W niniejszym opracowaniu opisujemy zestaw testów mutacji DNA, które można połączyć z modelem chronologicznej długości życia drożdży w celu zbadania genów i szlaków regulujących lub przyczyniających się do niestabilności genomowego DNA podczas starzenia.
Artykuł metodologiczny
Badanie zależnej od wieku niestabilności genomicznej z wykorzystaniem modelu chronologicznej długości życia S. cerevisiae
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badania z wykorzystaniem modelu starzenia Saccharomyces cerevisiae ujawniły szlaki regulacyjne długości życia, które są częściowo konserwatywne u wyższych eukariotów1-2. Prostota i potencjał modelu starzenia drożdży mogą być również wykorzystane do badania uszkodzeń DNA i utrzymania genomu, a także ich wpływu na rozwój chorób podczas starzenia. W niniejszej pracy opisujemy system służący do badania zależnych od wieku mutacji DNA, w tym substytucji zasad, mutacji z przesunięciem ramki odczytu, masywnych reorganizacji chromosomalnych oraz rekombinacji homologicznej i homeologicznej, a także aktywności naprawy jądrowego DNA, poprzez połączenie chronologicznej długości życia drożdży z prostymi testami uszkodzeń i mutacji DNA. Opisane tutaj metody powinny ułatwić identyfikację genów i szlaków regulujących niestabilność genomiczną oraz mechanizmów leżących u podstaw zależnych od wieku mutacji DNA i nowotworów u ssaków.
Protokół
Do badania starzenia się S. cerevisiae wykorzystywano dwa modele długości życia: RLS oraz CLS. Replikacyjna (pączkująca) długość życia (RLS) opiera się na obserwacji, że macierzyste komórki drożdży przechodzą ograniczoną liczbę podziałów3-6. W niniejszej pracy skupimy się na chronologicznej długości życia (CLS), modelu opartym na chronologicznym przeżyciu niedzielących się drożdży w hodowli lub na płytkach7-11. Drożdże typu dzikiego rosną wykładniczo przez 10-12 godzin w syntetycznym pełnym medium z dekstrozą (SDC). Gdy poziom glukozy spada, drożdże przełączają się z fermentacji na oddychanie, co jest procesem zwanym przesunięciem diauksycznym. Komórki nadal dzielą się powoli podczas fazy podadiauksycznej przez około 48 godzin, zanim wejdą w stan zatrzymania w fazie G0. Szybkość metaboliczna komórek pozostaje wysoka do 5-6 dnia (dzień 0 to dzień inokulacji). Żywotność komórek w czasie można ocenić na podstawie procenta chronologicznie starzejących się komórek pobieranych co dwa dni, które są w stanie opuścić stan zatrzymania G0 i tworzyć kolonie na bogatych płytkach YPED.
1. Chronologiczna długość życia (CLS) drożdży w kulturze płynnej
- Zaszczep pojedynczą kolonię do 1 ml syntetycznego medium kompletnego z glukozą (SDC, Tabela 1) i inkubuj przez noc z wytrząsaniem (220 rpm) w temperaturze 30°C. Dla każdego szczepu należy przygotować trzy szczepionki z niezależnych kolonii, aby uzyskać repliki biologiczne.
- Rozcieńcz nocną kulturę w świeżym medium SDC (zazwyczaj 10 ml) do OD=0,05-0,1 (rozcieńczenie ok. 1:100) i inkubuj z wytrząsaniem (220 rpm) w temperaturze 30°C. Ten punkt czasowy uznaje się za dzień 0 starzenia chronologicznego. Zachowaj stosunek kultury do objętości kolby wynoszący 1:5 (10 ml kultury w kolbie 50 ml lub w przypadku dłuższych/większych eksperymentów 25 ml kultury w kolbie 125 ml), aby zapewnić odpowiednie napowietrzanie.
- Zaczynając od 3. dnia, pobierz z kolby 2 alikwoty po 10 μl, rozcieńcz je 10 000 razy w autoklawowanej wodzie, nanieś 10 μl rozcieńczonej kultury (np. 104-10) na płytki YEPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu bacto, 2% dekstrozy, 2% agaru) i inkubuj w temperaturze 30°C przez 48-72 godziny przed przeliczeniem jednostek tworzących kolonie (CFU).
