$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie jednostek stereotaktycznych do operacji
- Włącz wszystkie aparaty anestezjologiczne, cyfrowe wagi noniuszowe i cyfrowe wtryskiwacze.
nuta: Wszystkie narzędzia chirurgiczne powinny być odpowiednio oczyszczone i wysterylizowane przed zabiegiem.
- Używaj aparatów anestezjologicznych z nasadką do komory indukcyjnej w komorze bezpieczeństwa biologicznego (rysunek 1A).
- Upewnij się, że wszystkie rurki z aparatów anestezjologicznych są podłączone do ramek stereotaktycznych (Rysunek 1B, wstawka 1C) i zaciski na rurkach są otwarte dla wszystkich używanych jednostek. Zamknij wszystkie zaciski na rurkach prowadzących do ram stereotaktycznych, które nie będą używane do operacji.
- Ustaw aparaty anestezjologiczne zgodnie z zalecanym przez producenta natężeniem przepływu stożka nosowego w oparciu o wagę myszy (np. 25 g masy zwierzęcia: natężenie przepływu stożka nosowego 34 ml/min).
nuta: Uchwyt na głowę dołączony do tej konfiguracji stereotaktycznej jest zalecany tylko dla dorosłych myszy. Upewnij się, że przestrzegane są zalecenia producenta dołączone do konfiguracji stereotaktycznej.
- Upewnij się, że odpowiedni środek znieczulający (np. izofluran) wstępnie napełniony strzykawką jest podłączony do aparatu do znieczulania (Rysunek 1B).
nuta: Nadmierne zalanie strzykawki może spowodować dostarczenie myszom zbyt dużej ilości znieczulenia podczas operacji i spowodować przedawkowanie środka znieczulającego.
- Przygotuj wiertła, przekręcając blokadę sceny, wkładając adapter wiertła i wiertło 1 mm do każdego wiertła i zablokuj wiertło, ręcznie dokręcając blokadę bitu.
- Przymocuj wiertła do ram stereotaktycznych (Rysunek 1C).
2. Umieść myszy na ramkach stereotaktycznych
- Znieczulenie myszy (np. izofluranem) za pomocą wspomnianej komory indukcyjnej.
- Utrzymuj myszy przez cały zabieg w głębokiej płaszczyźnie znieczulenia. % znieczulenia podawanego przez maszynę zależy od wielu czynników, w tym: natężenia przepływu, stopnia stymulacji i temperatury ciała. Często monitoruj myszy przez cały czas trwania procedury pod kątem głębokości znieczulenia, oceniając rytmiczne oddychanie (zwierzę nie sapie); brak odruchu powiekowego (trzepotanie powiek po stymulacji aplikatorem z bawełnianą końcówką); i brak szczypania palców u nóg (wycofanie kończyny pod wpływem szkodliwego bodźca w postaci szczypania palców).
nuta: Różne szczepy myszy będą miały różną reakcję na znieczulenie.
- Po tym, jak myszy znajdą się w odpowiedniej, głębokiej płaszczyźnie znieczulenia, przenieś myszy do jednostki stereotaktycznej. Użyj poduszki grzewczej, gdy mysz jest włączona do urządzenia stereotaktycznego, aby utrzymać temperaturę ciała i odpowiednią płaszczyznę znieczulania.
nuta: Aby uzyskać niski profil, używamy aktywowanych powietrzem ogrzewaczy do rąk umieszczonych w odwróconym pudełku z końcówkami do pipet (pudełko podnoszące mysz na rysunku 1D).
- Otwórz usta myszy i umieść zęby w korycie paska ustnego znajdującego się na nosku na ramie stereotaktycznej (rysunek 2A). Przesuń stożek nosa po nosie/ustach myszy (Rysunek 2B).
- Umieść myszy z głowami na poziomie paska gębowego. Delikatnie otwórz usta końcem aplikatora z bawełnianą końcówką i wsuń na miejsce. Upewnij się, że stożek nosowy znajduje się całkowicie nad nosem myszy, w przeciwnym razie znieczulenie nie zostanie dostarczone prawidłowo. Stożek nosowy nie będzie się zazębiał z nosem, jeśli zęby nie będą osadzone w tym rowku (wstawka Rysunek 2A).
- Za pomocą sterylnego bawełnianego wacika nałóż lubrykant do oczu na każde oko myszy. Stosowanie lubrykantu do oczu łagodzi wysuszenie rogówki i zmniejsza ryzyko uszkodzenia rogówki oraz powikłań pooperacyjnych związanych z urazem rogówki.
- Ustabilizuj czaszkę myszy, dociskając lewą listwę uszną do przyśrodkowej kantu lewego ucha, blokując ją na miejscu za pomocą na ramce stereotaktycznej. Następnie dosuń prawą listwę douszną do kantu przyśrodkowego prawego ucha i mocno przykręć ramkę stereotaktyczną (Rysunek 2B).
nuta: Upewnij się, że głowa myszy jest wypoziomowana i prosta podczas umieszczania nauszników. Jeśli głowa jest krzywa lub pochylona, wstrzyknięcie zostanie wykonane w niewłaściwym miejscu w mózgu. Pręty uszne powinny być zaciskane TYLKO do momentu unieruchomienia czaszki po stymulacji umiarkowanym sondowaniem ręcznym.
3. Zrób okno kalwaryczne
- Przygotuj i oczyść skórę głowy za pomocą 3 naprzemiennych przejść z roztworem betadyny i 70% etanolu. Ze względu na bliskie sąsiedztwo pola operacyjnego względem oczu, roztwór betadyny należy zastosować na peeling chirurgiczny.
- Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj 3-milimetrowe nacięcie przez skórę wzdłuż środkowej środkowej części czaszki (wzdłuż linii szwu strzałkowego). Krwawienie w miejscu nacięcia powinno być minimalne. W takim przypadku należy równomiernie, mocno uciskać miejsce krwawienia sterylnym aplikatorem z bawełnianą końcówką przez >30 sekund.
- Zidentyfikuj i ustaw wiertło prostopadle do bregmy (Rysunek 2C), upewniając się, że cyfrowa skala noniusza została zresetowana do zera.
- Przesunąć wiertło 2 mm w bok do szwu strzałkowego i 1 mm do przodu do szwu koronalnego (ryc. 2C). Aby zapewnić powtarzalność, upewnij się, że lokalizacja po lewej lub prawej stronie linii szwu strzałkowego pozostaje spójna dla wszystkich zwierząt.
- Obróć wiertło na najwyższą prędkość. Upewnij się, że skóra jest odsunięta od wiertła, aby uniknąć uszkodzenia tkanek spowodowanego przez obracające się wiertło i ostrożnie zainicjuj wiertło na czaszce. Wywierć otwór o głębokości około 0,5 mm w kalwarii, co spowoduje powstanie okna kalwaryjnego. Uważaj, aby nie opuścić wiertła zbyt daleko, ponieważ wwierci się ono w mózg. Upuszczenie sterylnego roztworu soli fizjologicznej w miejscu wiercenia, gdy wiertło jest w ruchu, może zrównoważyć ciepło wytwarzane przez maszynę, które może spowodować uszkodzenie termiczne otaczającej tkanki.
- Po wykonaniu okna kalwarycznego ostrożnie podnieś wiertło i wyjmij je z ramy stereotaktycznej.
- Oczyść wiertła przy użyciu 70% etanolu i odłóż na bok, jeśli są ponownie używane. Jeśli nie, wyjmij wiertła i zanurz w 70% etanolu.
