Badanie zależnej od wieku niestabilności genomu przy użyciu chronologicznego modelu długości życia S. cerevisiae

Podsumowanie

Tutaj opisujemy zestaw testów mutacji DNA, które można połączyć z chronologicznym modelem długości życia drożdży w celu zbadania genów/szlaków, które regulują lub przyczyniają się do niestabilności genomowego DNA podczas starzenia.

Streszczenie

Badania wykorzystujące model starzenia się Saccharomyces cerevisiae odkryły szlaki regulacji długości życia, które są częściowo zachowane u wyższych eukariontów^1-2. Prostota i moc modelu starzenia drożdży może być również badana w celu zbadania uszkodzeń DNA i utrzymania genomu, a także ich wpływu na choroby podczas starzenia. Tutaj opisujemy system do badania zależnych od wieku mutacji DNA, w tym substytucji zasad, mutacji przesunięcia ramki odczytu, dużych rearanżacji chromosomów i rekombinacji homologicznej / homeologicznej, a także aktywności naprawy jądrowego DNA poprzez połączenie chronologicznej długości życia drożdży z prostymi testami uszkodzeń i mutacji DNA. Opisane tu metody powinny ułatwić identyfikację genów/szlaków regulujących niestabilność genomu oraz mechanizmów leżących u podstaw zależnych od wieku mutacji DNA i nowotworów u ssaków.

Protokół

Do badania starzenia się S. cerevisiae użyto dwóch modeli długości życia: RLS i CLS. Replikacyjna (pączkowa) długość życia (RLS) opiera się na obserwacji, że komórki macierzyste drożdży przechodzą skończoną liczbę podziałów^3-6. Skupimy się na chronologicznej długości życia (CLS), modelu opartym na chronologicznym przeżyciu drożdży niedzielących się w kulturze lub na płytkach^7-11. Drożdże typu dzikiego rosną wykładniczo przez 10-12 godzin w pożywce z dekstrozą syntetyczną (SDC). Kiedy poziom glukozy spada, drożdże przechodzą z fermentacji do oddychania, proces ten określa się mianem przesunięcia diaksowego. Komórki kontynuują powolne dzielenie w fazie post-diauxic przez około 48 godzin przed wejściem w zatrzymanie G₀. Tempo metabolizmu komórek utrzymuje się na wysokim poziomie do 5-6 dnia (dzień 0 to dzień inokulacji). Żywotność komórek w czasie można uzyskać za pomocą procentu chronologicznie starzejących się komórek, pobieranych co dwa dni, które mogą opuścić zatrzymanie G₀ i utworzyć kolonie na bogatych płytkach YPED.

1. Chronologiczna długość życia drożdży (CLS) w płynnych kulturach

1. Zaszczepić pojedynczą kolonię w 1 ml syntetycznej pożywki z pełną glukozą (SDC, Tabela 1) i inkubować przez noc z wytrząsaniem (220 obr./min) w temperaturze 30°C. Dla każdego szczepu należy przygotować trzy inokulum z niezależnych kolonii, aby uzyskać repliki biologiczne.
2. Rozcieńczyć kulturę przez noc na świeżej pożywce SDC (zwykle 10 ml) do OD = 0,05-0,1 (rozcieńczenie ̃1:100) i inkubować przez wytrząsanie (220 obr./min) w temperaturze 30°C. Ten punkt czasowy jest uważany za dzień 0 chronologicznego starzenia się. Utrzymuj stosunek objętości kultury do kolby 1:5 (10 ml kultury w 50 ml lub, w przypadku dłuższych/dużych eksperymentów 25 ml kultury w 125 ml), aby zapewnić prawidłowe napowietrzenie.
3. Począwszy od dnia 3, usunąć 2 podwielokrotności po 10 μl z kolby, rozcieńczyć 10 000 razy w wodzie w autoklawie, 10 μl rozcieńczonej kultury (tj. 10^4-10) na płytkach YEPD (1% ekstrakt drożdżowy, 2% pepton baktonowy, 2% dekstroza, 2% agar) i inkubować w temperaturze 30°C przez 48-72 godziny przed zliczeniem unitu tworzącego kolonię (CFU).
4. Dzień 3 CFU jest uważany za 100% przeżycia. Współczynniki rozcieńczenia kultur starzenia w kolejnych dniach powinny być odpowiednio dostosowane, aby zapewnić ̃20-100 kolonii w teście CFU (np. 10^4-10, 10^4-30, 10^3-10 itd.). W przypadku komórek typu dzikiego w tle DBY746 CLS osiąga 1% przeżycia około 11 dnia.

Warianty testu żywotności in situ obejmują:

• Ograniczenie kalorii (CR) przez ograniczenie glukozy. Rozcieńczenie hodowli przez noc w pożywce SC o ograniczonej zawartości glukozy (np. 0,5 lub 0,05% zamiast standardowej 2% glukozy) na ogół prowadzi do niższej gęstości wysycenia populacji w 3 dniu, ale znacznie wydłużyło średnią i maksymalną (10% przeżycia) długość życia¹².
• W przypadku ekstremalnego CR/głodu, przemyj kulturę w fazie stacjonarnej dnia 3 (zwykle 10 ml, jak w kroku 3 powyżej) wodą w autoklawie (ponownie zawieś komórki w równej objętości wody i wiruj z prędkością 2500 obr./min przez 5 minut, powtórz 3 razy). Inkubacja komórek w wodzie naśladuje stan głodu, który drożdże mogą napotkać na wolności. Następnie co dwa dni starzejące się kultury należy przemywać wodą w autoklawie i ponownie zawiesić w równej objętości wody, aby usunąć wszelkie składniki odżywcze uwolnione z lizowanych martwych komórek. Przeprowadzić test żywotności, pobierając próbki kultury starzenia, jak opisano powyżej. Ten stan głodu doprowadzi do prawie podwojenia średniego CLS w dzikim typie DBY746 szczep¹².

2. Test żywotności in situ

W hodowli płynnej, niewielka część komórek, które przeżyły, może ponownie wejść w cykl komórkowy i rosnąć przy użyciu pozostałych składników odżywczych lub tych uwolnionych z lizowanych martwych komórek w pożywce, fenotyp określany jako odrost/sapanie¹³. Opracowaliśmy system żywotności na płytce, który wykorzystuje auksotrofię szczepu DBY746 (trp1) w celu obejścia problemu odrastania/sapania, a także umożliwia testowanie wpływu ciągłej ekspozycji lub pozbawienia różnych zewnętrznych składników odżywczych lub bodźców na drożdże CLS¹¹. Ten test żywotności in situ naśladuje również replikacyjny model długości życia, tak że komórki są stale narażone na obfite składniki odżywcze przez cały czas trwania analizy długości życia.

1. Zaszczepić pojedynczą kolonię w 1 ml syntetycznej pożywki z pełną glukozą (SDC) i inkubować przez noc z wytrząsaniem (220 obr./min) w temperaturze 30°C. Dla każdego szczepu należy przygotować co najmniej trzy inokulum z niezależnych kolonii, aby uzyskać repliki biologiczne.
2. Pozwól kulturze urosnąć do ̃10⁸ komórek/ml (OD₆₀₀ = ̃10), rozcieńczyć kulturę autoklawizowaną wodą do 100-200 komórek/10 μl (zwykle 10^4-krotne rozcieńczenie) i 1,000 komórek/10 μl (10-krotne rozcieńczenie).
3. Umieść dwie podwielokrotności po 10-30 μl rozcieńczonej kultury na jednej płytce SDC z tryptofanem. Dla każdego szczepu przygotuj zestaw od 8 do 20 płytek i oznacz je zgodnie z gęstością posiewu (np. 10 4-krotnie rozcieńczonych, 10 μl lub 10^4-10, 10 4-30, 10^3-10, 10^3-30 itd.), które zapewniają możliwość policzenia 10-100 kolonii w oczekiwaniu na zmniejszoną żywotność podczas starzenia.
4. Inkubować płytkę ustawioną w temperaturze 30°C przez cały czas trwania analizy żywotności.
5. W dniu posiewu, a następnie co 2 dni, należy wyjąć jedną płytkę i dodawać kroplami 0,5 ml tryptofanu (2 mg/ml), aby umożliwić wzrost żywotnych komórek. Inkubować płytkę w temperaturze 30°C przez dodatkowe 48-72 godziny. Policz jtk pod kątem żywotności w dniu dodania tryptofanu. CFU w dniu posiewu uważa się za 100% przeżycia.

Warianty testu żywotności in situ obejmują:

• Komórki starcze na płytkach agarowych (ekstremalny stan głodu). Dodaj 1 ml 2x YPED zamiast tryptofanu w kolejnych dniach, aby umożliwić wzrost i liczbę CFU¹⁴.
• Starzej komórki na płytkach z tryptofanem dropout syntetycznym kompletnym podłożem z różnymi źródłami węgla, np. różnymi stężeniami glukozy (ograniczenie kalorii przez ograniczenie glukozy), różnymi źródłami węgla, takimi jak etanol, glicerol, kwas octowy¹⁴. Dodać 1 ml roztworu glukozy/tryptofanu (20% glukozy i 1 mg/ml tryptofanu), aby umożliwić wzrost i liczbę CFU.
• Inne manipulacje składnikami odżywczymi, takie jak azot.

3. Uszkodzenia DNA i częstotliwość mutacji podczas chronologicznego starzenia

się

Oporność na kanawaninę (Can^r) i sekwencjonowanie can1
Częstość spontanicznych mutacji można ocenić, mierząc częstość występowania oporności na kanawaninę (Can^r) w chronologicznie starzejących się kulturach. Mutacje w genie CAN1 (YEL063), który koduje permeazę argininy w osoczu, sprawiają, że komórki stają się odporne na analog argininy L-kanawaninę.Kolonie mogą być również zachowane w celu ekstrakcji genomowego DNA i późniejszego sekwencjonowania genu CAN1, który może dostarczyć danych o spektrum mutacji (z Mutation Surveyor, SoftGenetics).

Podstawienia (Trp⁺ rewersje)

Szczepy z trp1-289 zawierają bursztynową mutację (C403T) w sekwencji kodującej TRP1. Pomiar częstości powrotu trp1-289 do Trp^{+ 15} pozwala na oszacowanie szybkości substytucji zasad podczas chronologicznego starzenia drożdży.

Mutacje przesunięcia ramki

Szczep Lys^- EH150 (MATa, lys2ΔBglII, trp1-Δ, his3-Δ200, ura3-52, ade2-1o) zawiera mutację lys2ΔBglII, która została skonstruowana przez wstawienie 4 nukleotydów w celu stworzenia miejsca enzymu restrykcyjnego BglII w genie LYS2. Wynikające z tego przesunięcie +4 w otwartej ramce odczytu powoduje auksotrofię lizyny, która może być odwrócona przez małe mutacje insercji/delecji^16-17.

Duże przegrupowania chromosomowe (GCR)

Aby wykryć duże rearanżacje chromosomów (GCR), wygenerowaliśmy zmutowany szczep, w którym HXT13 (YEL069), kodujący wysoce redundantny transporter heksozy, został zakłócony przez kasetę URA3 ¹⁸. HXT13 znajduje się 7,5 kb telomeru do CAN1 na chromosomie V. Mutacje w genach CAN1 i URA3 powodują oporność komórek odpowiednio na L-kanawaninę i kwas 5-fluoroorotyczny (5FOA). Biorąc pod uwagę niską częstość mutacji punktowych, które występują w obu genach, analiza częstości Can^r 5FOA^{r pozwala} oszacować GCR, które powodują utratę obu genów.

Rekombinacja homologiczna i homeologiczna

Aby monitorować poziom homologicznej (100%) i homeologicznej rekombinacji (91%) podczas chronologicznego starzenia, wygenerowaliśmy mutanty, w których linearyzowane plazmidy (HIS3::intron-IR-URA3) mają albo 100% homologiczne odwrócone powtórzenia (IR) (pSR406), albo 91% homeologicznych IR (pSR407) w locus 19 HIS3. Rekombinacja między IR umożliwia ekspresję funkcjonalnego białka His3.

1. Równolegle do normalnego testu żywotności (jak opisano powyżej), należy usunąć odpowiednią ilość komórek z starzejącej się hodowli,
   1. w przypadku mutacji Can^r należy rozpocząć od ̃2x10⁷ komórek (200 μl hodowli dnia 3);
   2. w przypadku rewersji Trp⁺ zacznij od ̃10⁸ komórek (500-1000 μl hodowli dnia 3);
   3. w przypadku mutacji Lys⁺ z przesunięciem ramki odczytu należy rozpocząć od ̃10⁸ komórek (500-1000 μl hodowli dnia 3);
   4. w przypadku GCR należy rozpocząć od 2-3x10⁸ komórek (2-3 ml hodowli dnia 3);
   5. W przypadku rekombinacji homologicznej i homeologicznej należy zacząć od ̃5x10⁷ komórek (200-500 μl hodowli dnia 3);
   dostosować ilość posiewu do spadku całkowitej żywotności i wzrostu częstości mutacji podczas starzenia chronologicznego (Tabela 2). W przypadku szczepów o fenotypie hipermutatora (takich jak te z brakami w naprawie DNA) należy odpowiednio zmniejszyć ilość próbki.
2. Granulować komórki za pomocą wirówki stołowej (6000 obr./min przez 5 min).
3. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml autoklalawowanej wody i ponownie zagnieździć komórki.
4. Zawiesić osad komórkowy w 100 μl wody. Komórki płytkowe,
   1. w przypadku mutacji Can^r na syntetycznych kompletnych płytkach z kroplą argininy (SDC-Arg, uzupełnione 60 μg/ml siarczanu L-kanawaniny);
   2. do odwrócenia Trp⁺, na płytkach z tryptofanem (SDC-Trp);
   3. w przypadku mutacji Lys⁺ z przesunięciem ramki odczytu, na płytkach z zanikającą lizyną (SDC-Lys);
   4. dla GCR, na płytkach z argininą (SDC-Arg) uzupełnionych 5FOA (1 mg/ml) i siarczanem L-kanawaniny (60 μg/ml);
   5. do rekombinacji homologicznej i homeologicznej, na płytkach z histydyną uzupełnioną galaktozą (2%).
5. Policz CFU po 3-4 dniach inkubacji w temperaturze 30°C. Częstość mutacji jest znormalizowana do liczby żywotnych komórek.

Komplementarne do testu żywotności in situ, zależne od wieku odwrócenie Trp⁺, mutacja Lys⁺ z przesunięciem ramki ramki, rekombinacja, lub Can^r mogą być również badane w komórkach starzejących się na płytce.

1. Komórki płytki ( ̃10⁸ komórek / płytkę) na syntetyczne kompletne płytki z pożywką Trp, Lys, His-dropout lub L-kanawaniną (jak opisano powyżej).
2. Co dwa dni (lub w interesującym Cię czasie) zdobywaj punkty dla nowo powstałych kolonii.
3. Częstość mutacji szacuje się poprzez normalizację nowo pojawiających się kolonii do całkowitej liczby żywotnych komórek w danym dniu.

4. Synteza translezji (TLS)

Zależny od wieku wzrost częstotliwości mutacji może wiązać się ze zwiększonym uszkodzeniem makromolekuł, zmniejszoną ochroną/naprawą komórkową i zwiększoną błędną naprawą DNA (taką jak synteza translezji zależnej od Polζ, TLS) podczas starzenia. Na przykład długowieczne mutanty sch9Δ wykazują podwyższoną ekspresję SOD2 i zmniejszoną ekspresję podatnego na błędy enzymu naprawy DNA Rev1²⁰. Tutaj opisujemy test łączący uszkodzoną matrycę DNA i cały ekstrakt jądrowy w celu oceny TLS in vitro.

1. Przygotuj ekstrakt jądrowy zgodnie z opisem Wang i wsp. ²¹; określić ilościowo stężenie białka za pomocą testu BCA (Pierce).
2. Dodać 0, 5, 10 lub 20 μg ekstraktów jądrowych do 50 μl (objętość końcowa) reakcji zawierających bufor TLS (20 mM HEPES, 7 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 25 mM NaCl, pH 7,8), 200 μMdNTP i 100 nM 12-merowy starter znakowany 5'-³²P (5'-CGA TGG TAC GGA-3') wyżarzony do 48-merowej matrycy zawierającej uszkodzenie DNA będące przedmiotem zainteresowania (5'-TCG ATA CTG, GTA CTA ATG ATT AAC GAC TXA AGC ACG TCC GTA CCA TCG-3', w którym X oznacza uszkodzone miejsce, np. abasic site, 8-oxo-G, itd.).
3. Inkubować mieszaninę w temperaturze 30 °C przez 30 minut, zakończyć reakcję dodatkiem 2,5 μl EDTA (20 mM) i 2 μl proteinazy K (10 mg/ml).
4. Oczyść DNA za pomocą ekstrakcji fenolu i wytrącania etanolu.
5. Ponownie zawieś DNA w 50 μl żelowego buforu ładującego (98% formamidu, 20 mM EDTA i barwnika).
6. Rozpuścić produkty syntezy translezji na 19% żelach poliakrylamidowych.
7. Określ ilościowo TLS za pomocą obrazowania fosforowego (rysunek 1).

5. Reprezentatywne wyniki

Zazwyczaj używaliśmy zliczeń CFU w dniu 3 jako 100% przeżycia w standardowej analizie CLS cieczy. Procentowe przeżycie w kolejnych dniach można dopasować do obliczenia średniej (50% przeżycia) i maksymalnej (10% przeżycia) długości życia¹². Wyniki dotyczące długości życia uzyskane z testu żywotności in situ są na ogół zgodne z wynikami testu CLS w płynie, ale ze zmniejszoną średnią długością życia, co częściowo wynika z faktu, że komórki są stale narażone na działanie składników odżywczych. Obecność glukozy hamuje aktywność ochrony komórkowej, o czym świadczy zmniejszona transaktywacja czynnika transkrypcyjnego odpowiedzi na stres, takiego jak Msn2/4 i Gis1¹².

Częstotliwość mutacji zależna od wieku różni się znacznie w zależności od tła szczepu, manipulacji genetycznej, warunków hodowli i wieku. Tabela 2 przedstawia typowe wyniki uzyskane w szczepie typu dzikiego (DBY746).

Składnik g/L D-glukoza 20 Siarczan amonu 5 Zasada azotowa (-AS/-AA) 1.8 NaH2PO4 powiedział: 1.4   mg/L adenina Rozdział 80 L-arginina Rozdział 40 Kwas L-asparaginowy 100 szt. Kwas L-glutaminowy 100 szt. L-histydyna Rozdział 80 L-izoleucyna 60 Rozdział L-leucyna 120 szt. L-lizyna 60 Rozdział L-metionina Rozdział 80 L-fenyloalanina 60 Rozdział L-seryna 400 szt. L-treonina 200 szt. L-tryptofan Rozdział 80 L-tyrozyna Rozdział 40 L-walina 150 szt. Uracyl Rozdział 80

Tabela 1. Syntetyczna kompletna pożywka glukozowa, SDC (dostosować do pH 6,0 z NaOH). 4-krotny nadmiar histydyny, leucyny, tryptofanu i uracylu jest uwzględniony w celu kompensacji auksotrofii szczepu DBY746.

Dzień 3 (średnia ± SEM) Do (podczas leżakowania) Czy^r r 1,76 ± 0,12 ^x10-6 6-8 ^x10-6 Odwrócenie Trp⁺ 6,60 ± 1,70 ^x10-8 1,60 ^x10-6 Mutacja Lys⁺ z przesunięciem ramki 3,00 ± 0,78 ^x10-8 0,70 ^x10-6 GCR 0,62 ± 0,10 ^x10-8 0,30 ^x10-6 Rekombinacja homologiczna 5,55 ± 2,74 ^x10-6 27,00 ^x10-6 Rekombinacja homeologiczna 0,12 ± 0,04 ^x10-6 0,48 ^x10-6

Tabela 2. Typowe częstości mutacji komórek typu dzikiego (DBY746) podczas starzenia chronologicznego.

Rysunek 1. Wynik syntezy translezji (TLS)²⁰. Ekstrakty jądrowe z 3-dniowych zmutowanych komórek typu dzikiego (DBY746) i sch9Δ w fazie stacjonarnej inkubowano z nieuszkodzonymi lub zasadowymi matrycami DNA zawierającymi miejsce przez 30 minut w temperaturze 30°C. Produkty TLS są oznaczone liniami stałymi (z nieuszkodzoną matrycą) lub przerywanymi (z uszkodzoną matrycą). Nie zaobserwowano syntezy translezji w ekstrakcie jądrowym z mutantów sch9Δ. Wolne startery są oznaczone otwartą strzałką.

Dyskusja

Ciekłe kultury starzejące się czasami wykazują fenotyp¹³ odrastania/dyszenia, co komplikuje analizę CLS. Odrost zwykle następuje, gdy ponad 90-99% populacji utraciło zdolność do życia. Ten fenotyp jest często związany ze zwiększonym stresem oksydacyjnym i/lub zmniejszoną ochroną w komórce. Na przykład częstość występowania tego fenotypu wzrasta ponad dwukrotnie w komórkach pozbawionych cytozolowej dysmutazy ponadtlenkowej i znacznie zmniejsza się w przypadku długowiecznych mutantów (np. sch9Δ lub ras2Δ) lub mutantów z nadekspresją dysmutaz ponadtlenkowych²². W praktyce definiujemy odrost jako wzrost żywotności lub stabilizację żywotności przez 3 kolejne próbki w fazie wysokiej śmiertelności podczas starzenia chronologicznego.

Zależne od wieku częstości występowania różnych mutacji DNA różnią się znacznie w zależności od tła szczepu, manipulacji genetycznej, warunków hodowli, a także odrastania/sapania i wyjątkowo niskiej przeżywalności. Doświadczenia wstępne powinny być przeprowadzane w punktach czasowych, takich jak średni i maksymalny czas przeżycia przy różnej gęstości posiewu dla testów mutacji, w celu określenia zakresu częstości mutacji przed przeprowadzeniem analizy długości życia w pełnej skali. Szczep typu dzikiego powinien być zawsze uwzględniany w badaniu długości życia lub częstości mutacji równolegle z jakimkolwiek badaniem lub mutantem genetycznym, tak aby można było uwzględnić różnice między eksperymentami. Do badania należy włączyć wiele replik biologicznych; W celu potwierdzenia wyników należy przeprowadzić zarówno testy żywotności/mutacji w płynie, jak i in situ .

Zamiast skupiać się na jednym konkretnym typie mutacji DNA, profilowanie zależnej od wieku niestabilności genomu przy użyciu wielu testów w połączeniu może rzucić światło na specyficzne uszkodzenia DNA i systemy naprawy uszkodzeń DNA, które przyczyniają się do zależnej od wieku niestabilności genomu. Na przykład znaczny wzrost dużych rearanżacji chromosomowych (GCR) w porównaniu z innymi mutacjami DNA obserwuje się u drożdży typu dzikiego, co sugeruje zwiększenie pękania podwójnej nici i / lub upośledzenie niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) podczas chronologicznego starzenia drożdży (Tabela 2). Spektrum mutacji can1 (sekwencjonowanie genu CAN1 ) uzyskane u starzejących się drożdży typu dzikiego sugerowało wzrost uszkodzeń oksydacyjnych podczas starzenia chronologicznego i podatną na błędy naprawę DNA; podczas gdy w długożyciowych mutantach sch9Δ zaobserwowano mniej oksydacyjnych uszkodzeń DNA i znacznie zmniejszoną syntezę translezji podatną na błędy²⁰.

Opisane tutaj metody mogą być dalej rozwijane do badania zależnej od wieku niestabilności genomu. Na przykład komórki w stanie spoczynku i bez stanu spoczynku można wyizolować z kultur drożdży w fazie stacjonarnej przy użyciu metody gradientu gęstości opisanej przez Allena i wsp. ²³. W połączeniu z opisanymi tutaj testami mutacji donieśmy , że duża część mutacji zależnych od wieku powstaje z komórek w stanie spoczynku, a nie z komórek dzielących się, uszkodzonych lub apoptotycznych^20,24.