- CFU z 3. dnia uznaje się za 100% przeżywalności. Czynniki rozcieńczenia starzejącej się kultury w kolejnych dniach należy odpowiednio dostosować, aby zapewnić ok. 20-100 kolonii w teście CFU (np. 104-10, 104-30, 103-10 itp.). Dla komórek typu dzikiego w tle DBY746 CLS osiąga 1% przeżywalności około 11. dnia.
Warianty testu żywotności in situ obejmują:
- Ograniczenie kaloryczne (CR) poprzez limitację glukozy. Rozcieńczenie hodowli nocnej w medium SC z ograniczoną zawartością glukozy (np. 0,5 lub 0,05% zamiast standardowych 2% glukozy) prowadzi zazwyczaj do niższej gęstości nasycenia populacji w 3. dniu, lecz znacznie wydłuża średnią oraz maksymalną (10% przeżywalności) długość życia12.
- W przypadku ekstremalnego CR/głodzenia, kulturę w fazie stacjonarnej z 3. dnia (zazwyczaj 10 ml, jak w kroku 3 powyżej) należy przemyć wodą autoklawowaną (komórki resuspenderować w równym объеме wody i wirować przy 2500 rpm przez 5 min, powtórzyć 3 razy). Inkubacja komórek w wodzie naśladuje warunki głodzenia, z którymi drożdże mogą spotkać się w środowisku naturalnym. Następnie co dwa dni kulturę starzejącą się należy przemyć wodą autoklawowaną i resuspenderować w równym объеме wody, aby usunąć składniki odżywcze uwolnione z lizowanych martwych komórek. Test żywotności należy przeprowadzić, pobierając próbki z kultury starzejącej się zgodnie z opisem powyżej. Warunki głodzenia te doprowadzą do niemal dwukrotnego wydłużenia średniego CLS w szczepie typu dzikiego DBY74612.
2. Test żywotności in situ
W hodowli płynnej niewielka frakcja przeżywających komórek może ponownie wejść w cykl komórkowy i rosnąć, wykorzystując pozostałe składniki odżywcze lub te uwolnione z lizowanych martwych komórek w medium; fenotyp ten nazywa się odrostem/gaspingiem13. Opracowaliśmy system oceny żywotności na płytce, który wykorzystuje aukzotrofię szczepu DBY746 (trp1), aby uniknąć problemu odrostu/gaspingu oraz umożliwić badanie wpływu stałej ekspozycji lub braku różnych zewnętrznych składników odżywczych lub bodźców na CLS drożdży11. Ten test żywotności in situ naśladuje również model długości życia replikacyjnego, w którym komórki są stale eksponowane na obfite składniki odżywcze przez cały czas trwania analizy czasu życia.
- Zaszczep pojedynczą kolonię do 1 ml syntetycznego medium kompletnego z glukozą (SDC) i inkubuj przez noc z wytrząsaniem (220 rpm) w temperaturze 30°C. Dla każdego szczepu należy przygotować co najmniej trzy szczepionki z niezależnych kolonii w celu uzyskania powtórzeń biologicznych.
- Pozostaw kulturę do namnożenia do poziomu ˜108 komórek/ml (OD600=˜10), a następnie rozcieńcz kulturę wodą autoklawowaną do stężeń 100-200 komórek/10 μl (zazwyczaj rozcieńczenie 104-krotne) oraz 1 000 komórek/10 μl (rozcieńczenie 103-krotne).
- Wyjałowuj dwie porcje po 10-30 μl rozcieńczonej kultury na jedną płytkę SDC z brakiem tryptofanu. Dla każdego szczepu przygotuj zestaw od 8 do 20 płytek i oznacz je zgodnie z gęstością wysiewu (np. rozcieńczenie 104-krotne, wysiew 10 μl lub 104-10, 104-30, 103-10, 103-30 itd.), co zapewni możliwość przeliczenia 10-100 kolonii, przewidując spadek żywotności podczas starzenia.
- Inkubuj zestaw płytek w temperaturze 30°C przez cały czas trwania analizy długości życia.
- W dniu wysiewu oraz co 2 dni w dalszym ciągu, wyjmij jedną płytkę i dodaj kroplami 0,5 ml tryptofanu (2 mg/ml), aby umożliwić wzrost żywych komórek. Inkubuj płytkę w temperaturze 30°C przez dodatkowe 48-72 godziny. Policz CFU w celu oceny żywotności w dniu dodania tryptofanu. Liczbę CFU w dniu wysiewu uznaje się za 100% przeżywalności.
Warianty testu żywotności in situ obejmują:
- Starzej komórki na płytkach agarowych (warunki ekstremalnego głodu). W kolejnych dniach dodaj 1 ml 2x YPED zamiast tryptofanu, aby umożliwić wzrost i oznaczenie CFU14.
- Starzej komórki na płytkach z syntetycznym medium kompletnym z brakiem tryptofanu z różnymi źródłami węgla, np. różnymi stężeniami glukozy (ograniczenie kaloryczne poprzez limitację glukozy), różnymi źródłami węgla takimi jak etanol, glicerol, kwas octowy14. Dodaj 1 ml roztworu glukozy/tryptofanu (20% glukozy i 1mg/ml tryptofanu), aby umożliwić wzrost i oznaczenie CFU.
- Inne manipulacje składnikami odżywczymi, np. azotem.
3. Uszkodzenia DNA i częstotliwość mutacji podczas starzenia chronologicznego
Oporność na kanawaninę (Canr) i sekwencjonowanie can1
Częstość spontanicznych mutacji można ocenić poprzez pomiar częstości występowania oporności na kanawaninę (Canr) w kulturach starzejących się chronologicznie. Mutacje w genie CAN1 (YEL063), który koduje plazmatyczną permeazę argininy, sprawiają, że komórki stają się oporne na analog argininy, L-kanawaninę. Kolonie Canr zebrane w różnych punktach czasowych mogą zostać również zachowane w celu ekstrakcji DNA genomowego i późniejszego sekwencjonowania genu CAN1, co pozwala na uzyskanie danych dotyczących spektrum mutacji (za pomocą Mutation Surveyor, SoftGenetics).
Substytucje zasad (rewersje Trp+)
Szczepy z mutacją trp1-289 posiadają mutację bursztynową (C403T) w sekwencji kodującej TRP1. Pomiar częstotliwości rewersji trp1-289 do Trp+15 pozwala na oszacowanie szybkości substytucji zasad podczas chronologicznego starzenia się drożdży.
Mutacje przesunięcia ramki odczytu
Szczep Lys- EH150 (MATa, lys2ΔBglII, trp1-Δ, his3-Δ200, ura3-52, ade2-1o) posiada mutację lys2ΔBglII, która została wytworzona poprzez wstawienie 4 nukleotydów w celu utworzenia miejsca cięcia dla enzymu restrykcyjnego BglII w genie LYS2. Wynikające z tego przesunięcie ramki odczytu o +4 prowadzi do aukzotrofii lizynowej, która może zostać zniesiona przez niewielkie mutacje typu insercja/delecja16-17.
Makroskopowe rearanżacje chromosomalne (GCRs)
Aby wykryć masywne reorganizacje chromosomalne (GCRs), stworzyliśmy szczep mutanta, w którym gen HXT13 (YEL069), kodujący wysoce redundantny transporter heksoz, został przerwany za pomocą kasety URA318. HXT13 znajduje się 7,5 kb telomerycznie względem CAN1 na chromosomie V. Mutacje w genach CAN1 i URA3 nadają komórkom odporność odpowiednio na L-kanawaninę i kwas 5-fluorootowy (5FOA). Biorąc pod uwagę niską częstotliwość mutacji punktowych występujących w obu tych genach, analiza częstości Canr 5FOAr pozwala oszacować liczbę GCRs prowadzących do utraty obu genów.
Rekombinacja homologiczna i homeologiczna
Aby monitorować poziom rekombinacji homologicznej (100%) i homeologicznej (91%) podczas starzenia chronologicznego, stworzyliśmy mutanty, w których wprowadzono zlinearyzowane plazmidy (HIS3::intron-IR-URA3) zawierające albo 100% homologiczne odwrócone powtórzenia (IR) (pSR406), albo 91% homeologiczne IR (pSR407) w locus HIS319. Rekombinacja pomiędzy IR umożliwia ekspresję funkcjonalnego białka His3.
