Artykuł metodologiczny

Transfer zarodka do królika: procedura transferu zarodków pod kontrolą laparoskopii do jajowodu owulującego biorcy modelu królika

8 lipca 2025

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Garcia-Dominguez, X. et al., Minimalnie inwazyjny transfer zarodków i witryfikacja zarodków w optymalnym stadium zarodka w modelu królika. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film opisuje technikę transferu zarodków do jajowodu samicy biorcy za pomocą laparoskopii. Umożliwia przebudowę zarodka u królików podczas jego migracji przez jajowód, ostatecznie pomagając w udanej implantacji. Technika ta może być również stosowana w przypadku przechowywanych zarodków z dobrą wydajnością.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transfer zarodków

  1. Przygotowanie samic biorczyni
    1. Używaj tylko dojrzałych płciowo samic (> 4,5 miesiąca życia).
    2. Na tydzień przed ET przystosuj samice do reżimu 16 godzin światła/8 godzin ciemności, aby zainicjować wzrost pęcherzyków jajnikowych i zwiększyć podatność kobiet.
    3. Wybierz samice biorczy, obserwując jędrność i kolor sromu. Jeśli srom jest jędrny i czerwonawy, samica jest otwarta.
    4. Wywołać ciążę rzekomą (owulację) przez pojedyncze wstrzyknięcie domięśniowe 1 μg octanu busereliny (syntetyczny analog hormonu uwalniającego gonadotropiny) niezależnie od masy ciała.
      UWAGA: Zwykle 0,8 μg jest odpowiednią dawką do indukcji owulacji u królików średniej wielkości (4-5 kg), więc 1 μg generalnie gwarantuje owulację.
    5. Owulację należy wywołać na tyle dni przed czasem, ile wynosi wiek zarodków, które mają być transferowane (na przykład 70-72 godziny przed świeżą morulą ET).
  2. Znieczulenie i analgezja
    1. Zważ królika i załaduj następujące środki znieczulające i przeciwbólowe.
      1. W strzykawce o pojemności 1 ml z igłą 30G: wsypać ksylazynę (5 mg/kg) i chlorowodorek buprenorfiny (0,03 mg/kg). Do kolejnej strzykawki o pojemności 1 ml z igłą okołoczaszkową 23 G właduj chlorowodorek ketaminy (35 mg/kg).
    2. Trzymać królika i wstrzykiwać domięśniowo mieszaninę ksylazyny i buprenorfiny.
    3. Wprowadzić igłę okołoczaszkową z ketaminą do żyły ucha brzeżnego, powoli wprowadzając dożylnie całą zawartość strzykawki.
    4. Zamocuj igłę i pozostaw ją włożoną przez pozostałe kroki, aby w razie potrzeby podać więcej znieczulenia.
    5. Pozostaw królika w klatce (czystej i bez żadnych innych zwierząt) na ciepłym etapie.
    6. Po utracie przytomności nałóż maść do oczu, aby uniknąć suchości oka i sprawdź, czy nie ma odruchu fressa powiekowego.
      nuta: Protokół ten przewiduje znieczulenie chirurgiczne przez minimum 30 minut. Jeśli wymagany jest dłuższy czas, po 30 minutach wstrzyknąć dodatkowe dawki z połową ilości chlorowodorku ketaminy opisanej w ppkt 1.2.1.
    7. Monitoruj głębokość znieczulenia, sprawdzając odruch pedałowania i ruch oddechowy. Zmiany w rytmie oddychania na nieregularne i szybsze wskazują na utratę właściwej płaszczyzny znieczulenia.
    8. Monitoruj kolor błon śluzowych (oczy, usta itp.), częstość oddechów (30-60 oddechów na minutę), tętno (120-325 uderzeń na minutę) i temperaturę odbytu (38-39,6 °C).
    9. Osiem godzin przed transferem wstrzymaj jedzenie od zwierząt, aby uniknąć większego rozmiaru jelita i aktywności do czasu zakończenia procesu ET. Pozostaw swobodny dostęp do wody.
  3. Przygotowanie zarodków
    1. Podgrzać pożywkę do manipulacji zarodkami do temperatury 25 °C: Pożywka bazowa (BM), składająca się z soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco uzupełnionej 0,2% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej.
    2. Pracując pod mikroskopem stereoskopowym, przepłucz świeże lub rozmrożone (Krok 2) zarodki za pomocą BM.
    3. Używając sterylnych rękawiczek, podłącz odpowiednio skonfigurowany cewnik zewnątrzoponowy 17G do strzykawki o pojemności 1 ml.
    4. Odessać 1 cm BM do cewnika, a następnie wprowadzić mały pęcherzyk powietrza.
    5. Odessać 5-7 zarodków w objętości 10 μl BM, a następnie kolejny mały pęcherzyk powietrza.
    6. Zakończ ładowanie cewnika, odsysając 1 cm BM.
  4. Transfer zarodków
    1. Rozważ użycie sterylnych rękawiczek, fartucha i maski, aby zapewnić aseptyczne środowisko.
    2. Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne, oczyść powierzchnie, na których zostanie przeprowadzona operacja, i przetrzyj je 70% etanolem.
    3. Wykonaj znieczulenie zgodnie z wcześniejszymi opisami (krok 1.2), sprawdzając, czy nie ma utraty odruchów.
    4. Ogol futro z brzusznej części brzucha za pomocą elektrycznej maszynki do golenia.
    5. Przygotować brzuszną część brzucha aseptycznie.
      1. Oczyść obszar operacyjny i usuń wszelkie pozostałe włosy. Umyj obszar operacyjny mydłem z glukonianu chlorheksydyny. Zdezynfekuj obszar roztworem chlorheksydyny i etanolem 96º (3 razy).
    6. Umieść zwierzę na ciepłym stole chirurgicznym, w pozycji Trendelenburga (głowa w dół pod kątem 45°), aby upewnić się, że żołądek i jelita znajdują się w czaszce. Rozważ ewakuację pęcherza, jeśli jest jędrny. Jeśli jakiekolwiek wnętrzności zostaną uszkodzone w tym procesie, zwierzę może umrzeć. Dlatego ważne jest, aby były one odpowiednio rozmieszczone (rysunek 1).
    7. Przykryj obszar sterylnym ręcznikiem, z otworem (okienkiem) odsłaniającym ogolony obszar, aby oddzielić pole operacyjne od wszelkich potencjalnych obszarów zanieczyszczających.
    8. Wprowadzić jeden endoskopowy trokar 5 cm do jamy brzusznej, 2 cm doogonowo do wyrostka mieczykowatego i wprowadzić przez niego jamę otrzewnową za pomocą mechanicznego insulatatora regulującego ciśnienie.
      nuta: Ciśnienie w jamie brzusznej powinno wynosić 8-12 mmHg z CO2 (ryc. 1A).
    9. Przełóż kamerę endoskopową przez endoskopowy trokar (ryc. 1B).
      UWAGA: Zidentyfikuj układ rozrodczy, określając stan i położenie lejka i bańki przed ET, aby ułatwić kolejne kroki.
    10. Wbić igłę zewnątrzoponową 17-G w okolicę pachwinową w odległości 2-3 cm od lejka (ryc. 1B).
    11. Zidentyfikuj wejście do lejka (ryc. 2A, 2B).
    12. Wprowadzić załadowany cewnik (krok 1.3) przez igłę zewnątrzoponową do jamy brzusznej (Rysunek 1C).
    13. Zlokalizuj jajowód i wprowadź 1-2 cm cewnika zewnątrzoponowego przez lejek w bańce (ryc. 2A-2C). Nie wchodź zbyt daleko w jajowód, aby zapobiec uszkodzeniom i krwotokowi.
    14. Uwolnij zarodki do jajowodu, delikatnie naciskając tłok strzykawki sprzężonej z cewnikiem (ryc. 2D-2F). Oba pęcherzyki powietrza muszą opuścić cewnik.
    15. Wyjmij cewnik zaraz po uwolnieniu zarodków.
    16. Przepłukać cewnik, zasysając i uwalniając pożywkę manipulacyjną, aby sprawdzić, czy zarodki nie są dostępne i potwierdzić ich pomyślne przeniesienie.
    17. W razie potrzeby powtórz kroki od 1.4.11 do 1.4.16 po drugiej stronie macicy.
    18. Usuń igłę zewnątrzoponową i kamerę endoskopową.
    19. Uwolnij CO2 przez endoskopowy trokar. Jeśli nadmiar gazu pozostanie w jamie brzusznej zwierzęcia, będzie odczuwać ból i dyskomfort.
    20. Usuń endoskopowy trokar z jamy brzusznej. Zdejmij ręcznik chirurgiczny.
    21. Przerwij znieczulenie.
    22. Oczyścić nacięcie wykonane przez trokar roztworem chlorheksydyny. Zamknij nacięcie wykonane przez trokar za pomocą mikronizowanego aluminium i plastikowego opatrunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Rycina 1: Laparoskopowy transfer zarodków wspomagany laparoskopią (widok zewnętrzny).A) Wprowadzenie trokaru endoskopowego (jeden port). B) Wprowadzenie kamery endoskopowej i igły zewnątrzoponowej (strzałka). C) Wprowadzenie cewnika do transferu zarodków (biała strzałka) przez igłę zewnątrzoponową.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Firma VWR332
Chlorowodorek buprenorfinyAlvet Escartí 626Na zamówienie licencjonowanego lekarza weterynarii.
Octan buseeliny Sigma Aldrich Zobacz materiał B3303
Stężenie CO2 Air Liquide Numer katalogowy: 99921CO2 N48.
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco Sigma AldrichZobacz materiał D5773 Bez chlorku wapnia
Elektryczna maszynka do golenia Oster Złoty A5 Numer katalogowy: 078005-140-002
Kamera endoskopowa Optomic Hiszpania S.AOP-714
Trokar endoskopowy z silikonowym zaworem ulotkowym Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.30114GK Lekki model trokara.
Mydło z diglukoniianem klorheksydyny Alvet Escartí0265DCCJ500B
Igła Epicraneal 23GAlvet Escartí514056353 Można również użyć mniejszych igieł.
Cewnik zewnątrzoponowy Korporacja Vygon187,1
Igła zewnątrzoponowa Korporacja Vygon187,1
Maść do oczu Alvet Escartí 5273
Sprzęt do laparoskopii Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 26003 AA ® Laparoskop Hopkinsa, laparoskop prosty 0º mm, długość 30 cm, kanał roboczy 5 mm.
Źródło światła Optomic Hiszpania S.AFibrolux 250
Mechaniczny wdmuchiwacz CO2 Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.Endoflator (Endoflator)®
Silikonowa rurka do insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.20400040
Mikroskop stereoskopowy Księga Leica MZ16F Istnieją tańsze opcje, takie jak Leica MZ8 lub Nikon SMZ-10 lub SMZ-2B, żeby wymienić tylko kilka.
Króliki Universitat PolitĨcnica de València Linia AMożna stosować inne linie matczyne, takie jak Line V lub Line HP.
Rozdział SZT. pkt. pkt. Rozdział

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wstrzykni cie do jajowoduimplantacja zarodkaindukcja pseudoci ycewnik epiduralnywizualizacja endoskopowaampulla jajowoduwprowadzanie zarodk w

Powiązane artykuły