Przygotowanie świadomego modelu królika do jednoczesnego wideo-EEG-EKG-oksymetrii-kapnografii do interwencji eksperymentalnych: procedura wszczepienia elektrod EEE-EKG i dołączenia sond oddechowych w modelu królika

Streszczenie

Źródło: Bosinski, C. et al., Wielosystemowe monitorowanie w celu identyfikacji napadów, arytmii i bezdechu u świadomych, powściągliwych królików. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film pokazuje procedurę wszczepienia elektrod EEG-EKG i dołączenia sond oddechowych do modelu królika w celu uzyskania i analizy zapisów jego sygnałów biologicznych.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Wszczepianie elektrod EEG-EKG i podłączanie monitorów oddechu

1. Wyjmij jednego królika z transportera i umieść go na kolanach siedzącego śledczego.
2. Trzymaj królika pionowo i trzymaj go blisko ciała śledczego.
3. Opuść królika do pozycji leżącej, tak aby głowa królika znajdowała się na kolanach badacza, a głowa królika znajdowała się niżej niż reszta jego ciała.
   nuta: Ten manewr rozluźnia zwierzę i minimalizuje prawdopodobieństwo, że będzie próbowało się poruszyć lub uciec podczas umieszczania elektrod.
4. Teraz, gdy królik jest zabezpieczony w pozycji leżącej, poproś drugiego badacza o rozłożenie futra, aż skóra będzie mogła zostać zidentyfikowana i odizolowana od leżącej pod spodem tkanki.
5. Włożyć elektrody zgięte pod kątem 35° podskórnie do każdej pachy (Rysunek 1A).
   nuta: Elektrody należy przepchnąć tak, aby były bezpiecznie zaczepione w skórze, ale nie wnikały w głębsze struktury. Wchodzenie, a następnie wychodzenie elektrody ze skóry (na wskroś) zmniejsza ryzyko przemieszczenia się przewodów podczas umieszczania królika w unieruchomieniu lub jeśli porusza się on podczas eksperymentu (ryc. 1B). Wszystkie elektrody są sterylizowane 70% etanolem przed umieszczeniem.
6. Umieść przewody na klatce piersiowej z tyłu do prawej i lewej kończyny przedniej oraz na brzuchu przed lewą kończyną tylną. Umieść elektrodę szpilkową uziemiającą przed prawą tylną kończyną na brzuchu (ryc. 2A).
7. Po prawidłowym umieszczeniu wszystkich przewodów EKG przywróć królika do pozycji leżącej, tak aby przewody biegły po jednej stronie brzucha królika i przenieś królika do krępa o odpowiedniej wielkości (np. 6 "x 18" x 6"). Umieszczając królika w unieruchomieniu, pociągnij luźny drut do góry, aby zminimalizować wyciąganie elektrod nogami przez królika. Przyklej druty taśmą do boku ogranicznika, aby nie zostały przytrzaśnięte pod królikiem podczas eksperymentu (Rysunek 2B).
8. Zabezpiecz królika w unieruchomieniu, opuszczając pas przytrzymujący wokół szyi i blokując go na miejscu. Dodatkowo przesuń tylne kończyny do góry pod zwierzęciem i zabezpiecz tylne pasy.
   nuta: Powinno być w stanie zmieścić 1-2 palce w przestrzeni pod szyją, aby upewnić się, że nie jest zbyt ciasna. Szczególnie podczas eksperymentów, w których mogą występować ruchy motoryczne, ważne jest, aby zacisnąć pas, aby zminimalizować ruch, potencjalne urazy kręgosłupa, zwichnięcie kończyn i możliwość wysunięcia tylnego pasa bezpieczeństwa (ryc. 2B). Króliki były trzymane w uwięzi przez ~5 godzin bez żadnych problemów związanych ze zwiększonym ruchem lub objawami odwodnienia.
   1. W przypadku małych królików (np. w wieku poniżej 2 miesięcy) należy umieścić gumową podkładkę podwyższającą pod zwierzęciem, aby podnieść królika do góry, co uniemożliwi królikowi oparcie szyi na spodzie zagłówka (rysunek 2C).
      nuta: Nagły spadek częstości oddechów i akcji serca może być wtórny do uderzenia szyi. W takim przypadku poluzuj ogranicznik szyi i podnieś głowę królika, aby złagodzić ucisk szyi.
   2. Gdy tylne urządzenie przytrzymujące nie przylega dokładnie do grzbietu/kręgosłupa królika, należy umieścić przekładkę z PVC, aby zapobiec wszelkim ruchom, które mogłyby spowodować urazy kręgosłupa.
      nuta: Na przykład rurę PVC o długości ~14 cm x średnicy wewnętrznej 4 cale, z usuniętymi dolnymi 25-33%, można umieścić nad królikiem za pomocą pianki, aby zapewnić odpowiednie unieruchomienie (rysunek 2C).
9. Teraz, gdy królik jest bezpiecznie umieszczony w uwięzie, włóż podskórne proste elektrody szpilkowe o średnicy 7-13 mm do skóry głowy (ryc. 1A). Stosując podejście do wejścia pod kątem 45°, poprowadź przewody między uszami i luźno przywiąż druty do ogranicznika za głową, aby utrzymać ułożenie przewodu. Umieść 5 przewodów EEG w następujących pozycjach: prawy przedni, lewy przedni, prawy potyliczny, lewy potyliczny i centralny przewód odniesienia (Cz) w punkcie między pozostałymi 4 odprowadzeniami (ryc. 2D).
   nuta: Elektrody są prawidłowo umieszczone, gdy są umieszczone w tkance podskórnej przy czaszce. Takie umieszczenie minimalizuje artefakty z nosa, uszu i innych otaczających mięśni. Pewne artefakty związane z rytmicznymi ruchami nosa są nieuniknione. Przednie odprowadzenia EEG powinny być umieszczone przyśrodkowo w stosunku do oczu królika i skierowane do przodu. Przewody potyliczne powinny być umieszczone przed uszami i będą skierowane w kierunku przyśrodkowym. Cz umieszcza się na środku czubka głowy w punkcie, który znajduje się między wszystkimi 4 elektrodami (w połowie drogi między Lambda a Bregma, wzdłuż linii szwu). Trzpień elektrody Cz jest skierowany do przodu.
   1. Przełóż przewody EEG między uszami, aby królik nie próbował ugryźć przewodów.
10. Przymocuj pletyzmograf pulsoksymetru do ucha królika nad żyłą ucha brzeżnego.
    nuta: Może być konieczne zgolenie nadmiaru włosów z ucha, aby poprawić sygnał lub użycie gazy, aby utrzymać czujnik na miejscu.
    1. Upewnij się, że tętno na pletyzmografii koreluje z tętnem z EKG i że wyświetlane jest nasycenie tlenem (ryc. 3C).
11. Delikatnie umieść maskę na twarz z rurką kapnograficzną na pysku i nosie królika (ryc. 2H). Zabezpiecz maskę na twarz sznurkiem owiniętym wokół maski i przymocuj oba końce sznurka do ogranicznika. Podłącz drugi koniec rurki kapnograficznej do monitora parametrów życiowych.
    nuta: Ważne jest, aby podczas eksperymentu sznurek nie leżał na oczach królika. Aby to zrobić, przyklej sznurek do środka ogranicznika między uszami królika. Aby poprawić sygnał kapnograficzny, należy utworzyć zawór jednokierunkowy za pomocą taśmy i cienkiego kawałka nitrylu, który umożliwi przedostanie się tlenu do trójnika i skieruje wydychany CO2 do rurki kapnograficznej (rysunek 2I).

2. Zapis wideo-EEG-EKG

1. Wykonaj zapis wideo-EEG-EKG za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania EEG.
   nuta: Przewody biopotencjału i wideo są zablokowane w czasie, aby później skorelować sygnały elektryczne i wideo (np. skok EEG z szarpnięciem mioklonicznym).
2. Potwierdź optymalną łączność, bez dryftu linii bazowej, bez szumów elektrycznych 60 Hz i z wysokim stosunkiem sygnału do szumu. W szczególności upewnij się, że każda faza przebiegu serca może być uwidoczniona w EKG i że fale delta, theta i alfa nie są wizualnie zasłonięte przez szum o wysokiej częstotliwości w EEG.
   1. Jeśli wszystkie elektrody wytwarzają nadmierny szum, wyreguluj środkowy przewód odniesienia. Jeśli tylko jedna elektroda jest nadmiernie głośna, wepchnij ją głębiej w skórę lub zmień jej położenie, aż nie będzie odsłonięty metal.
3. Dostosuj wideo tak, aby wszystkie króliki były widoczne jednocześnie, co pozwala na korelację aktywności motorycznej z wynikami EEG (ryc. 3A).
   nuta: System umożliwia jednoczesne zapisy EEG/EKG/oksymetrii/kapnografii od maksymalnie 7 królików.
4. Rozpocznij zapis linii bazowej od każdego zwierzęcia przez co najmniej 10-20 minut lub do momentu, gdy tętno ustabilizuje się do spokojnego, zrelaksowanego stanu (200-250 uderzeń na minutę), a króliki nie będą wykazywać dużych ruchów przez co najmniej 5 minut. Uzyskaj dane elektrograficzne o pełnej przepustowości bez żadnych filtrów. W celu lepszej wizualizacji danych ustaw filtr niskiej częstotliwości (=filtr górnoprzepustowy) na 1 Hz, a filtr wysokiej częstotliwości (=filtr dolnoprzepustowy) na 59 Hz.
   nuta: Innym znakiem, że królik jest zrelaksowany, jest początek wrzecion snu EEG (omówionych później).
5. Dodawaj notatki z blokadą czasową podczas eksperymentu w czasie rzeczywistym, aby wskazać czas interwencji (np. podanie leku) i zdarzenia neurosercowe (np. skok EEG, drgawki ruchowe, bicie ektopowe i arytmie) oraz artefakty motoryczne/badacza.
   nuta: Ze względu na częstotliwość, z jaką badacz musi stosować interwencję (np. stymulacja fototyczna, dostarczanie leków), aby zminimalizować stres związany z wchodzeniem i wychodzeniem badacza z pokoju oraz otwieraniem/zamykaniem drzwi, badacz pozostaje po przeciwnej stronie pokoju przez cały czas trwania eksperymentu. Badacz siedzi jak najdalej od zwierzęcia i pozostaje nieruchomy i cicho, aby zminimalizować potencjalne przeszkadzanie zwierzętom.

Wyniki

Rysunek 1: Zdjęcie elektrod EEG i EKG. (A) Wygięte elektrody EKG i proste elektrody EEG. (B) Jak podłączyć elektrodę EKG w tkance podskórnej królika, tak aby była na wylot. Skróty (LL: Lewa kończyna, RA: Prawa ręka, RL: Prawa kończyna, LA: Lewa ręka, RF: Prawa czołowa, LF: Lewa czołowa, Cz: Środek, RO: Prawa potyliczna, LO: Lewa potyliczna).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
komputer	dolina	Komputer Optiplex 5040	Komputer akwizycyjny
Elektroda EKG	Łącznik rytmiczny	RLSND116-2,5	13 mm wygięte pod kątem 35 stopni (średnica 0,4 mm) podskórne elektrody szpilkowe
Elektroda EEG	Łącznik rytmiczny	RLSP513	5-skrętne proste (0,4 mm średnicy) podskórne elektrody szpilkowe
EEGLAB (2020)	Centrum Neuronauki Obliczeniowej Swartza	Otwarty dostęp	Potrafi wykonywać analizę spektralną EEG
Adapter Ethernet-to-Ethernet	Linksys powiedział:	USB3G16	Adapter do podłączenia aparatu do komputera
Wyściółka z pianki	rodzajowy	N/a	Zmniejsza nacisk wywierany na szyję małych królików przez ogranicznik, aby zapobiec niekorzystnym skutkom ucisku szyi krążeniowo-oddechowej
MATLAB (R2019b, aktualizacja 5)	MathWorks (Prace matematyczne)	N/a	Wymagane do uruchomienia EEGLAB
mikrofon	Stereo Sony	Mikrofon ECM-D570P	Nagrywanie słyszalnych objawów napadów
Taśma medyczna Micropore, papier, biała	3 mln	1530-1	Służy do zabezpieczania przewodów i tworzenia szyny usznej
Natus NeuroWorks	Natus (Natus)	LC101-8	Oprogramowanie do nabywania i recenzowania
Stymulator fototyczny	trawa	Konsola PS22	Stymulator do kontroli częstotliwości, opóźnienia, czasu trwania, intensywności impulsów świetlnych
Plastikowy organizer / wiązka drutu	12Vwire.com	LM-12-100-BLK	Wiązka przewodów w celu zmniejszenia hałasu
PS 22 Stymulator fototyczny	Instrumenty do trawy	BZA641035	Światło stroboskopowe z regulowaną częstotliwością, opóźnieniem i intensywnością błysku
Rura PVC	rodzajowy	N/a	Zapobiega kopaniu tylnymi nogami przez małe króliki i powodowaniu urazów kręgosłupa
Powściągliwość królika	Plas-Labs	501-TC	Dostępne są krępujące króliki o różnych rozmiarach. 6 "x 18" x 6 " w tym badaniu.
Gumowa podkładka (booster)	rodzajowy	N/a	Podnosi małe króliki w unieruchomieniu, aby zapobiec uciskowi szyi
Klips na ucho SpO2	BRAK	61000	PureSAT/SpO2
Adapter czujnika SpO2	BRAK	Numer katalogowy: 13931	XPOD PureSAT/SpO2
Webcol Alcohol Prep, sterylny, duży, 2-warstwowy	Wirus Covidien	Numer katalogowy 5110	Aby przygotować żyłę uszną przed cewnikowaniem
LabChart Pro (2019, wersja 8.1.16)	Instrumenty ADInstruments	N/a	Analiza EKG
Wzmacniacz kwantowy	Natus (Natus)	Numer katalogowy: 13926	Wzmacniacz / digitizer
Wzmacniacz Quantum HeadBox	Natus (Natus)	Numer katalogowy: 22134	64-pinowa skrzynka rozdzielcza
SRG-X120 Kamera PTZ 1080p z wyjściem HDMI, IP i 3G-SDI	Sony	Głośnik SRG-X120	Kamera Impela