Pobieranie chrząstki stawowej ze stawów dawcy koniowatych: zabieg chirurgiczny mający na celu wyizolowanie naczyniowej tkanki łącznej ze stawów zwłok dawcy koni

Streszczenie

Źródło: Benders, K. E. M. et al. Produkcja rusztowań matrycowych pochodzących z decelularyzowanej chrząstki. J. Vis. Exp. (2019)

W tym filmie pokazujemy ekstrakcję chrząstki stawowej ze stawu zwłok koni. Izolowana chrząstka stawowa może być wykorzystana do dalszej analizy.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE

1. Pobieranie chrząstki stawowej ze stawów dawcy (zwłok)

1. Przed etapem zbioru należy przygotować 1 l roztworu do przemywania chrząstek, składającego się ze sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanego fosforanami (PBS), uzupełnionego 100 j./ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 1% (v/v) amfoterycyny B.
2. Podczas całej procedury pobierania należy nosić rękawice i fartuch laboratoryjny, ponieważ dawca może być nosicielem patogenów.
3. Uzyskać nienaruszony (martwy) staw do izolacji chrząstki.
   nuta: W tym momencie skóra wokół stawu jest nadal nienaruszona. W tym protokole wykorzystano chrząstkę kolanową koni uzyskaną z konia, ale można również wykorzystać inne stawy innych gatunków.
4. Usuń skórę znajdującą się wokół interesującego Cię obszaru stawu za pomocą skalpela i pęsety chirurgicznej. Ponadto usuń nadmiar tkanki tłuszczowej i mięśniowej, jeśli to konieczne, nie uszkadzając leżącego poniżej stawu. Opcjonalnie należy przenieść przygotowane zwłoki do komory bezpieczeństwa biologicznego.
5. Aby wykonać artrotomię, czyli oddzielenie stawu, najpierw określ miejsce, w którym staw się łączy, wykonując wyprost i zgięcie stawu.
6. Ostrożnie usuń więcej warstw tłuszczu, mięśni i ścięgien za pomocą skalpela i pęsety chirurgicznej, aby otworzyć obszar stawu.
7. Wykonaj nacięcie, aby dotrzeć do jamy stawowej.
   nuta: Jama stawowa jest wypełniona płynem maziowym, który może kapać z jamy podczas wykonywania prawidłowego nacięcia.
8. Kontynuuj całkowite otwieranie stawu, przecinając ścięgna, które utrzymują staw razem.
9. Sprawdź chrząstkę pod kątem uszkodzeń makroskopowych.
   UWAGA: Jeśli chrząstka stawowa nie ma błyszczącego i gładkiego wyglądu lub jeśli występują wyraźne pęcherze, rozszczepy lub defekty, wyrzuć chrząstkę.
10. Użyj sterylnego skalpela, aby usunąć chrząstkę z kości podchrzęstnej. Przeciąć aż do kości podchrzęstnej, aby usunąć również głęboką strefę chrząstki (ryc. 1). Aby zapobiec wysychaniu chrząstki, regularnie kap roztwór do mycia chrząstki na chrząstkę.
    nuta: W tej chwili wielkość plastrów chrząstki nie ma znaczenia.
11. Zebrać plastry chrząstki do probówek o pojemności 50 ml zawierających wcześniej przygotowany roztwór do przemywania chrząstki (ryc. 2A).
12. Po pobraniu chrząstki ze wszystkich obszarów zainteresowania, należy zamrozić plastry chrząstki w ciekłym azocie na 5 minut.
13. Przenieś plastry chrząstki do probówek o pojemności 50 ml i natychmiast liofilizuj plastry chrząstki przez 24 godziny w liofilizatorze. Ustaw liofilizator na około 0,090 mbar, podczas gdy skraplacz lodu ma temperaturę -51 °C (rysunek 2B).
14. Plastry chrząstki przechowuj w suchym miejscu w temperaturze pokojowej do dalszego użycia.

Wyniki

Rycina 1: Kolano konia po usunięciu chrząstki o pełnej grubości. Chrząstkę usuwa się z kłykci za pomocą skalpela, aż do osiągnięcia zwapniałej warstwy chrząstki, której nie można przeciąć skalpelem.

Rysunek 2: Sekwencyjne eta...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Staw zwłokowy			Można go uzyskać jako materiał resztkowy od lokalnego rzeźnika lub centrum weterynaryjnego.
Sterylny sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)
Penicylina-Streptomycyna	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 15140
Amfoterycyna B	Thermo Fischer Naukowy	15290026
Ciekły azot
Liofilizator	SALMENKIPP	ALPHA 1-2 LD plus
Wirówka (do probówek 50 ml)	Eppendorf	Zobacz materiał 5810R
skalpel
Uchwyt na skalpel
Mała chochla

powiedział: