Pobieranie bloku krążeniowo-oddechowego od królika: procedura chirurgiczna mająca na celu odzyskanie funkcjonalnego bloku płuco-serce z modelu królika

Streszczenie

Źródło: Pacheco-Baltazar, A., et al. Izolowany system perfuzji płuc w modelu królika. J. Vis. Exp. (2021)

W tym filmie pokazujemy procedurę chirurgicznego pobrania funkcjonalnego bloku krążeniowo-oddechowego od modelu królika. Pobrany blok może być wykorzystany do dalszych badań fizjologicznych, farmakologicznych lub biochemicznych.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Wyposażenie i przygotowanie aparatury.

1. Rozmieszczenie sprzętu:
   1. Ustaw stół operacyjny z rozmiarem dostosowanym do wagi królika.
   2. Zamontuj osłonę sztucznej klatki piersiowej na stalowej kolumnie z szklaną komorą pod spodem i respiratorem z pompką rolkową po bokach.
   3. Upewnij się, że osłona jest łatwo nachylona, aby kaniula tchawicy znajdowała się w jednej linii z tchawicą, aby umożliwić szybsze połączenie.
2. Sztuczna klatka piersiowa:
   UWAGA: Jest to istotna część systemu. Składa się ze szklanej komory z płaszczem wodnym uszczelnionej specjalną pokrywą. Osłona pełni funkcję uchwytu narządu z połączeniami do kaniulacji tchawicy i osadzonych w niej naczyń.
   1. Ustaw dyszę Venturiego napędzaną sprężonym powietrzem, aby wytworzyć podciśnienie wewnątrz sztucznej klatki piersiowej.
      nuta: Moduł sterujący wentylacją (VCM) umożliwia oddzielną regulację ciśnienia wdechowego i końcowego wydechu, a także częstości oddechów i stosunku czasu trwania wdechu do całkowitego czasu trwania cyklu.
3. aparat:
   1. Upewnij się, że normalnie pracujące urządzenie składa się z głównej stalowej kolumny zamontowanej na płycie podstawy podtrzymującej sztuczną klatkę piersiową, z pneumotachometrem i przetwornikiem masy umieszczonymi nad nią i za cewką podgrzewającą z pułapką pęcherzykową.
   2. Podłącz jeden przetwornik różnicy ciśnień do pneumotachometru, a drugi do ciśnienia w komorze. Ustaw inną parę przetworników ciśnienia za klatką piersiową, aby zmierzyć ciśnienie perfuzyjne i żylne.
   3. Podłącz zapas wymienny poniżej natleniacza z elektrodą poziomu i systemem wentylacji obok aparatu.

2. Chirurgiczne usunięcie bloku krążeniowo-oddechowego.

1. znieczulenie:
   1. Stosować kombinację środka uspokajającego (ksylazyna) i barbituranu (pentobarbitalu).
      nuta: Można stosować różne koktajle znieczulające bez wpływu na wyniki eksperymentów.
   2. Najpierw uspokój zdrowe króliki nowozelandzkie pojedynczym wstrzyknięciem domięśniowym chlorowodorku ksylazyny (3-5 mg / kg). Należy upewnić się, że króliki pozostają spokojne i zrelaksowane, aby umożliwić dalszą manipulację po kilku minutach od wstrzyknięcia.
   3. Po sedacji należy użyć żył usznych brzeżnych (bocznych) jako dostępu do znieczulenia królików za pomocą dożylnego wstrzyknięcia pentobarbitalu sodu (28 mg/kg).
2. monitoring:
   1. Aby uniknąć niewystarczającego znieczulenia lub nadmiernego obniżenia funkcji serca i układu oddechowego, należy monitorować następujące parametry. Aby ocenić głębokość znieczulenia, wykonaj test szczypania palców u stóp.
   2. Upewnij się, że błona śluzowa jest różowa. Niebieskie lub szare odcienie wskazują na niedotlenienie.
   3. Upewnij się, że tętno wynosi 120-135 uderzeń/min, a temperatura ciała nie spada poniżej 36,5 °C.
3. Rozmieszczenie zwierząt:
   1. Ogolić tułów królika i ułożyć zwierzę na stole operacyjnym w pozycji leżącej. Umieść system wentylacji w pobliżu stołu, za głową królika, aby umożliwić szybkie podłączenie kaniul po tracheotomii, aby uniknąć uszkodzenia mięśnia.
4. Nacięcie i tracheotomia:
   1. Wypreparuj skórę z brzusznym nacięciem linii środkowej o długości 3-5 cm od przepony do szyi.
   2. Za pomocą nożyczek operacyjnych przeciąć przednią 2/3 tchawicy między dwoma pierścieniami chrząstki, aby wprowadzić kaniulę tchawicy przez błonę włóknistą tchawicy.
   3. Wstawić 5 mm (średnica zewnętrzna; OD) kaniulę tchawicy przez błonę włóknistą tchawicy i użyj jedwabnego szwu 4-0, aby ją ostrożnie zamocować.
   4. Umieść kleszcze lub pęsetę pod tchawicą, aby upewnić się, że kaniula nie zgina się na tchawicy.
5. Wentylacja nadciśnieniowa:
   1. Dopóki płuca pozostają poza sztuczną klatką piersiową, należy użyć pompy oddechowej dla małych gatunków, aby przewietrzyć nadciśnienie, aby uniknąć zapadnięcia się płuc podczas operacji.
   2. Wentylację należy rozpocząć przez kaniulę tchawicy podłączoną do pompy oddechowej szybko po tracheotomii, a przed otwarciem klatki piersiowej.
   3. Ustaw objętość oddechową na 10 ml/kg.
      nuta: W zależności od konfiguracji eksperymentu i modelu sztucznej klatki piersiowej, należy zapewnić wentylację dodatnim ciśnieniem za pomocą tej samej pompy wentylacyjnej, która służy do dostarczania podciśnienia lub innej, co zapewnia szybką ponowną kannulację.
6. Torakotomia i wykrwawienie:
   1. Aby uzyskać dostęp do jamy klatki piersiowej, użyj skalpela lub nożyczek, aby otworzyć ścianę klatki piersiowej i wykonać sternotomię przyśrodkową do górnej jednej trzeciej klatki piersiowej.
   2. Przytrzymaj połówki klatki piersiowej otwarte za pomocą dwóch zwijaczy. Kilka płatów płucnych zwykle otacza serce.
   3. Zlokalizuj żyłę główną górną i dolną i skieruj je za pomocą gwintów.
   4. Przed wykrwawieniem zwierzęcia należy zidentyfikować prawą komorę i wstrzyknąć 1000 UI/kg heparyny.
   5. Bezpośrednio po wstrzyknięciu należy podwiązać żyłę główną górną i dolną za pomocą wstępnie zapętlonej nici i wykonać wykrwawienie.
7. Zbiór płuc sercowych:
   1. Zbierz blok krążeniowo-oddechowy delikatnie i szybko. Użyj bezpośredniego dysekcji cyfrowej lub nożyczek sprężynowych, aby oddzielić tkankę łączną, aby usunąć płuca z klatki piersiowej.
   2. Przeanalizuj naczynia krwionośne w okolicy, a także przełyk.
   3. Przeciąć manubrium mostek, aby przedłużyć sternotomię przyśrodkową w kierunku kaniuli tchawicy, uwalniając tchawicę po obu stronach z tkanki łączącej.
   4. Teraz wytnij tchawicę powyżej kaniuli tchawicy. Delikatnie pociągnij kaniulę do góry w osi czaszkowo-ogonowej, gdy grzbietowe unieruchomienie tchawicy i płuc jest wycinane.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rurka Tygon E-Lab 2-Stop, średnica wewnętrzna 3.17 mm, 12 sztuk w opakowaniu,/Biały	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1864
Adapter do wentylacji nadciśnieniowej w IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4312
Alternatywne bezciśnieniowe zasilanie gazem dla IPL-4: Do zasilania tchawicy mieszanką gazów inną niż powietrze w pomieszczeniu podczas wentylacji ujemnej	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-4309
Jednostka podstawowa dla królika do płodu świni izolowane perfundowane płuco	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-4138
Surowica bydlęca A2: D41albumina liofilizowana w proszku	Sigma	Numer katalogowy: 3912	500 gramów
Przetwornik różnicowy niskiego ciśnienia DLP2.5, zakres +- 2,5 cmH2O, złącze HSE	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-3882
Przetwornik różnicy ciśnień MPX, zakres +- 100 cmH2O, Złącze HSE	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-0064
Absolutna klasa HPLC etanolu	Kaledon
Pompa perystaltyczna Harvard P-230 (w komplecie ze skrzynką sterowniczą i napędem silnikowym P-230)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 70-7001
Podgrzewany pneumatyczny liniowy zakres przepływu od 0 do 10 l/min	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Numer katalogowy: 59-9349
Sterownik grzałki do pojedynczego pneumotachometru 230 VAC, 50 Hz	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	59-9703
heparyna	Piza		Interfejs użytkownika 5000
System rdzeniowy IPL-4 do izolowanego płuca od królika do płodu świni, 230 V	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-4296
Pompa termostatyczna Lauda, typ E-103, 230 V/50 Hz, pojemność wanny 3 l, zakres temperatur od 20 do 150°C	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-0125
Opcja sterowania wentylacją podciśnieniową z regulatorem ciśnienia dla IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-4298
Króliki Nowej Zelandii
PISABENTAL (Pentobarbital sodowy)	Piza	Nr kat. Q-7833-215
Obudowa PLUGSYS, typ 603* 7	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-0045
Moduł licznika czasu PLUGSYS TCM	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1750
Moduł wzmacniacza przetwornika PLUGSYS (TAM-A)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-0065
Moduł wzmacniacza przetwornika PLUGSYS (TAM-D)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1793
PLUGSYS VCM-4R Moduł sterujący wentylacją z regulatorem ciśnienia	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1755 Rozdział 1755
PROCYNA (Ksylakyna klorhydrat)	Piza	Nr kat. Q-7833-099
Kaniula tętnicy płucnej dla królika z koszem, OD 4,6 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-4161
Nóż do skalpela
Kontroler serwomechanizmu do perfuzji (SCP)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-2806
Rękawice chirurgiczne nr 7 1/2
Rękawice chirurgiczne nr 8
Kaniula tchawicy dla królika, OD 5,0 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-4163

TGL TGL LAT