Edycja genów za pośrednictwem transpozonów PiggyBac w ludzkich iPSC: procedura integracji genu zainteresowania w ludzkich iPSC za pomocą systemu transpozonów PiggyBac

Streszczenie

Źródło: Garone, M. G. et al. Konwersja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w funkcjonalne neurony ruchowe rdzenia kręgowego i czaszki za pomocą wektorów PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film demonstruje procedurę generowania neuronów ruchowych poprzez transfekcję ludzkich iPSC za pomocą systemu transpozonów PiggyBac poprzez ektopową ekspresję czynników transkrypcyjnych specyficznych dla linii.

Protokół

1. Generowanie indukowalnych linii iPSC NIL i NIP

1. Transfekcja komórek
   1. Przepłukać komórki PBS (wolne od Ca²⁺ / Mg²⁺).
   2. Dodać odczynnik do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) (0,35 ml dla szalki o średnicy 35 mm) i inkubować w temperaturze 37 °C, aż pojedyncze komórki zostaną
   3. oddzielony (5-10 min).
   4. Delikatnie zakończ separację komórek, pipetując w górę i w dół pipetorem P1000 3-4 razy.
   5. Zebrać w probówce o pojemności 15 ml i dodać PBS (wolny od Ca^{2+ /} Mg^{2 +}) do 10 ml. Policz komórki.
   6. Osad 10⁶ ogniw i ponownie zawiesić w 100 μl buforu R (dołączonego do zestawu do elektroporacji ogniw, patrz tabela materiałów).
   7. Dodaj plazmidowe DNA do transfekcji: 4,5 μg wektora transpozycyjnego (epB-Bsd-TT-NIL lub epB-Bsd-TT-NIP) i 0,5 μg plazmidu transpozazy piggyBac.
   8. Transfekcja za pomocą systemu elektroporacji ogniw (patrz Tabela Materiałów) zgodnie z instrukcją producenta o następujących parametrach: napięcie 1 200 V, szerokość 30 ms, 1 impuls. Wysiewać komórki w ludzkiej pożywce iPSC uzupełnionej 10 μM Y-27632 (inhibitor ROCK, patrz tabela materiałów) w naczyniu pokrytym matrycą o średnicy 6 mm.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
B27	Miltenyi Biotec	130-093-566	Suplement bez surowicy do utrzymania komórek neuronalnych
Bambanker (Bambanker)	Genetyka Nippon	NGE-BB02	Pożywka do zamrażania komórek progenitorowych neuronów ruchowych
CaCl2	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C3881	Chemikalia do roztworów elektrofizjologicznych
Corning Matrigel z certyfikatem hESC Matrix	Corning	354277	Odtworzony preparat błony podstawnej z mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Służy do klejenia iPSC do podłoży plastikowych i szklanych
POŻYWKI DO ZAMRAŻANIA CRYOSTEM ACF	Przemysł biologiczny	05-710-1E	Pożywka do zamrażania ludzkich komórek iPS
Rozpuść	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 17105-041	Odczynnik do delikatnej dysocjacji ludzkich iPSC
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Podstawowa pożywka do hodowli komórkowej
Doksycyklina	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Służy do indukowania ekspresji transgenów z wektorów epB-Bsd-TT-NIL i epB-Bsd-TT-NIP
DS2U	WiCell (komórka WiCell)	UWWC1-DS2U	Komercyjna linia iPSC dla ludzi
Certyfikat GDNF	PrzedproTech	450-10	Czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego
Linia Gibco Episomal hiPSC	Thermo Fisher Naukowy	A18945	Komercyjna linia iPSC dla ludzi
Hepes	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał H4034	Chemikalia do roztworów elektrofizjologicznych
Laminina	Sigma-Aldrich	11243217001	Wspomaga przyczepianie się i wzrost komórek nerwowych in vitro
NEAA (Agencja Zdrowia)	Thermo Fisher Naukowy	11140035	Aminokwasy endogenne. Stosowany jako suplement do pożywki do hodowli komórkowych w celu zwiększenia wzrostu i żywotności komórek.
Zestaw Neon 100 μL	Thermo Fisher Naukowy	MPK10096	Zestaw do elektroporacji ogniw
System transfekcji neonów	Thermo Fisher Naukowy	MPK5000	System elektroporacji ogniw
Podłoże nerwowo-podstawowe	Thermo Fisher Naukowy	21103049	Pożywka podstawowa przeznaczona do długotrwałego utrzymania i dojrzewania populacji komórek neuronalnych bez konieczności stosowania warstwy zasilającej astrocyty
NutriStem-XF/FF	Przemysł biologiczny	05-100-1A	Pożywka hodowlana iPSC u ludzi
PBS Ca2+/Mg2+ wolny	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Bufor fosforanowy Dulbecco, bez wapnia, bez magnezu
Penicylina/Streptomycyna	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Roztwór penicyliny/streptomycyny stosowany w celu zapobiegania zanieczyszczeniu kultur komórkowych przez bakterie.
Y-27632 (inhibitor ROCK)	Nauki przyrodnicze Enzo	ALX-270-333-M005	Przepuszczalny przez komórkę selektywny inhibitor kinazy białkowej zawierającej zwiniętą cewkę (ROCK) związaną z Rho. Zwiększa przeżywalność iPSC

szt.