Test przepuszczalności naśladującej barierę krew-mózg: Test in vitro do oceny przepuszczalności naśladownictwa BBB dla cząsteczek znacznikowych

Streszczenie

Źródło: Le Joncour, V. et al. Przewidywanie dostarczania ładunków in vivo przy użyciu bariery nowotworowej krew-mózg w naczyniu. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film opisuje test przepuszczalności do oceny przepuszczalności bariery krew-mózg in vitro przy użyciu cząsteczek fluoresceiny sodu.

Protokół

1. Pomiar przepuszczalności BBTB Mimic
   

   1. Bierna dyfuzja drobnocząsteczkowego barwnika fluorescencyjnego fluoresceiny sodowej (Na-Fl) w czasie od strony krwi do strony mózgu wkładek pozwala na obliczenie wartości przepuszczalności według następującego wzoru:
      Tutaj dFwell to wartość fluorescencji zmierzona w studzience w określonym punkcie czasowym pomniejszona o wartość autofluorescencji pożywki do hodowli komórkowej, dT to czas w sekundach, A to powierzchnia bariery w centymetrach kwadratowych, a dFinsert to wartość fluorescencji zmierzona we wkładzie w tym samym punkcie czasowym pomniejszona o wartość autofluorescencji pożywki).
   2. Zebrać 100 μl pożywki zarówno z krwi, jak i strony mózgu naśladowcy BBTB i przenieść każdą z nich na oddzielną, czarną 96-dołkową płytkę z płaskim dnem w celu kolejnych pomiarów fluorescencji. Użyj zwykłego podłoża jako ślepego miejsca, aby skorygować autofluorescencję.
   3. Przygotować 2,5 ml na studzienkę Na-Fl (50 μM) w EBM-. Podgrzej roztwór Na-Fl do temperatury 37 °C. Zastąp pożywkę od strony krwi wkładki pożywką zawierającą Na-Fl. Uruchom timer, gdy tylko nośnik zostanie wymieniony.
   4. Ostrożnie zebrać 100 μl pożywki zarówno od strony krwi, jak i od strony mózgu wkładek po 5, 30, 60 i 120 minutach. Przenieść każdą próbkę do oddzielnych dołków czarnej 96-dołkowej płytki.
   5. W związku z tym należy wymienić zebrane media z wkładek, aby zachować równowagę objętości między obiema stronami. Umieść wkładki z powrotem w inkubatorze między każdym pobraniem próbki, aby zminimalizować wahania temperatury.
   6. Określić ilościowo fluorescencję pobranych próbek za pomocą czytnika płytek z filtrem ustawionym na 480/560 nm (odpowiednio wzbudzenie i emisja).
      nuta: Fluorescencja od strony mózgu jest prawie niewykrywalna w 5-minutowym punkcie czasowym. Wysokie wartości w porównaniu z ślepą próbą wskazują na nieszczelność/uszkodzenie membrany wkładu lub bariery; W związku z tym należy wykluczyć je z dalszych analiz. Oczekiwane wartości przepuszczalności Na-Fl dla BBTB powinny mieścić się w zakresie od 10–5 do 10–6 cm/s (tabela 1).

Tabela 1: Wartości przepuszczalności fluoresceiny sodowej (Na-Fl) (w centymetrach na sekundę) wyznaczone in vitro we wskazanych systemach kohodowli oraz in vivo u nagich myszy NMRI. Dane z reprezentatywnego eksperymentu (n = 3 myszy).

powiedział: pkt. pkt. pkt. roku pkt. pkt. pkt. pkt.

Mysi naśladowca BBTB	bEND3	bEND3+HIFko As	bEND3+GB	bEND3+HIFko As+GB	In vivo (in vivo)
Przepuszczalność (10–6 cm/s)	Godzina 27,63	6,74	26,8	Godzina 10,83	Klasa 5,57
SD (10–6 cm/s)	Godzina 3,45	Pytanie 3,01	7,99	Godzina 2,65	Informacja o tym, że 2,19
Ludzki naśladowca BBTB	HuAR2T	HuAR2T+hIAs	HuAR2T+GB	HuAR2T+hIAs+GB
Przepuszczalność (10–6 cm/s)	104,92	47,4	89,08	Z dnia 48,24
SD (10–6 cm/s)	Z dnia 27,1 ust. 27	godz. 14.32	Godzina 10.21	Godzina 13.07

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materiał i odczynnik
10 ml pipety serologicznej	ThermoFisher Naukowy	170361
ABM Pożywka podstawowa, 500 ml	Lonza	Zobacz materiał CC-3187	Dla pierwotnych astrocytów ludzkich. ABM+: zawiera wszystkie dodatki z mieszanki suplementów. ABM -: wszystkie dodatki z wyjątkiem rhEGF i FBS
Podstawowy średni orzeł	ThermoFisher Naukowy	21010046	Zobacz materiał BME-1
Zmodyfikowana szynka Eagle's Medium/Nutrient F-12 firmy Dulbecco	Gibco (firma Gibco)	21331-020	Specyficzne dla hodowli sferek pochodzących od pacjenta wyizolowanych w naszym laboratorium, mogą się różnić dla innych linii komórkowych glejaka
Greiner CELLSTAR 96-dołkowe płytki S	Sigma-Aldrich	Greiner 655090	Czarne studzienki styropianowe z płaskim dnem (z dnem mikroprzezroczystym)
Sól sodowa fluoresceiny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał F6377
Czytnik mikropłytek FLUOstar Omega	BMG Labtech
Komórek
bEND3	Kontroler ATCC (Kontroler T	CRL-2299	Hodowane w: DMEM (1g/L glukozy) uzupełnionym 10% FBS, 5 ml L-glutaminy i 5 ml penicyliny/streptomycyny
HIFko unieśmiertelnione astrocyty myszy	Izolowany w laboratorium dr Gabriele Bergers	https://doi.org/10.1016/ S1535-6108(03)00194-6	Hodowane w: BME-1 uzupełnione 5% FBS, 5 ml 1 M HEPES, 5 ml 100 mM pirogronianu sodu, 3 g D-glukozy i 5 ml penicyliny/streptomycyny
HuAR2T	Odizolowany w laboratorium dr Dagmar Wirth	https://doi.org/10.1089/ dziesięć.herbata.2009.0184	Hodowane w: EBM-2 z SupplementMix
Normalne ludzkie astrocyty pierwotne	Lonza	CC-2565	Hodowane w: ABM z SingleQuots

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: