1. Przygotowanie i roztworów
UWAGA: Wszystkie i rozwiązania użyte w protokole są podsumowane w Tabeli 1. Podane objętości są wystarczające do przygotowania i przeprowadzenia 10 próbek. Wszystkie mogą być przechowywane w temperaturze +4 °C przez okres do jednego roku.
- Przygotować 20 ml 3x buforu żelowego zawierającego 1,5 M kwasu aminokapronowego, 150 mM Bis-tris w wodzie destylowanej (dH2O). Dostosuj pH do 7,0.
- Przygotować 10 ml 2 M kwasu aminokapronowego w dH2O.
- Przygotuj 1 ml buforu mitochondrialnego, łącząc następujące elementy: 0,5 ml 3x buforu żelowego, 0,5 ml 2 M kwasu aminokapronowego i 4 μl 500 mM EDTA.
- Przygotować 1 000 ml buforu katodowego zawierającego 15 mM Bis-tris i 50 mM trycyny w dH2O. Dostosować pH do 7,0.
- Przygotować 200 ml buforu z niebieską katodą, dodając 0,04 g niebieskiego G-250 Coomassie do 200 ml buforu katodowego.
- Przygotować 1 000 ml buforu anodowego zawierającego 50 mM Bis-tris w dH2O. Dostosować pH do 7,0.
- Przygotować 2,5 ml buforu do próbek zawierającego 750 mM kwasu aminokapronowego i 5% błękitu Coomassie G-250 w dH2O.
2. Przygotowanie lizatów mitochondrialnych
- Umieść komórki na płytce dzień przed pobraniem. W przypadku komórek HEK293 lub 143B należy użyć zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% L-glutaminą, 100 mg/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny. Hodować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze +37 °C w atmosferze nawilżonej 5% CO2 . Upewnij się, że w dniu pobrania na każdą próbkę przypada co najmniej 500 000 komórek.
- Delikatnie umyj komórki raz lodowatym PBS. Unikaj odrywania komórek od płytki. Zeskrobać komórki i granulować je w temperaturze 800 x g przez 10 minut w temperaturze +4 °C.
- Przemyć osad komórkowy dwukrotnie lodowatym PBS i odwirować jak w kroku 2.2. Zmierz stężenie białka metodą Bradforda za pomocą komercyjnego zestawu. Granulować komórki w temperaturze 800 x g przez 10 minut w temperaturze +4 °C.
nuta: Po pobraniu komórek wykonaj wszystkie kroki w temperaturze +4 °C i nie wiruj.
- Przygotuj 20 ml PBS z inhibitorem proteazy, dodając 200 μl 100x inhibitora proteazy do 20 ml PBS. Trzymaj na lodzie. Zawiesić komórki w PBS z inhibitorem proteazy do końcowego stężenia białka 5 mg / ml.
- Aby obliczyć objętość PBS z inhibitorem proteazy potrzebną do ponownego zawieszenia komórek w dawce 5 mg/ml, należy obliczyć ilość białka w każdej próbce. Do tego obliczenia należy wykorzystać stężenie białka zmierzone w kroku 2.3 oraz objętość PBS użytą do ponownego zawieszenia komórek po myciu w kroku 2.3.
- Przygotuj 1 ml 3,3 mM digitoniny w PBS z inhibitorem proteazy. Dodać 3,3 mM digitoniny do końcowego stężenia 1,65 mM. Dobrze wymieszaj i inkubuj na lodzie przez 5 minut.
- Aby przygotować 1 ml 3,3 mM digitoniny w PBS z inhibitorem proteazy, rozpuścić 4 mg digitoniny w 1 ml PBS w temperaturze 100 °C do momentu, gdy nie będzie widoczny osad i natychmiast schłodzić na lodzie. Dodać 10 μl 100x inhibitora proteazy do 1 ml roztworu digitoniny.
nuta: Stosować wyłącznie świeży roztwór digitoniny.
ostrożność: Digitonina jest toksyczna! Używaj maski na twarz, rękawiczek i fartucha laboratoryjnego.
- Dodać PBS z inhibitorem proteinazy (przygotowanym w kroku 2.4) do końcowej objętości 1,5 ml. Wirować przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze +4 °C. Usunąć supernatant. Na tym etapie mitochondria są granulowane.
- Ponownie zawiesić osad mitochondrialny w buforze mitochondrialnym. Objętość buforu mitochondrialnego stanowi połowę objętości PBS w kroku 2.4.
- Przygotować świeży 10% maltozyd laurylowy w PBS zawierający inhibitor proteazy (przygotowany w kroku 2.4). 1 ml wystarcza na 10 próbek. Dodać 10% maltozydu laurylu do końcowego stężenia 1%. Inkubuj na lodzie przez 15 minut (ten krok może być dłuższy do kilku godzin).
- Wirować przy 20 000 x g przez 20 minut w temperaturze +4 °C. Zebrać supernatant do nowej probówki. Zmierz stężenie białka metodą Bradforda za pomocą zestawu. Dodać bufor próbki, objętość stanowiącą połowę objętości maltozydu laurylowego użytego w kroku 2.8. Próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy.
3. Przygotowanie żelu gradientowego dla BN-PAGE
- Wlać żel gradientowy do BN-PAGE w temperaturze pokojowej. Umieść ekspres do gradientu na płytce mieszającej i podłącz go elastyczną rurką do pompy perystaltycznej. Podłączyć zestaw do infuzji z igłą do rurki. Umieść mieszadło magnetyczne w proksymalnej komorze ekspresu gradientu. Myć rurki za pomocądH2O przy maksymalnej prędkości obrotowej pompy przez 10 minut.
- Opróżnij rurkę i ekspres do gradientów. Za pomocą pipety usunąć resztki dH2O w kanale między komorami urządzenia do tworzenia gradientów. Zamknij kanał i rurkę za pomocą zaworu.
- Za pomocą ramy odlewniczej i zacisków zmontuj dwie szklane płytki w uchwycie, który ma otwór na dole, i umieść go na stojaku. Upewnij się, że znajduje się mniej więcej na prostej powierzchni z bilansem wodnym. Umieść igłę podłączoną do rurki między szklanymi płytkami.
- Przygotować 6% i 15% roztwory żelu (Tabela 2). Trzymaj na lodzie. Na końcu dodać nadsiarczan amonu (APS) i tetrametylenodiaminę (TEMED) (rozpoczynają polimeryzację). Delikatnie wymieszaj, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza.
- Załaduj proksymalny koniec komory rurkowej mieszalnika z gradientowym żelem 6% żelu, a dystalny koniec 15% żelu. Całkowita objętość żelu powinna być równa objętości żelu rozdzielającego między szklanymi płytkami. Dlatego użyj 2,6 ml 6% żelu i 2,1 ml 15% żelu do gradientowego miksera do żelu na jeden żel o wymiarach 8,3 cm x 7,3 cm.
- Włącz mieszadło magnetyczne i otwórz rurkę i kanał między komorami ekspresu gradientów. Natychmiast włączyć pompę perystaltyczną na 5 ml/min. Napełnij szklane płytki i nie pozwól, aby bąbelki dostały się do żelu. Wyjmij igłę, gdy w rurki nie ma żelu.
- Delikatnie nałożyć na żel dH2O. Żel należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę w celu polimeryzacji.
- Natychmiast po nalaniu żelu należy umyć rurkę wypełniając komory gradientowedH2Oi używając pompy perystaltycznej na maksymalnych obrotach. Przygotowując dwa i więcej żeli, zawsze czyść system pomiędzy nimi.
- Przygotować 1x bufor żelowy, mieszając 3 ml 3x buforu żelowego i dodać 6 ml dH2O. Delikatnie usuń dH2O z powierzchni żelu bibułą filtracyjną. Umyj powierzchnię żelu 1x buforem żelowym. Delikatnie usuń 1x bufor żelowy bibułą filtracyjną.
- Unikaj włókien z bibuły filtracyjnej na żelu. Aby to zapewnić, pokrój papier na małe kawałki nożyczkami, ale nie rozdzieraj papieru.
- Umieść grzebień między szklanymi płytkami, ale nie zanurzaj go całkowicie, aby móc wlać żel do układania pod grzebieniem. Przygotować 4% żel do układania w stos (Tabela 2). Dodaj APS i TEMED na końcu, ponieważ łatwo rozpoczynają polimeryzację. Mieszaj delikatnie, unikając pęcherzyków powietrza.
- Nałóż żel do układania, unikając pęcherzyków pod grzebieniem, i całkowicie zanurz grzebień. Pozwól żelowi do układania polimeryzować przez co najmniej 30 minut. Wyjmij grzebień i umyj studzienki 1x buforem żelowym za pomocą pipety.
- Po polimeryzacji żel można przechowywać w temperaturze +4 °C przez kilka dni. Aby przechowywać żel, zawiń żel w papier nasączonydH2Oi folią z tworzywa sztucznego, aby zapobiec wysychaniu żelu.
4. Niebieska natywna elektroforeza żelowa
UWAGA: Aby zapobiec degradacji kompleksów OXPHOS, uruchom elektroforezę w temperaturze +4 °C. Użyj wstępnie schłodzonych.
- Załaduj kasetę z żelem buforem z niebieską katodą aż do dna studzienek. Ładowanie próbek jest łatwiejsze, gdy kaseta nie jest wypełniona do góry. Umyj studzienki buforem z niebieską katodą, a następnie napełnij studzienki buforem z niebieską katodą za pomocą pipety.
- Załaduj próbki (5-30 μg białka) do studzienek. Delikatnie napełnij kasetę żelową do góry niebieskim buforem katodowym, a zbiornik z buforem anodowym.
- Uruchom żel na 15 minut przy stałym napięciu 40 V. Następnie zwiększ napięcie do 80 V (lub użyj stałego prądu 6 mA), nie przekraczaj 10 mA. Uruchom żel, aż barwnik osiągnie 2/3 długości żelu.
- Zastąp bufor niebieskiej katody buforem katodowym i kontynuuj elektroforezę, aż skończy się czoło barwnika. W sumie elektroforeza trwa około 3 godzin.
- Pobrać szklane płytki i przenieść białka do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) za pomocą półsuchego blottingu.