Test fagocytozy mikrogleju: test in vitro w celu ustalenia modelu fagocytozy mikrogleju dla komórek nerwiaka zarodkowego przy użyciu makrofagów iPSC

Streszczenie

Źródło: Hall-Roberts, H. et al. Ilościowy test obrazowania in vitro na fagocytozę martwych komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC. J. Vis. Exp. (2021)

W tym filmie przeprowadzamy test fagocytozy mikrogleju na nerwiaka zarodkowego przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Test pomaga ocenić upośledzenie funkcji mikrogleju w chorobach neurodegeneracyjnych.

Protokół

1. Oznaczanie martwych SH-SY5Ys wrażliwym na pH czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym

1. Zacznij od utrwalonych komórek SH-SY5Y zawieszonych w pożywkach buforowanych HEPES wolnych od czerwieni fenolowej. Policz komórki i usuń całkowitą liczbę wymaganych komórek do probówki o niskiej zawartości białka o pojemności 2 ml. Na każdy 1 milion SH-SY5Ys uzupełnij całkowitą objętość w probówce o pojemności 2 ml do 300–500 μl za pomocą pożywki buforowanej HEPES, bez czerwieni fenolowej. Podgrzać krótko rurkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
2. Rozpuść wrażliwy na pH ester STP czerwonego barwnika fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów) i dodaj 12,5 μg barwnika na milion SH-SY5Y do ciepłej probówki z komórkami o pojemności 2 ml. Delikatnie wymieszać, pipetując. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, chroniąc przed światłem.
   nuta: Gatunki estrów STP barwnika wrażliwego na pH reagują z aminami pierwszorzędowymi, w związku z czym bufor do znakowania nie może zawierać wolnych amin. Ze względu na potencjalnie ograniczoną rozpuszczalność w wodnych, barwnik rozpuszczony w DMSO należy dodać tylko w celu ogrzania buforu wodnego, natychmiast wymieszać i sprawdzić, czy pod mikroskopem świetlnym nie ma śladów osadu (ciemne cząstki).
3. Dodać 1 ml HBSS i odwirować przy 1200 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i przemyć 2 ml HBSS. Powtórzyć wirowanie.
4. Odrzuć supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce makrofagowej wolnej od czerwieni fenolowej (patrz tabela materiałów) do stężenia 200 000–1,2 miliona komórek/ml, tak aby 50 μl to 10 000–60 000 komórek (tj. 0,5–3 razy więcej SH-SY5Y niż makrofagi iPSC).
   nuta: Czerwień fenolowa w pożywce zwiększa fluorescencję tła, dlatego do obrazowania żywych komórek należy stosować pożywkę wolną od czerwieni fenolowej. Nie zaleca się przechowywania poplamionego SH-SY5Ys dłużej niż kilka godzin, ponieważ nie zostało to ocenione. Przechowywać poplamione SH-SY5Y na lodzie i chronić przed światłem.

2. Barwienie makrofagów iPSC

1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego przygotować roztwór w pożywce makrofagowej głęboko czerwono-fluorescencyjnego, przenikającego komórki, reagującego z estrami sukcynimidylu (patrz tabela materiałów). Dodać Hoechst 33342 (patrz tabela materiałów). Podgrzać roztwór roboczy do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
2. Delikatnie odessać pożywkę makrofagową iPSC, pipetując supernatant komórkowy za pomocą pipety wielokanałowej do sterylnego zbiornika. Dodać 70 μl/studzienkę roztworu barwnika przygotowanego w kroku 2.1 do makrofagów iPSC, używając pipety wielokanałowej. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
3. Przygotowanie eksperymentalnych zabiegów w pożywkach makrofagowych wolnych od czerwieni fenolowej. Włączyć 10 μM cytochalazynę D jako środek kontroli ujemnej. Po inkubacji bardzo delikatnie odessać pożywkę makrofagową iPSC za pomocą wielokanałowej pipety i dodać 100 μl/studzienkę buforowanego roztworu soli Hanka (HBSS) do przemycia. Natychmiast usunąć HBSS za pomocą delikatnego pipetowania, a następnie dodać 100 μl pożywki ± związków. Inkubować przez 10 minut–1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO₂,
   nuta: Cytochalazyna D jest silnym inhibitorem aktyny i blokuje fagocytozę. W przypadku wszelkich zabiegów eksperymentalnych, które wymagają dłuższej inkubacji, np. 24–72 godzin, należy przeprowadzić zabieg eksperymentalny przed etapem 2.1, stosując 100 μl/studzienkę leczenia w pełnych pożywkach makrofagowych. Postępuj zgodnie z krokami 2.1–2.3 zgodnie z protokołem, aby przeprowadzić barwienie komórek, a następnie ponownie zastosować leczenie w pożywce makrofagów wolnych od czerwieni fenolowej przez pozostałą część testu fagocytozy.

