Przygotowanie płaskiego mocowania nerki: procedura preparowania i przygotowania płaskiego mocowania do analizy mikroskopowej nerki dorosłego danio pręgowanego

Streszczenie

Źródło: McCampbell, K. K. et al. Analiza składu i funkcji nefronu w nerce dorosłego danio pręgowanego.J. Vis. Exp. (2014)

Ten film pokazuje sekcję i przygotowanie płaskiego mocowania nerki dorosłego danio pręgowanego. Przygotowane płaskie mocowanie można zobrazować pod mikroskopem w celu analizy próbki.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Sekcja i płaskie przygotowanie nerki dorosłego danio pręgowanego z nieutrwalonej próbki zwierzęcej w celu wizualizacji fluorescencyjnego znakowania dekstranu w kanaliku proksymalnym

1. Dorosłego danio pręgowanego, któremu wstrzyknięto dekstran, należy poddać eutanazji, umieszczając go w naczyniu o 0,2% Tricaine pH 7,0 przez 4–5 minut
   nuta: Upewnij się, że ryba została poddana eutanazji przed kontynuowaniem, uważnie monitorując, czy skrzela przestały się poruszać, a serce przestało bić.
2. Za pomocą plastikowej łyżki wyjmij rybę z roztworu Trikainy, zdekantuj roztwór i połóż zwierzę na chusteczce lub ręczniku papierowym.
3. Użyj ostrych nożyczek do preparacji, aby wykonać cięcie za wieczkiem skrzelowym i usunąć głowę.
4. Natychmiast otwórz ciało ryby nożyczkami preparacyjnymi, wykonując długie brzuszne nacięcie od głowy do podstawy płetwy ogonowej.
5. Usuń narządy wewnętrzne ryby za pomocą cienkich kleszczy.
6. Użyj bardzo cienkich igieł do preparowania, aby rozciąć ściany ciała, aby umożliwić wizualizację narządu nerkowego, który przylega do ściany grzbietowej zwierzęcia.
7. Użyj cienkich kleszczy, aby odłączyć nerkę od ściany grzbietowej.
8. Delikatnie umieść nerkę w szklanej fiolce o pojemności 5 ml zawierającej 1X PBS i przemyj 3 razy 3-5 ml świeżego 1X PBS przez 5 minut każda.
   nuta: Użycie szklanej fiolki do manipulowania próbkami nerek dorosłych ułatwia wizualizację tkanki i pozwala na przemywanie dużymi objętościami (w stosunku do masy tkanki) wynoszącymi około 3–5 ml. Alternatywnie można użyć 12-dołkowego naczynia do hodowli komórkowych. Podczas gdy można użyć plastikowej probówki do mikrowirówki, probówki o standardowych rozmiarach (1,5 ml) mogą ograniczać mycie.
9. Wyjmij nerkę za pomocą pipety transferowej i umieść na czystym szklanym szkiełku z 1-2 kroplami 1X PBS.
10. Użyj cienkich kleszczyków, spłaszcz nerkę na szkiełku, upewniając się, że żadna tkanka nie zwinęła się lub w inny sposób nie przewróciła na siebie.
    nuta: Alternatywnie można użyć narzędzia z drutu wolframowego do wykonania małych nacięć w tkance łącznej, aby ułatwić spłaszczone ustawienie nerki.
11. Umieść małe kawałki plasteliny na każdym rogu szklanego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 18 x 18 mm i powoli umieść szkiełko nakrywkowe na nerce.
    nuta: Lekko pochyl szkiełko nakrywkowe podczas umieszczania, aby zminimalizować zatrzymywanie pęcherzyków powietrza w roztworze. Wgłębienia z plasteliny mają średnicę około 2 mm (ryc. 1A). Alternatywnie, zamiast plasteliny można zastąpić wgłębienia smaru próżniowego. Dodaj dodatkową kroplę 1X PBS, aby w razie potrzeby wypełnić przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem podstawowym.
12. Obserwuj i/lub zobrazuj nerkę, umieszczając szkiełko w polu view na mikroskopie stereoskopowym lub mikroskopie złożonym z odpowiednim filtrem.

Wyniki

Rycina 1. Przygotowanie i zastosowanie płaskiego mocowania nerki dorosłego danio pręgowanego w celu wizualizacji sprzężonego wychwytu dekstranu w segmencie PCT nefronów nerkowych. orazObraz w jasnym polu preparatu do płaskiego mocowania próbki nerki, w którym narząd został umieszczony płasko na szkiełku podstawowym, z szkiełkiem nakrywkowym umieszczonym na wierzchu tkanki, która spoczywa na czterech...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1X PBS			Wytwarzany przez rozcieńczenie 10 X PBS w wodzie destylowanej.
Cienkie kleszcze	Roboz powiedział:	Złącze RS-1050	Pęseta Dumont wzór #55
Zjeżdżalnia szklana	Rybak termiczny	Numer katalogowy: 4445	Biały Mróz
Szkiełko nakrywkowe szklane	Rybak termiczny	12-540A	Wymiary: 18 x 18 mm
Plastelina	Firma Hasbro	Playdoh	Inne plasteliny można zastąpić i działać podobnie.
Uchwyt na suwak	Rybak termiczny	12-587	Opcjonalnie: taca kartonowa do przechowywania szkiełek na płasko.
Mikroskop stereoskopowy	Nikon	Zobacz materiał SMZ645; SMZ1000; 83455 P-niebieski GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/ FITC; 83457 P-TRITC	Zastosowany zestaw filtrów był następujący: Filtr Hoechst/DAPI służył do wykrywania DAPI, jodku propidyny, błękitu kaskadowego dekstranu i fosfatazy alkalicznej. Filtr GFP/FITC zastosowano do wykrywania dekstranu-FITC, żółcieni lucyfera dekstranu i antyGFP. Filtr TRITC został użyty do wykrywania dektran-fluoro-rubinu, PI i DBA.
Mikroskop złożony	Nikon	96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Teksańska czerwień	Zastosowany zestaw filtrów był następujący: Filtr Hoechst/DAPI służył do wykrywania DAPI, jodku propidyny, błękitu kaskadowego dekstranu i fosfatazy alkalicznej. Filtr GFP/FITC zastosowano do wykrywania dekstranu-FITC, żółcieni lucyfera dekstranu i antyGFP. Filtr Texas Red został użyty do wykrywania dekstrano-fluororubinu, PI i DBA.