Dostarczanie plazmidów DNA do nabłonka dróg moczowych pęcherza myszy: procedura oparta na elektroporacji mająca na celu skuteczne dostarczanie plazmidów DNA do komórek urotelialnych pęcherza myszy w celu wygenerowania modeli modyfikowanych genetycznie

Streszczenie

Źródło: Chuan, Y. et al. Nowatorska metoda dostarczania plazmidowego DNA do nabłonka moczowego myszy metodą elektroporacji. J. Vis. Exp.(2018)

Ten film demonstruje dostarczanie plazmidu DNA do nabłonka dróg moczowych pęcherza myszy za pomocą kombinacji cewnikowania cewki moczowej i technik elektroporacji. Opisana procedura pozwala na wygenerowanie modeli raka pęcherza moczowego u myszy.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie plazmidu i narzędzi

1. Dla każdego pęcherza moczowego do transfekcji przygotuj co najmniej 20 μl plazmidu DNA (1 μg/μl).
2. Dodać 1 μl błękitu trypanowego do 20 μl roztworu plazmidu w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odpipetować do dobrego wymieszania.
3. Autoklaw wszystkie narzędzia chirurgiczne i wysterylizuj miejsce pracy 70% etanolem. Często spryskuj narzędzia chirurgiczne i rękawice 70% etanolem lub używaj sterylizatora z kulkami szklanymi podczas wykonywania poniższych czynności, aby utrzymać sterylne warunki.

2. Dostarczanie plazmidu

1. Nałóż 70% etanol na znieczulony brzuch myszy i za pomocą skalpela wykonaj pionowe nacięcie 1 cm, aby otworzyć skórę brzucha powyżej pęcherza.
2. Pobrać pipetę z co najmniej 20 μl plazmidu i roztworu błękitu trypanowego do zewnętrznego końca cewnika i założyć strzykawkę.
3. Wstrzyknąć roztwór plazmidu do pęcherza moczowego. Jeśli pęcherz zmieni kolor na niebieski, wstrzyknięcie się powiedzie. Pozostaw trochę płynu w cewniku, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza w pęcherzu.
4. Chwyć zewnętrzny otwór cewki moczowej za pomocą pęsety, a następnie wyjmij cewnik i strzykawkę. Użyj sznurka, aby zacisnąć zewnętrzny otwór cewki moczowej. Zrób dwie pętle ze sznurka, a następnie zawiąż dwoma węzłami.
   nuta: Zaciśnięcie cewki moczowej jest ważne dla zapobiegania cofaniu się płynu plazmidowego.
5. Włącz generator elektroporacji o następujących parametrach: 33 V, czas pracy 50 ms i czas interwału 950 ms.
6. Przytrzymaj pęcherz pęsetą i uszczypnij pęcherz dwiema elektrodami. Naciśnij pedał nożny, aby wykonać elektroporację.
   nuta: Impulsy elektryczne są ustawione tak, aby pojawiały się 5 razy w krótkich odstępach czasu po każdym naciśnięciu pedału. Mysz może drgać w tym procesie. Naciśnięcie pedału nożnego więcej niż raz może zwiększyć wydajność podawania, ale zbyt wiele impulsów elektrycznych może uszkodzić integralność tkankową nabłonka dróg moczowych.
   1. Unikaj kontaktu pęsety z elektrodami, ponieważ spowoduje to wytworzenie iskry.

3. Odzyskiwanie

1. Zszyj otwór brzuszny i skórny sterylnymi szwami chirurgicznymi i klipsami. Nałóż jod na ranę.
2. Usunąć zwierzę z układu izofluranu. Buprenorfinę należy podawać przeciwbólowo (0,1 mg/kg) podskórnie w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego.
3. Trzymaj zwierzę na poduszce grzewczej i po pełnym wyzdrowieniu włóż je z powrotem do klatki domowej. Sprawdzaj zwierzę co najmniej raz dziennie pod kątem normalnej mobilności, zachowań związanych z piciem i karmieniem oraz braku oznak infekcji do czasu zagojenia się nacięcia, a następnie usuń klipsy. Podawaj kolejne zastrzyki przeciwbólowego buprenorfiny, jeśli zwierzę wykazuje objawy bólowe, takie jak zmniejszona pielęgnacja, zwiększona agresywność i wokalizacja.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strzykawka BD 1 ml TB	rybak	Numer katalogowy: 148232E
Buprenorfina	Sigma	B9275-50MG
Pęseta Dumont	Roboz Chirurgiczny Instr	Złącze RS-5005	Leczyć 70% etanolem przed użyciem chirurgicznym
Elektroporator falowy ECM830 SQ	Aparatura Harvarda	450052
Exel International Jednorazowe cewniki dożylne Safelet	Fisher Naukowy	Numer katalogowy 14-841-21	24G, długość 2,11 cm, średnica zewnętrzna 0,045 cm
Bardzo cienkie mikro nożyczki preparacyjne	Roboz Chirurgiczny Instr	Złącze RS-5135	Leczyć 70% etanolem przed użyciem chirurgicznym
Izofluran	Weterynarz jeden	501017
K&H Podgrzewana mata spoczynkowa dla małych zwierząt, 9 na 12 cali	Amazonka		Przykryj matę grzewczą ręcznikami papierowymi
Maść okulistyczna	rybak	NC0849514
PBS, pH 7,4	Technologie życiowe	10010049
Końcówki do pipet 200 μL	USA Naukowe	Numer katalogowy: 1111-0206
Końcówki do pipet, uniwersalne dopasowanie; 0,1 do 10 μl	rybak	02707438(CS)
PIPETMAN NEO P2	Gilson	F144561
PIPETMAN NEO P200N	Gilson	F144565
plazmid CAG-GFP	Addgene powiedział:	Numer katalogowy: 16664
Pęseta platynowa 5 mm	Aparatura Harvarda	450489	Średnica 5 mm
nożyczki	Roboz Chirurgiczny Instr	Złącze RS-5880	Leczyć 70% etanolem przed użyciem chirurgicznym
Sznurek	Amazonka		Mandala Crafts 150D 210D 0,8mm 1mm skórzane szwy do szycia płaska woskowana nić sznurek
Taśma klejąca	rybak	19047257
Therio-gel Smar weterynaryjny	PBS Zdrowie zwierząt	353-736
Niebieska plama trypana	Technologie życiowe	15250061
V-1 Znieczulenie systemowe stołowe	Wyposażenie weterynaryjne	901806
Vicryl szew fioletowy 18" FS-2 cięcie 5-0	rybak	NC0578475
Walgreens Powidon Jod 10%	Walgreens powiedział:	953982
Klips do ran	rybak	Numer katalogowy: 18045
Aplikator do spinania ran	rybak	Rok 1804

sznurek