Ekstrakcja nienaruszonej nerki od myszy: technika uzyskiwania nerki bez torebki nerkowej z modeli mysich

Streszczenie

Źródło: Grainger, N. et al. Izolowanie i obrazowanie żywych, nienaruszonych obszarów rozrusznika miednicy nerkowej myszy poprzez przekrój wibratomem. J. Vis. Exp. (2021)

W tym filmie opisujemy procedurę pobierania nerki z przestrzeni zaotrzewnowej myszy. Wyekstrahowaną nerkę można następnie poddać mikrosekcji w celu uzyskania nienaruszonej nerki bez torebki nerkowej i otaczającej warstwy tłuszczu.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Rozwarstwienie nerki

1. Myszy należy znieczulić poprzez inhalację 3–4% izofluranu w wentylowanym kapturze. Potwierdź indukcję głębokiego znieczulenia przez utratę odruchu szczypania palca u nogi i/lub ogona, a następnie poddaj myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
2. Nałóż 70% etanolu na klatkę piersiową, aby zwilżyć sierść. Za pomocą zewnętrznych nożyczek preparacyjnych otwórz jamę brzuszną przez podłużne nacięcie, z ostrzami nożyczek ustawionymi pod kątem od zwierzęcia, aby zapobiec uszkodzeniu narządów wewnętrznych.
3. Za pomocą kleszczy do tkanek wewnętrznych i nożyczek do rozwarstwiania wewnętrznego uszczypnij jelita i oderwij je od ściany brzucha. Unosząc jelita, odetnij spód jelit z dala od ciała na bliższej dwunastnicy i dystalnej części okrężnicy, aby uzyskać dostęp do przestrzeni zaotrzewnowej zawierającej nerki.
4. Po odsłonięciu nerek należy je usunąć pojedynczo. Delikatnie ściśnij i unieś dystalny koniec moczowodu (~4 mm od nerki) za pomocą kleszczyków tkankowych. Za pomocą nożyczek preparacyjnych przeciąć pod ściśniętym moczowodem w kierunku nerki. Kontynuuj nacinanie pod nerką, aż zostanie uwolniona z otaczającej tkanki łącznej.
   nuta: Aby zmaksymalizować integralność tkanki i spójność cięcia podczas cięcia wibratomem, nerka musi być tak nienaruszona, jak to tylko możliwe. Aby to zapewnić, unikaj szczypania lub przecinania nerki kleszczami i nożyczkami preparacyjnymi.
5. Umieść nerkę z dołączonym moczowodem w lodowatym roztworze KRB. Powtórz etapy ekstrakcji z przeciwległą nerką, aby usunąć z ciała myszy. Utrzymuj nerki w roztworze KRB na lodzie.
   UWAGA: Natychmiast przejdź do następnej sekcji protokołu, aby zachować żywotność tkanek PKJ. Ze względu na swoje anatomiczne umiejscowienie głęboko w miąższu nerki, PKJ jest pozbawiony kontaktu z roztworem KRB.

2. Przygotuj nerkę bez torebki nerkowej do cięcia wibratomem

1. Przenieść nerkę do naczynia rozwarstwiającego pokrytego elastomerem silikonowym (60 mm x 15 mm) i napełnić je lodowatym roztworem KRB, aż nerka zostanie całkowicie zanurzona.
2. Pod mikroskopem preparacyjnym zakotwiczyć nerkę u podstawy naczynia, wprowadzając drobne szpilki do bliższego moczowodu i przez cienką przednią torebkę nerkową lub otaczającą tkankę tłuszczową.
   nuta: Uważaj, aby nie przebić tkanki miąższu nerki.
3. Użyj cienkich sprężynowych nożyczek i wewnętrznych kleszczyków, aby usunąć tkankę tłuszczową z podstawy nerki, aby odsłonić dystalną część RP i proksymalny moczowód.
4. Usuń bliższy moczowód i część dystalnego RP z podstawy RP za pomocą cienkich nożyczek sprężynowych.
   nuta: Uważaj, aby nie przeciąć otaczającego miąższu nerki. przerywana linia na rysunku 1A wskazuje przybliżoną pozycję tego cięcia. To cięcie tworzy płaską podstawę na nerce dla bardziej równomiernego podziału tkanek. Podczas preparacji nerki należy zdawać sobie sprawę z anatomicznego położenia okolicy PKJ. Rycina 1B pokazuje, że nienaruszoną nerkę można przeciąć wzdłuż płaszczyzny strzałkowej, aby odsłonić rdzeń, brodawkę (dystalny rdzeń, w którym zbiegają się przewody zbiorcze) oraz proksymalną i dystalną RP. Jeśli brodawka miałaby być całkowicie odsłonięta, jak na rysunku 1C, można uwidocznić PKJ i proksymalny RP (prox RP). Nie należy tego jednak robić w przypadku techniki wibratomowej; opis ten ma na celu zorientowanie czytelnika w ogólnym położeniu PKJ, podkreślonym w różnicy anatomicznej pokazanej na obrazach w świetle przechodzącym regionu PKJ i środkowego obszaru RP na rysunku 1D, E.
5. Przebij zewnętrzną torebkę nerkową kleszkami z cienką końcówką, odchylając końcówki od trzonu nerki. Używając kleszczy każdą ręką, ściśnij luźne końce kapsułki i rozsuń je. Kontynuuj odklejanie pozostałej błony torebki nerkowej, aż zostanie całkowicie usunięta.
   nuta: Torebka nerkowa to twarda, włóknista warstwa otaczająca nerkę. Należy go usunąć przed cięciem wibratomem w celu optymalnego cięcia.

Wyniki

Rycina 1: Podstawowa anatomia nerek i lokalizacja obszaru rozrusznika PKJ.(A) Schemat nienaruszonej nerki pokazujący orientację RP i moczowodu. Tętnica nerkowa i żyła nerkowa są wyświetlane odpowiednio na czerwono i niebiesko. (B) Nienaruszoną nerkę można przeciąć wzdłuż płaszczyzny strzałkowej, aby odsłonić wewnętrzną część nerki, w tym rdzeń, brodawkę (dystalny rd...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szalka Petriego 60 mm x 15 mm	Sigma Aldrich	Zobacz materiał P5481	Ostre naczynie preparacyjne nerki
Papier chłonny	Fisher Naukowy	06-666A	Aby osuszyć nerkę przed nałożeniem klej
B6; 129S-GT(ROSA)26Sor/J	Laboratorium Jacksona	Numer katalogowy: 13148	Myszy GCaMP3
B6; 129S-GT(ROSA)26Sor/J	Laboratorium Jacksona	Numer katalogowy: 24105	Myszy GCaMP6f
Klasa B6. FVB-TG(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J	Laboratorium Jacksona	Rocznik 19079	Myszy smMHC-CRE
C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J	Laboratorium Jacksona	Numer katalogowy: 13148	Myszy PDGFRa-CRE
etanol	Phamco-Aaper	Zobacz materiał SDA 2B-6	Do preparacji
Bardzo cienkie nożyczki Bonn	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 14083-08	Służy do wewnętrznych nożyczek preparacyjnych
Cienkie nożyczki	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 14060-09	Służy do zewnętrznych nożyczek preparacyjnych
Kleszcze z cienką końcówką	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 11254-20	Służy do dokładnego rozwarstwienia nerki
Izofluran	Baxter	NDC 1001936060	Do znieczulenia
Elastomer silikonowy	Fisher Naukowy	NC9285739	ul. Sylgard 184
Kleszcze studenckie Adson	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 91106-12	Do delikatnego trzymania i przesuwania nerka
Kleszcze ucznia Dumonta	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 91150-20	Służy do wewnętrznych kleszczy preparacyjnych
Nożyczki sprężynowe Vannas	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 15000-03	Do ostrego rozbioru i czyszczenia izolowana nerka

powiedział: