Witryfikacja zarodków królików za pomocą słomki kriogenicznej: ultraszybka technika chłodzenia w celu zachowania zarodków królika do długotrwałego przechowywania

Streszczenie

Źródło: Garcia-Dominguez, X. et al. Minimally invasive embryo transfer and embryo vitrification at the optimal embryo stage in rabbit model. J. Vis. Exp. (2019)

W tym filmie opisujemy procedurę witryfikacji pobranych zarodków królika na pożądanym etapie rozwoju przy użyciu glikolu etylenowego i dimetylosulfotlenku jako krioprotektantów oraz słomy kriogenicznej jako systemu nośnego. Zarodki zeszklone mają wysoki wskaźnik przeżywalności i mogą być przechowywane przez dłuższy czas do momentu wykorzystania.

Protokół

Wszystkie procedury związane z modelami zwierzęcymi zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Witryfikacja zarodków

1. Wszystkie czynności należy wykonać w temperaturze pokojowej (około 22 °C), aby zmniejszyć toksyczność roztworu witryfikacyjnego w cieplejszych temperaturach.
   nuta: W tym protokole zarodki mogą być przenoszone za pomocą pipety automatycznej o pojemności 0,1–2 μl, ale odpowiednie mogą być inne podobne urządzenia do przenoszenia zarodków ciągnących minimalną objętość.
2. Witryfikować zarodki w dwuetapowej procedurze dodawania:
   1. Umieścić zarodki na 2 minuty w roztworze równoważącym składającym się z 10% (v/v) glikolu etylenowego i 10% (v/v) dimetylosulfotlenku rozpuszczonego w pożywce zasadowej (BM). (Skład BM: sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS) uzupełniona 0,2% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej)
   2. Przenieść zarodki (z kroku 1.2.1) na 1 minutę do roztworu witryfikacyjnego składającego się z 20% (v/v) glikolu etylenowego i 20% (v/v) dimetylosulfotlenku rozpuszczonego w BM.
3. Załaduj zarodki do plastikowego pojemnika o pojemności 0,25 ml (który zawiera jeden zamknięty koniec z bawełnianą zatyczką i jeden otwarty ekstremalny). Proces jest schematyzowany na rysunku 1.
   1. Połącz zamknięty koniec 0,25 ml pojemnika z odpowiednim mikrodozownikiem (np. Captroll III).®
   2. Zassać BM do 1/3 długości słomki, a następnie wprowadzić mały pęcherzyk powietrza.
   3. Odessać zarodki w objętości 40 μl roztworu witryfikacyjnego, a następnie umieścić kolejny mały pęcherzyk powietrza.
   4. Zasysać BM do momentu, gdy pierwsza frakcja płynna (etap 1.3.2) dotrze do bawełny.
   5. Zamknij otwarty koniec korkiem słomkowym.
4. Wykonaj krok 1.2.2 podczas wykonywania kroku 1.3, aby upewnić się, że nie upłynie więcej niż jedna minuta, która byłaby toksyczna dla zarodków.
5. Zanurz ministraw bezpośrednio w ciekłym azocie, aby uzyskać witryfikację.
6. Przechowuj ministraw w dewarze na azot przez żądany czas.

Wyniki

Rysunek 1: Schematyzacja prawidłowo załadowanej słomy. A) BM odnosi się do pożywki manipulującej zarodkami stosowanych podczas witryfikacji. Zarodki muszą być załadowane roztworem do witryfikacji. B) Makroskopowy wygląd załadowanej słomy z powiększonymi szczegółami położenia zarodka. To urządzenie o dużej objętości pozwala nam na witryfikację dużej liczby zarodków, w przeciwieństwi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Firma VWR	332
Dimetylosulfotlenek	Sigma Aldrich	W387509
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco	Sigma Aldrich	Zobacz materiał D5773	Bez chlorku wapnia.
Glikol etylenowy	Sigma Aldrich	102466-M
Ciekły azot	Air Liquide	P1505XXX
Słomka plastikowa 0,25 ml	IMV - technologie	Numer katalogowy: 6431
Mikroskop stereoskopowy	Księga Leica	MZ16F	Istnieją tańsze opcje, takie jak Leica MZ8 lub Nikon SMZ-10 lub SMZ-2B, żeby wymienić tylko kilka.
Zatyczka słomkowa	IMV - technologie	Numer katalogowy: 6431