3. Obrazowanie Fagocytozy

1. Obrazowanie o wysokiej zawartości w komórkach stacjonarnych
   1. Użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 50 μl oznaczonego SH-SY5Ys na dołek, dodając z boku każdej studzienki na krawędzi cieczy. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 3-5 godzin.
   2. Po inkubacji fagocytozy delikatnie odessać supernatanty komórkowe przez pipetowanie pipetą wielokanałową i wyrzucić. Przemyć raz 100 μl PBS.
   3. Utrwalić płytkę przez dodanie 100 μl 2% paraformaldehydu i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Odessać studzienki i dodać 100 μl PBS. Przykryj zgrzewarką do płyt i folią; przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będzie to wymagane.
      nuta: Płytka testowa może być przechowywana w ten sposób przez co najmniej tydzień bez znaczącej degradacji sygnału; Dłuższe przechowywanie nie zostało przetestowane.
   5. Włącz mikroskop obrazowy o wysokiej zawartości (patrz tabela materiałów) i otwórz oprogramowanie do przechwytywania obrazu. Załaduj płytkę testową do mikroskopu, klikając ikonę Załaduj u góry ekranu.
   6. Wybierz kartę Ustawienia. W menu rozwijanych w lewym górnym polu: wybierz odpowiedni typ płyty, wybierz opcję autofokusa Dwa szczyty (domyślnie), wybierz obiektyw 40x Woda, NA1.1, wybierz Tryb konfokalny i wybierz binning 1.
   7. Przed użyciem przepłucz obiektyw wodny 40x za pomocą menu Ustawienia.
   8. W polu Wybór kanału użyj ikony +, aby dodać kanały DAPI, Alexa 647 i Alexa 568. Ustaw je tak, aby mierzyły w jednej płaszczyźnie 1 μm. Zoptymalizuj ustawienia czasu i mocy, aby uzyskać skuteczność barwienia płytki testowej.
      nuta: Jako wskazówkę ustaw DAPI na 200 ms ekspozycji i 100% mocy, Alexa 647 na 1500 ms ekspozycji i 100% mocy, a Alexa 568 na 100 ms ekspozycji i 40% mocy.
   9. Upewnij się, że kanały nie są mierzone jednocześnie, klikając Sekwencja kanałów, aby oddzielić kanały.
   10. W obszarze Nawigacja | Zdefiniuj układ, wybierz dołki pomiaru i wybierz 9–12 pól na dołek.
   11. Podczas konfiguracji kliknij reprezentatywne pole na mapie płyty i sprawdź po kolei każdy kanał pomiarowy, aby upewnić się, że barwienie jest obecne i że obrazy są ostre, dostosowując przesunięcie kanału.
   12. Aby dane zostały przesłane na serwer w celu zdalnej analizy, należy kliknąć na pole Oferty pracy online i odpowiednią nazwę ekranową; umożliwi to automatyczne przesyłanie danych na serwer po zobrazowaniu.
   13. Zapisz protokół testu, klikając przycisk Zapisz.
   14. Kliknij kartę Uruchom eksperyment u góry i nazwij tabliczkę eksperymentu, a następnie kliknij Start.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Stożkowa probówka wirówkowa 15 ml	sokół	352096	Do wirowania komórek
Mikropipety jednokanałowe 2-20 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL
4% paraformaldehydu w PBS	Alfa Aesar	Zobacz materiał J61899	Do utrwalania komórek
Płytka 6-dołkowa, poddana działaniu kultur tkankowych
Płytka 24-dołkowa AggreWell-800	Technologie STEMCELL	Numer katalogowy: 34815	24-dołkowa płytka mikrodołkowa o niskiej przyczepności do tworzenia ciał zarodkowych
Automatyczny licznik komórek
Wirówka stołowa
Mikrowirówka stołowa
CellCarrier-96 Ultra Microplates, poddane hodowli tkankowej, czarne, 96-dołkowe z pokrywką	Perkin Elmer	6055302	Mikropłytka poddana 96-dołkowej hodowli tkankowej (TC) z czarnymi ściankami dołka i optycznie przezroczystym dnem do oznaczania fagocytozy
Oprogramowanie CellProfiler			Oprogramowanie typu open source do analizy obrazów fagocytozy uzyskanych za pomocą mikroskopu poklatkowego żywych komórek. Pobierz za darmo ze strony internetowej (http://cellprofiler.org/), protokół ten korzystał z wersji 2.2.0.
