3A). Wydajność właściwa najwyższego klonu, "Klonu 1", generowanego przez ręczne rozcieńczanie wapnowania, spadła z ~30 pcd do ~10 pcd po hodowli 80 podwojeń komórek. Z drugiej strony, najwyższy subklon wygenerowany przez sortowanie FACS, "Klon 2", był w stanie utrzymać właściwą wydajność około 20 pcd dla co najmniej 100 podwojeń komórek. Poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) wykazaliśmy, że klon 1 występuje jako mieszana populacja fenotypu A (85%) i fenotypu B (15%). W przeciwieństwie do tego, posortowany klon FACS (klon 2) okazał się być bardziej jednorodną populacją, z 99,5% komórek, które okazały się fenotypem A (Figura 3B).

Rysunek 1. Opracowanie linii komórkowych do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych z komórek CHO. A) Barwienie powierzchniowe początkowej transfekowanej puli komórek znakowanym fluorescencyjnie przeciwciałem anty-ludzkim IgG. B) Sortowanie populacji komórek o wysokiej intensywności fluorescencji (PE wysoka) i niskiej intensywności fluorescencji (PE niska) na płytkę 96-dołkową. C) Dokumentowanie tworzenia kolonii od dnia 0 do dnia 13 po wysiewie w CloneSelect Imager. D) Badanie przesiewowe klonów metodą ELISA.

Rysunek 2. Poziom przeciwciał związany z powierzchnią koreluje z produktywnością przeciwciał w komórce. Klony o wysokim i niskim wybarwieniu fluorescencyjnym zostały rozwinięte w linie komórkowe i ocenione w hodowli wsadowej. Wolumetryczne miano i specyficzną produktywność porównano między 2 najlepszymi klonami każdej populacji.

Rysunek 3. Klony wygenerowane w wyniku sortowania FACS wykazują wyższą jednorodność genetyczną i stabilność klonów. A) Stabilność produkcji przeciwciał w hodowli okresowej przez ~80 podwojeń czasu trwania hodowli. Δ, klon został wygenerowany przez ograniczenie rozcieńczenia, w którym komórki wysiewano w 2000 komórek / studzienkę, 1000 komórek / studnię i 500 komórek / studnię. , klon został wygenerowany przez FACS w 1 komórce/studni. B) Miejsce integracji transgenu w chromosomie komórki CHO jest identyfikowane przez fluorescencyjną hybrydyzację in situ.

Discussion

Zaprezentowaliśmy zautomatyzowaną platformę do rozwoju linii komórkowych do produkcji, która umożliwia izolację wysoce wydajnych klonów, a jednocześnie zapewnia klonowalność i stabilność klonów. Barwienie powierzchniowe przeciwciałami, a następnie sortowanie komórek metodą FACSAria jest kluczem do uzyskania pojedynczych klonów o wysokiej produktywności przeciwciał. Nasze wyniki i inne doniesienia^2-4 sugerują, że poziom przeciwciał przejściowo wyświetlany na powierzchni komórki dobrze korelował z produktywnością komórki. W ten sposób przeciwciało sprzężone z fluoresceiną może być użyte do rozpoznania produktu związanego z błoną i pomocy w izolacji wysokich producentów. Alternatywnie, koekspresja genów reporterowych i technologia mikrokropli żelowych zostały wykorzystane w celu ułatwienia selekcji klonów o wysokiej produkcji przez FACS^6-8. Oprócz izolowania klonów o wysokiej produkcji za pomocą FACS, inne technologie ewoluowały, aby osiągnąć ten sam cel. Należą do nich technologia Trellis Bioscience CellSpot, która wykorzystuje systemy wykrywania przeciwciał microspere i technologię badań laserowych do identyfikacji wysoce produktywnych klonów i eliminacji niechcianych komórek, platformę Genetix ClonePix FL i StemCell Technologies ClonaCell EasyPick, która przeprowadza wysokoprzepustowe badania przesiewowe linii komórkowych produkcji przy użyciu fluorescencyjnego systemu wykrywania przeciwciał. Zdecydowaliśmy się na wdrożenie metody klonowania FACS opartej na poziomie przeciwciał związanych z powierzchnią, ponieważ łączy ona w sobie łatwość obsługi, selektywność w zakresie produktywności i klonalności.

Zastosowanie systemu transportu cieczy TECAN Freedom EVO znacznie zwiększyło wydajność przesiewania, co daje możliwość selekcji klonów o wysokiej wydajności ze znacznie większej puli komórek. Inne oprzyrządowanie do oznaczania, takie jak HTRF, BioForte Octet, HPLC itp., są możliwymi sposobami selekcji wysokich producentów i odsiewania niskich producentów. Śledząc powstawanie klonów za pomocą CloneSelect Imager, wygenerowaliśmy niezbędną dokumentację, aby udowodnić klonalność na podstawie zdigitalizowanej historii linii komórkowych. Klonalność jest dodatkowo potwierdzana przez genetycznie scharakteryzowane pojedyncze miejsce integracji transgenu na chromosomie. W ten sposób można wyeliminować etap podklonowania, który jest zwykle podejmowany w celu zapewnienia klonalności. Pozwoli to zaoszczędzić 4-8 tygodni czasu na rozwój linii komórkowej. Podsumowując, wysokiej jakości linie komórkowe wygenerowane przez zautomatyzowaną platformę o wysokiej przepustowości wykazały wysoką produktywność, stabilność produkcji i udokumentowaną historię linii komórkowych, które powinny sprostać zapotrzebowaniu na produkcję na dużą skalę i obecnym wymogom regulacyjnym.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACS Aria™ Sortownik komórek	BD Biosciences
CloneSelect™ Imager	Genetix
TECAN Freedom EVO® system obsługi cieczy	Tecan Group Ltd.