- Równolegle do standardowego testu żywotności (opisanego powyżej), pobierz odpowiednią liczbę komórek z kultury starzejącej się:
- dla mutacji Canr, zacznij od ˜2x107 komórek (200 μl kultury z 3. dnia);
- dla rewersji Trp+, zacznij od ˜108 komórek (500-1000 μl kultury z 3. dnia);
- dla mutacji z przesunięciem ramki odczytu Lys+, zacznij od ˜108 komórek (500-1000 μl kultury z 3. dnia);
- dla GCRs, zacznij od 2-3x108 komórek (2-3 ml kultury z 3. dnia);
- dla rekombinacji homologicznej i homeologicznej, zacznij od ˜5x107 komórek (200-500 μl kultury z 3. dnia);
- Odwirowuj komórki w wirówce laboratoryjnej (6000 rpm przez 5 min).
- Resuspenduj komórki w 1 ml wody autoklawowanej, a następnie ponownie je odwirowuj.
- Resuspenduj osad komórkowy w 100 μl wody. Wysiej komórki:
- dla mutacji Canr, na płytki z syntetyczną pożywką kompletną pozbawioną argininy (SDC-Arg, uzupełnioną o 60 μg/ml siarczanu L-kanawaniny);
- dla rewersji Trp+, na płytki pozbawione tryptofanu (SDC-Trp);
- dla mutacji z przesunięciem ramki odczytu Lys+, na płytki pozbawione lizyny (SDC-Lys);
- dla GCRs, na płytki pozbawione argininy (SDC-Arg) uzupełnione o 5FOA (1 mg/ml) i siarczan L-kanawaniny (60 μg/ml);
- dla rekombinacji homologicznej i homeologicznej, na płytki pozbawione histydyny uzupełnione galaktozą (2%).
- Policz CFU po 3-4 dniach inkubacji w temperaturze 30°C. Częstotliwość mutacji należy znormalizować do liczby żywych komórek.
Uzupełnieniem testu żywotności in situ może być badanie zależnej od wieku rewersji Trp+, mutacji przesunięcia ramki Lys+, rekombinacji lub Canr w komórkach starzejących się na płytce.
- Wysiać komórki (˜108 komórek/płytkę) na płytki z syntetycznym podłożem kompletnym z pominięciem Trp, Lys, His lub z dodatkiem L-kanawaniny (zgodnie z powyższym opisem).
- Co dwa dni (lub w wybranym punkcie czasowym) ocenić liczbę nowo powstających kolonii.
- Częstotliwość mutacji szacuje się poprzez normalizację liczby nowo powstających kolonii do całkowitej liczby żywych komórek w danym dniu.
4. Synteza ponaduszkodzeniowa (TLS)
Zależny od wieku wzrost częstotliwości mutacji może wynikać ze zwiększonego uszkodzenia makrocząsteczek, osłabienia ochrony i naprawy komórkowej oraz nasilenia błędnej naprawy DNA (takiej jak zależna od Polζ synteza ponaduszkodzeniowa, TLS) w trakcie starzenia. Na przykład długożyjące mutanty sch9Δ wykazują podwyższoną ekspresję SOD2 oraz obniżoną ekspresję podatnego na błędy enzymu naprawy DNA Rev120. W niniejszej pracy opisujemy test łączący uszkodzoną matrycę DNA z całkowitym ekstraktem jądrowym w celu oceny TLS in vitro.
- Przygotować ekstrakt jądrowy zgodnie z opisem Wang et al.21; oznaczyć stężenie białka za pomocą testu BCA (Pierce).
- Dodać 0, 5, 10 lub 20 μg ekstraktów jądrowych do reakcji o końcowej objętości 50 μl zawierających bufor TLS (20 mM HEPES, 7 mM MgCl2, 1 mM DTT, 25 mM NaCl, pH 7.8), 200 μM dNTP oraz 100 nM primera o długości 12 nukleotydów znakowanego 5'-32P (5'-CGA TGG TAC GGA-3'), zhybrydyzowanego z matrycą o długości 48 nukleotydów zawierającą analizowane uszkodzenie DNA (5'-TCG ATA CTG GTA CTA ATG ATT AAC GAC TXA AGC ACG TCC GTA CCA TCG-3', gdzie X oznacza miejsce uszkodzenia, np. miejsce abazylowe, 8-oxo-G itp.).