Barwnik CellTracker Deep Red	Rybak termiczny	Zobacz materiał C34565	Głęboko czerwono-fluorescencyjny, przepuszczalny dla komórek, reaktywny barwnik estrowo-reaktywny sukcynimidylu do barwienia cytoplazmy makrofagów iPS. Rozpuść barwnik CellTracker Deep Red w DMSO do 2 mM (1,4 mg/ml). Stosować w temperaturze 1 μM, rozcieńczając materiał podstawowy DMSO pożywkami makrofagowymi.
Komora bezpieczeństwa laminarnego przepływu powietrza klasy 2
Butla z gazem CO2			Akcesorium do EVOS FL Auto
Inkubator CO2 ustawiony na 37°C i 5% CO2
Cytochalazyna D	Cayman	Numer katalogowy: 11330	Leczenie kontrolą ujemną w teście fagocytozy. Rozpuścić w DMSO do 10 mM i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20°C, unikając dalszych cykli zamrażania i rozmrażania. Stosować przy końcowym stężeniu 10 μM.
DMEM/F12	Gibco (firma Gibco)	11320074	Składnik pożywki SH-SY5Y
Dmso	Sigma	Zobacz materiał D8418	Rozpuszczalnik do barwników CellTracker i pHrodo
Surowica bydlęca płodu	Sigma	Zobacz materiał F4135	Składnik pożywki SH-SY5Y
Geltrex LDEV, zakwalifikowany przez hESC, matryca błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu	Invitrogen	A1413302	Matryca błony podstawnej z kwalifikacją hESC do hodowli iPSC
Suplement GlutaMAX	Gibco (firma Gibco)	Nr kat. 35050-038	Składnik pożywek zarówno fabrycznych, jak i makrofagowych
HBSS (Sieć HBSS)	Lonza	BĄDŹ 10-547F	Zbilansowany roztwór soli Hanka do etapów prania
Ludzka rekombinowana IL-3	Gibco (firma Gibco)	PHC0033	Składnik pożywek zarówno fabrycznych, jak i makrofagowych
Rozwiązanie do obrazowania żywych komórek	Rybak termiczny	A14291DJ	Bezczerwone podłoża buforowane przez HEPES bez czerwieni fenolowej do oznaczania martwych SH-SY5Ys
Niskie wiązanie z białkami 2 ml probówki	Eppendorf	Numer katalogowy: 30108.132	Do barwienia SH-SY5Ys
M-CSF (Płyn mózgowy)	Rybak termiczny	PHC9501	Składnik pożywek zarówno fabrycznych, jak i makrofagowych
mTeSR1 Średni	Technologie STEMCELL	Numer katalogowy: 85850	Nośniki iPSC
Wielokanałowa pipeta 20-200 μl			Do pracy z cieczami na płytce 96-dołkowej
Odczynnik NucBlue Live ReadyProbes	Rybak termiczny	Czynnik R37605	Preparat Hoechst 33342 w butelce z zakraplaczem do barwienia jąder makrofagów iPS, stosować 0,5 kropli/ml w pożywce makrofagowej.
System badań przesiewowych o wysokiej zawartości Opera Phenix	Perkin Elmer	HH14000000	Mikroskop obrazowy o wysokiej zawartości, używany z oprogramowaniem Harmony w wersji 4.9.
Penicylina-Streptomycyna	Gibco (firma Gibco)	Rozdział 15140-122	Składnik pożywki fabrycznej, makrofagowej i SH-SY5Y
pHrodo iFL Czerwony STP-Ester	Rybak termiczny	Zobacz materiał P36011	Czerwony barwnik fluorescencyjny wrażliwy na pH do oznaczania martwych SH-SY5Y. Rozpuść proszek estru pHrodo iFL Red STP w DMSO do stężenia 5 mg/ml. Na każdy 1 milion SH-SY5Ys dodaj 2,5 μl (12,5 μg) pHrodo iFL Red STP Ester do wstępnie ogrzanych komórek zawieszonych w roztworze do obrazowania żywych komórek.
Serologiczny napełniacz do pipet
Kolba T175, poddana obróbce kultur tkankowych			Naczynie do różnicowania prekursorów iPSC-makrofagów, znane jako "fabryki"
Kolba T75			Naczynie do hodowli SH-SY5Y
Przezroczyste zgrzewarki do płyt	Greiner Bio-One	676001	Do przechowywania i transportu płytek testowych
Łaźnia wodna, ustawiona na 37°C
X-VIVO 15 Medium z L-glutaminą, gentamycyną i czerwienią fenolową	Lonza	BE04-418F	Składnik pożywek fabrycznych i makrofagowych
X-VIVO 15 Medium z L-glutaminą; bez gentamycyny i czerwieni fenolowej	Lonza	04-744Q	Pożywki makrofagowe wolne od czerwieni fenolowej, do stosowania w fagocytozie bez dodatków i czynników wzrostu

powiedział: powiedział: