Artykuł metodologiczny

Narzędzia do edycji zasad za pośrednictwem CRISPR: technika edycji genomu w celu wywołania ukierunkowanej substytucji zasad

8 lipca 2025

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Patrz, J. E., et al. Ocena funkcjonalna wariantów BRCA1 przy użyciu edytorów bazowych za pośrednictwem CRISPR. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film wyjaśnia koncepcję edytorów zasad cytozynowych za pośrednictwem CRISPR do indukowania celowanej substytucji nukleotydów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tworzenie wariantów BRCA1 za pomocą narzędzi do edycji bazy za pośrednictwem CRISPR

UWAGA: Jeśli linie komórkowe HAP1-BE3 nie są używane, plazmidowe DNA kodujące BE3 może być transfekowane z gRNA ukierunkowanym na BRCA1. W porównaniu do kotransfekcji plazmidów BE3 i gRNA, transfekcja plazmidu gRNA do komórek HAP-BE3 indukuje wydajną edycję zasad do 3-krotnie w docelowym locus w naszych rękach.

  1. Zasiew: 5 x 105 komórek HAP1-BE3 (lub komórek HAP1 w przypadku metod kotransfekcji) na basenik na płytkach 24-dołkowych na 1 dzień przed transfekcją. W czasie transfekcji hoduje się komórki, aby osiągnęły odpowiednią gęstość (konfluencja 70%–80%).
  2. Transfekcja gRNA ukierunkowana na BRCA1 przy użyciu zakupionych odczynników do transfekcji (Tabela Materiałów) zgodnie z protokołem producenta. Użyj 1 μg gRNA ukierunkowanego na BRCA1 (z 1 μg plazmidowego DNA kodującego BE3 w przypadku metod kotransfekcji) do indukcji konwersji C:G do T:A w miejscach docelowych BRCA1. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i hodować subkultury co 3–4 dni.
  3. Zbierz granulki komórek 3, 10 i 24 dni po transfekcji, aby przeanalizować wydajność edycji bazy (próbki z 3 dni po transfekcji są analizowane ponownie jako próbki dnia 0).
  4. Ekstrakcja genomowego DNA za pomocą zestawu do oczyszczania genomowego DNA (tabela materiałów).
    UWAGA: Zalecamy optymalizację warunków transfekcji ze zmiennym stosunkiem odczynnika do DNA. Optymalnym warunkiem do transfekcji HAP1 jest stosunek odczynnika do DNA w proporcji 4:1 w naszych rękach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Lipofektamina 2000 Thermo Fisher Naukowy 11668027Odczynnik do transfekcji
Opti-MEM Gibco (firma Gibco) 31985070Materiały transfekcyjne
Odczynnik do transfekcji FuGENE HD Preparat Promega E2311 Odczynnik do transfekcji
Zmodyfikowany medium Dulbecco firmy Iscove Gibco (firma Gibco) 12440046Pożywka dla komórek HAP1
lentiCas9-Blast Addgene powiedział: Numer katalogowy: 52962DNA plazmidów do klonowania lentiBE3
Zestaw do badania krwi i tkanek DNeasyQiagen powiedział:Numer katalogowy: 69504Zestaw do przygotowania genomowego DNA
powiedział:

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Edycja zasad CRISPRedytor zasad cytydynowychcelowanie w gen BRCA1projektowanie gRNAtransfekcja lentiwirusowaekstrakcja genomowego DNAwydajno edycji zasadkom rki HAP1 BE3endonukleaza Cas9cytydynowa deaminaza

Powiązane artykuły