- Inkubować mieszaninę w temperaturze 30°C przez 30 min, a następnie przerwać reakcję poprzez dodanie 2,5 μl EDTA (20 mM) oraz 2 μl proteinazy K (10 mg/mL).
- Oczyścić DNA metodą ekstrakcji fenolem i precypitacji etanolem.
- Resuspender DNA w 50 μl buforu do nakładania na żel (98% formamidu, 20 mM EDTA i barwnika).
- Rozdzielić produkty syntezy TLS na żelach poliakryamidowych o stężeniu 19%.
- Ilościowo oznaczyć TLS za pomocą obrazowania fosforowego (Rysunek 1).
5. Reprezentatywne wyniki
W standardowej analizie CLS w środowisku ciekłym zazwyczaj przyjmuje się liczbę CFU w 3. dniu jako 100% przeżywalności. Procent przeżywalności w kolejnych dniach można dopasować, aby obliczyć średnią (50% przeżywalności) oraz maksymalną (10% przeżywalności) długość życia12. Wyniki długości życia uzyskane z testu żywotności in situ są zazwyczaj zgodne z wynikami uzyskanymi w ciekłym teście CLS, jednak przy zredukowanej średniej długości życia, co wynika częściowo z faktu, że komórki są stale eksponowane na składniki odżywcze. Obecność glukozy hamuje aktywność mechanizmów ochrony komórkowej, co objawia się zmniejszoną transaktywacją czynników transkrypcyjnych odpowiedzi na stres, takich jak Msn2/4 i Gis112.
Częstość mutacji zależna od wieku znacznie różni się w zależności od tła szczepu, manipulacji genetycznych, warunków hodowli oraz wieku. Tabela 2 przedstawia typowe wyniki uzyskane dla szczepu typu dzikiego (DBY746).
| Komponent | g/L |
|---|---|
| D-glukoza | 20 |
| Siarczan amonu | 5 |
| Zasada azotowa (-AS/-AA) | 1.8 |
| NaH2PO4 | 1.4 |
| mg/L | |
| Adenina | 80 |
| L-arginina | 40 |
| Kwas L-asparginowy | 100 |
| Kwas L-glutaminowy | 100 |
| L-histydyna | 80 |
| L-izoleucyna | 60 |
| L-leucyna | 120 |
| L-lizyna | 60 |
| L-metionina | 80 |
| L-fenyloalanina | 60 |
| L-seryna | 400 |
| L-treonina | 200 |
| L-tryptofan | 80 |
| L-tyrozyna | 40 |
| L-walina | 150 |
| Uracyl | 80 |
Tabela 1. Syntetyczna pożywka glukozowa kompletna, SDC (pH skorygowane do 6,0 za pomocą NaOH). Dodano 4-krotny nadmiar histydyny, leucyny, tryptofanu i uracylu, aby zrekompensować aukstrofię szczepu DBY746.
| Dzień 3 (średnia ± SEM) | Do (w trakcie starzenia) | |
|---|---|---|
| Canr | 1.76 ± 0.12 x10-6 | 6-8 x10-6 |
| reversja Trp+ | 6.60 ± 1.70 x10-8 | 1.60 x10-6 |
| mutacja przesunięcia ramki Lys+ | 3.00 ± 0.78 x10-8 | 0.70 x10-6 |
| GCRs | 0.62 ± 0.10 x10-8 | 0.30 x10-6 |
| Rekombinacja homologiczna | 5.55 ± 2.74 x10-6 | 27.00 x10-6 |
| Rekombinacja homeologiczna | 0.12 ± 0.04 x10-6 | 0.48 x10-6 |
Tabela 2. Typowe częstości mutacji komórek typu dzikiego (DBY746) podczas starzenia chronologicznego.
Rycina 1. Wynik syntezy translesyjnej (TLS)20. Ekstrakty jądrowe z 3-dniowych komórek typu dzikiego (DBY746) oraz mutantów sch9Δ w fazie stacjonarnej inkubowano przez 30 min w temperaturze 30°C z nieuszkodzonymi matrycami DNA lub matrycami zawierającymi miejsca abasyczne. Produkty TLS zaznaczono liniami ciągłymi (dla matrycy nieuszkodzonej) lub przerywanymi (dla matrycy uszkodzonej). W ekstrakcie jądrowym z mutantów sch9Δ nie zaobserwowano syntezy translesyjnej. Wolne primery wskazano pustą strzałką.
Dyskusja
Kultury starzejące się w cieczy czasami wykazują fenotyp odrastania/gasping13, co komplikuje analizę CLS. Odrastanie zazwyczaj występuje, gdy więcej niż 90-99% populacji straci żywotność. Fenotyp ten jest często powiązany ze zwiększonym stresem oksydacyjnym i/lub zmniejszoną ochroną komórki. Na przykład częstotliwość występowania tego fenotypu ponad dwukrotnie wzrasta w komórkach pozbawionych cytozolowej dysmutazy ponadtlenkowej i znacznie zmniejsza się u mutantów długowiecznych (np. sch9Δ lub ras2Δ) lub mutantów nadekspresujących dysmutazy ponadtlenkowe22. W praktyce definiujemy odrastanie jako wzrost żywotności lub stabilizację żywotności podczas 3 kolejnych prób pobrania próbek w fazie wysokiej śmiertelności podczas starzenia chronologicznego.
Częstość występowania różnych mutacji DNA w zależności od wieku znacznie różni się w zależności od tła szczepu, manipulacji genetycznych, warunków hodowli, a także odjawisk odrastania/gaspingu oraz ekstremalnie niskiej przeżywalności. Przed przeprowadzeniem pełnoobszałowej analizy długości życia należy wykonać eksperymenty wstępne w punktach czasowych odpowiadających średniej i maksymalnej przeżywalności, przy różnych gęstościach wysiewu w testach mutacji, aby określić zakres częstości mutacji. Szczep typu dzikiego powinien być zawsze włączany do badania długości życia lub częstości mutacji równolegle do każdej manipulacji lub mutanta genetycznego, tak aby można było uwzględnić różnice między eksperymentami. W badaniu należy uwzględnić wielokrotne repliki biologiczne, a w celu potwierdzenia wyników należy przeprowadzić testy żywotności/mutacji zarówno w formie ciekłej, jak i in situ.
Zamiast skupiać się na jednym konkretnym typie mutacji DNA, profilowanie zależnej od wieku niestabilności genomicznej z wykorzystaniem kombinacji wielu testów może rzucić światło na specyficzne uszkodzenia DNA oraz systemy naprawy uszkodzeń DNA, które przyczyniają się do tej niestabilności. Na przykład u dzikich szczepów drożdży obserwuje się znaczący wzrost liczby dużych reorganizacji chromosomowych (GCRs) w porównaniu z innymi mutacjami DNA, co sugeruje zwiększenie liczby pęknięć dwuniciowych i/lub upośledzenie procesu nieswoistego łączenia końców (NHEJ) podczas chronologicznego starzenia się drożdży (Tabela 2). Spektrum mutacji can1 (sekwencjonowanie genu CAN1) uzyskane u starzejących się dzikich szczepów drożdży sugerowało wzrost uszkodzeń oksydacyjnych podczas starzenia chronologicznego oraz podatną na błędy naprawę DNA; natomiast u długowiecznych mutantów sch9Δ zaobserwowano mniejszą liczbę oksydacyjnych uszkodzeń DNA oraz znacznie zredukowaną, podatną na błędy syntezę translesyjną20.
