Indukowalna regulacyjna ekspresja genów oparta na systemie Tet-On in vivo: indukowany tetracykliną system ekspresji genów do aktywacji transkrypcji genu docelowego w modelu mysim

Streszczenie

Źródło: Hübner, E. K. et al.Konstytutywne i indukowalne systemy do genetycznej modyfikacji in vivo mysich hepatocytów za pomocą hydrodynamicznej iniekcji żyły ogonowej. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje system ekspresji genów tetracykliny lub Tet-On w modelu mysim. W obecności doksycykliny, pochodnej tetracykliny, system Tet-On składający się z białka transaktywatora kontrolowanego przez odwróconą tetracyklinę ulega aktywacji i ulega ekspresji interesującego genu.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Indukcja ekspresji genu zależnego od tetracykliny lub shRNA

UWAGA: Doksycyklina może być szkodliwa. Proszę zapoznać się z kartą charakterystyki.

UWAGA: W zależności od rodzaju i czasu trwania eksperymentu, doksycyklina może być dostarczana do wody pitnej.

1. W przypadku eksperymentów krótkoterminowych (<10 dni) należy podawać doksycyklinę z wodą pitną, stosując następujący protokół.
   1. Rozpuść 5 g sacharozy w 100 ml wody z kranu. Autoklaw.
   2. Rozpuścić 100 mg hykulanu doksycykliny w 5 ml roztworu sacharozy (krok 1.1.1) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
   3. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml sterylnie przefiltruj roztwór przez filtr 0,2 μm. Dodać do roztworu sacharozy przygotowanego w kroku 1.1.1.
   4. Dostarczyć myszowi roztwór doksycykliny i sacharozy jako wodę pitną. Sprawdzaj codziennie i wymieniaj, gdy roztwór stanie się mętny, co wskazuje na przerost bakterii (wymień klarowny roztwór najpóźniej po trzech dniach).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
D(+)-sacharoza	Carla Rotha	4621.1	Do słodzenia roztworu doksycyliny
Hykulan doksycykliny	Zastosowanie	Certyfikat A2951,0025	Aktywacja ekspresji zależnej od tetracykliny
Injekt 10 ml Strzykawka	Braun	4606108V
Filtropur S 0.2	Sarstedt	Numer katalogowy: 831.826.001	Do filtracji doksycykliny

powiedział: