Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Zwierzęta i pomieszczenia
- Zdobądź króliki nowozelandzkie białe (NZW) o wadze 2-3 kg.
- Trzymaj króliki pojedynczo w klatkach z ścisłą kontrolą temperatury (65 ± 5 °F) i wilgotności (45 ± 5%). Oświetlenie powinno mieć 12-godzinny cykl włączania/wyłączania.
- Zapewnij nieograniczony dostęp do wody i standardowej karmy dla królika. Wyeliminuj dodatki dietetyczne, ponieważ mogą one zawierać witaminę A, która wpływa na wzrok.
- Zwierzęta należy aklimatyzować przez co najmniej 2 tygodnie przed pomiarami wyjściowymi lub indukcją zespołu suchego oka.
2. Metody znieczulenia i eutanazji
UWAGA: Wszystkie procedury wymagają łagodnego uspokojenia, z wyjątkiem zastrzyku Con A, który wymaga umiarkowanego uspokojenia.
- W celu łagodnego uspokojenia należy wstrzyknąć acepromazynę (1 mg/kg) podskórnie na ramiona za pomocą igły o rozmiarze 26G. Punkt końcowy dla łagodnej sedacji: zwierzęta utrzymują zrelaksowaną pozycję głowy, a płatki uszu nie są już w pełni wyprostowane.
nuta: Jeśli odpowiedni punkt końcowy nie zostanie osiągnięty, można podać dodatkowe wstrzyknięcie acepromazyny. Zwierzęta powinny zawsze pozostawać przytomne, reagować na dotykanie wąsów i nigdy nie wykazywać spowolnionego oddechu.
- W celu umiarkowanego uspokojenia najpierw podaj zwierzętom acepromazynę, jak powyżej. Po osiągnięciu punktu końcowego (patrz uwaga powyżej) należy podać izofluran za pomocą maski gazowej o przepływieO2 ustawionym na 1 l/min i podawaniu izofluranu ustawionym na 5% (Rysunek 1).
- Podawaj izofluran do momentu, gdy odcień ciała królika zostanie całkowicie rozluźniony, a uszy będą całkowicie oklapnięte.
nuta: Nie powinny występować kompensacyjne ruchy mięśni, gdy zwierzę jest obrócone na bok; Oddech zawsze pozostaje spontaniczny.
- Spontaniczne ożywienie następuje w ciągu 2-5 minut: objawy obejmują spontaniczne ruchy głowy i zwiększone lub normalne napięcie mięśniowe. Po zakończeniu procedury eksperymentalnej z umiarkowaną sedacją obserwuj króliki przez około 30 minut lub do momentu, gdy ich zachowanie wróci do normy.
nuta: Maść okulistyczna nie jest wymagana podczas żadnej z form sedacji. 1) W łagodnym uspokojeniu zwierzęta są nadal czujne i utrzymują odruch mrugania. W umiarkowanej sedacji zahamowanie odruchu mrugania jest tak krótkie, że powierzchnia oka nie jest zagrożona. 2) Umieszczenie maści okulistycznej na powierzchni oka wyklucza uwidocznienie struktur ocenianych podczas badania.
- Eutanazja: Przedawkować dożylnie pentobarbital (100 mg/kg).
3. Indukcja i leczenie zespołu suchego oka
UWAGA: Trzy części systemu gruczołów łzowych oczodołu są wstrzykiwane.
- Uspokoić króliki acepromazyną w dawce 0,2 mg/kg podskórnie.
- Odetnij sierść w okolicy okołooczodołowej i skóry głowy i całkowicie usuń wszelkie pozostałości futra za pomocą Naira. Pozostaw skórę całkowicie gładką, aby uzyskać lepszą wizualizację anatomicznych cech charakterystycznych i wstrzyknięcie konkanawaliny A pod kontrolą USG (ryc. 2).
- Wywołaj umiarkowaną sedację, jak opisano powyżej.
- Iniekcja w część powiekową gruczołu łzowego górnego (PSLG)
nuta: Najpierw należy wykonać wstrzyknięcie PSLG.
- Nałóż na odpowiednie oko 25 μl lidokainy 1% bez konserwantów za pomocą mikropipety.
- Odczep górną powiekę i delikatnie uciskaj przyśrodkowo tylną krawędź oczodołu, aż pojawi się wypukłość oznaczająca część powiekową gruczołu. PSLG pojawia się jako małe bulwiaste wzniesienie w tylnej (skroniowej) części górnej powieki.
nuta: Aby wyświetlić tkankę gruczołu podczas procesu uczenia się, nałóż 5% fluoresceiny na obszar (ryc. 3A). Z bulwiastego PSLG spływają łzy. Stosowanie fluoresceiny nie jest konieczne do podawania Con A; Odbywa się to wyłącznie w celach ilustracyjnych, aby pokazać tkankę gruczołu.
- Za pomocą kleszczyków o drobnych zębach i igły o rozmiarze 27 na strzykawce tuberkulinowej bezpośrednio penetruj gruczoł za pomocą dostępu przezspojówkowego. Wsuń igłę o 2 mm w tkankę i wstrzyknij 500 μg Con A w objętości 0,1 ml (ryc. 3B).
UWAGA: To wstrzyknięcie może być czasami bolesne. Jeśli to konieczne, należy trzymać zwierzęta pod izofluranem do czasu zakończenia tego wstrzyknięcia.