Opisane tutaj metody można dalej rozszerzyć w celu badania zależnej od wieku niestabilności genomicznej. Na przykład komórki spoczynkowe i niespoczynkowe można wyizolować z kultur drożdży w fazie stacjonarnej, stosując metodę gradientu gęstości opisaną przez Allena et al.23. W połączeniu z opisanymi tutaj testami mutacji wykazaliśmy, że znaczna część mutacji zależnych od wieku pochodzi z komórek spoczynkowych, a nie z komórek dzielących się, uszkodzonych lub apoptotycznych20,24.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy S. Jinks Robertson i E. Heidenreich za udostępnienie plazmidów i szczepów drożdży; P. Pham i M.F. Goodman za pomoc przy teście TLS. Praca ta była częściowo wspierana przez grant American Federation for Aging Research oraz granty NIH AG20642, AG025135.
Bibliografia
- Longo, V. D., Finch, C. E. Evolutionary medicine: from dwarf model systems to healthy centenarians. Science. 299, 1342-1346 (2003).
- Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span--from yeast to humans. Science. 328, 321-326 (2010).
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183, 1751-1752 (1959).
- Muller, I., Zimmermann, M., Becker, D., Flomer, M. Calendar life span versus budding life span of Saccharomyces cerevisiae. Mech. Ageing Dev. 12, 47-52 (1980).
- Jazwinski, S. M., Egilmez, N. K., Chen, J. B. Replication control and cellular life span. Exp. Gerontol. 24, 423-436 (1989).
- Pohley, H. J. A formal mortality analysis for populations of unicellular organisms (Saccharomyces cerevisiae. Mech Ageing Dev. 38, 231-243 (1987).
- Longo, V. D., Gralla, E. B., Valentine, J. S. Superoxide dismutase activity is essential for stationary phase survival in Saccharomyces cerevisiae. Mitochondrial production of toxic oxygen species in vivo. J Biol Chem. 271, 12275-12280 (1996).
- Longo, V. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Studies of superoxide dismutase, Ras and Bcl-2 [dissertation]. , University of California Los Angeles. California Los Angeles. (1997).
- Fabrizio, P., Pozza, F., Pletcher, S. D., Gendron, C. M., Longo, V. D. Regulation of longevity and stress resistance by Sch9 in yeast. Science. 292, 288-290 (2001).
- Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2, 73-81 (2003).
- Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer. Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).
- Wei, M. Life span extension by calorie restriction depends on Rim15 and transcription factors downstream of Ras/PKA, Tor, and Sch9. PLoS Genet. 4, e13-e13 (2008).
- Fabrizio, P. Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 166, 1055-1067 (2004).
- Wei, M. Tor1/Sch9-regulated carbon source substitution is as effective as calorie restriction in life span extension. PLoS Genet. 5, e1000467-e1000467 (2009).
- Capizzi, R. L., Jameson, J. W. A table for the estimation of the spontaneous mutation rate of cells in culture. Mutat Res. 17, 147-148 (1973).
- Heidenreich, E., Novotny, R., Kneidinger, B., Holzmann, V., Wintersberger, U. Non-homologous end joining as an important mutagenic process in cell cycle-arrested cells. Embo J. 22, 2274-2283 (2003).
- Heidenreich, E., Wintersberger, U. Replication-dependent and selection-induced mutations in respiration-competent and respiration-deficient strains of Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet. 260, 395-400 (1998).
- Chen, C., Kolodner, R. D. Gross chromosomal rearrangements in Saccharomyces cerevisiae replication and recombination defective mutants. Nat Genet. 23, 81-85 (1999).
- Datta, A., Adjiri, A., New, L., Crouse, G. F., JinksRobertson, S. Mitotic crossovers between diverged sequences are regulated by mismatch repair proteins in Saccaromyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 16, 1085-1093 (1996).
- Madia, F. Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism. J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).
- Wang, Z. Controlled expression of recombinant genes and preparation of cell-free extracts in yeast. Methods Mol Biol. 313, 317-331 (2006).
- Fabrizio, P., Pletcher, S. D., Minois, N., Vaupel, J. W., Longo, V. D. Chronological aging-independent replicative life span regulation by Msn2/Msn4 and Sod2 in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 557, 136-142 (2004).
- Allen, C. Isolation of quiescent and nonquiescent cells from yeast stationary-phase cultures. J Cell Biol. 174, 89-100 (2006).
- Madia, F. Longevity mutation in SCH9 prevents recombination errors and premature genomic instability in a Werner/Bloom model system. J Cell Biol. 180, 67-81 (2008).
Przedruki i uprawnienia
