Mikroprzepływowa elektroforeza kapilarna do wymiarowania fragmentów produktów PCR: technika separacji elektroforetycznej oparta na mikroprocesorach w celu oddzielenia fragmentów DNA na podstawie wielkości

Streszczenie

Źródło: Wang, H., Zhu et al. Solidny test oparty na reakcji łańcuchowej polimerazy do ilościowego oznaczania powtórzeń trinukleotydu cytozyno-guaninowo-guaninowego w genie Fragile X-Mental Retardation-1. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film opisuje technikę mikroprzepływowej elektroforezy kapilarnej do rozdzielania amplikonów PCR na podstawie ich wielkości. Ta technika pomaga w wymiarowaniu fragmentów przy użyciu barwników fluorescencyjnych i standardowych markerów wielkości molekularnej.

Protokół

1. Wymiarowanie fragmentów produktów PCR

1. Przed rozpoczęciem należy odczekać, aż koncentrat barwnika DNA, matryca żelu DNA, marker DNA, drabinka DNA i oczyszczone próbki DNA zrównoważą się do temperatury pokojowej przez 30 minut.
2. Ustawianie stacji zalewania
   1. Wymienić strzykawkę (patrz Tabela materiałów) w przypadku użycia nowej partii odczynników.
   2. Wyreguluj płytkę podstawy, zwolnij dźwignię zacisku strzykawki i przesuń ją do górnej pozycji.
3. Uruchom oprogramowanie do klejenia (patrz Tabela materiałów) i przygotuj mieszankę żelu i barwnika.
4. Wiruj koncentrat barwnika przez 10 s i odwiruj. Dodać 25 μl barwnika do fiolki z matrycą żelową. Dobrze zmieszaj zmieszany roztwór i odwiruj.
   1. Przenieś mieszankę żelu i barwnika do filtra wirowego. Umieść filtr wirowy w mikrowirówce i wiruj przez 10 minut w temperaturze pokojowej przy 1,500 x g ± 20%.
      UWAGA: Roztwór z barwnikiem chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze 4 °C po użyciu. Mieszankę żelowo-barwnikową można użyć na około 15 chipsów po przygotowaniu. Za każdym razem przed użyciem pozwól, aby mieszanina żelu i barwnika zrównoważyła się do temperatury pokojowej przez 30 minut.
5. Załaduj mieszankę żelu i barwnika
   1. Włóż nowy chip DNA do stacji zasysającej. Dodaj 9 μl mieszanki żelu i barwnika do studzienki oznaczonej literą "G". Upewnij się, że tłok jest umieszczony na znaku 1 ml, a następnie zamknij stację zasysającą.
   2. Wcisnąć tłok strzykawki w dół, aż zostanie przytrzymany przez zacisk. Poczekaj dokładnie 30 sekund, a następnie zwolnij klips. Odczekać 5 sekund, a następnie powoli pociągnąć tłok z powrotem do pozycji 1 ml.
   3. Otwórz stację zasysania i dodaj 9 μl mieszanki żelowo-barwnikowej do studzienek oznaczonych literą "G".
6. Dodać 5 μl markera do studzienki oznaczonej symbolem drabinki, a także dodać 5 μl markera do każdej z 12 studzienek na próbki. Nie zostawiaj żadnych studzienek pustych.
7. Dodać 1 μl drabinki DNA do studzienki oznaczonej symbolem drabinki. Dodać 1 μl produktu PCR (zużyte studzienki) lub 1 μl ultraczystej wody (niewykorzystane studzienki) do każdej z 12 studzienek na próbki. Umieść wiór poziomo w adapterze mieszalnika wirowego i wiruj przez 1 minutę we wskazanym ustawieniu (2 400 obr./min).
8. Włóż chip do bioanalizatora i uruchom chip w instrumencie w ciągu 5 minut.
9. Po zakończeniu testu należy natychmiast usunąć zużyty chip z urządzenia.
10. Powoli dodaj 350 μl wody dejonizowanej do jednego z dołków czyścika elektrod. Otwórz pokrywę bioanalizatora i umieść w niej środek do czyszczenia elektrod. Zamknij pokrywkę i inkubuj przez około 10 sekund. Otwórz pokrywę i wyjmij środek do czyszczenia elektrod. Odczekaj kolejne 10 sekund, aby woda z elektrod odparowała, a następnie zamknij pokrywę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bioanalizator Agilent 2100: probówki do PCR 0,2 ml	Axygen (Axigen	PCR-02D-C
Bioanalizator Agilent 2100: 1x bufor TE, pH 8,0, bez rnazy	Ambion	Zobacz materiał AM9849
Instrument do bioanalizacji Agilent 2100: Przyrząd do bioanalizowania 2100	Agilent	G2939AA
Instrument do bioanalizatora Agilent 2100: 96-dołkowa płytka do PCR	Rybak termiczny	Zobacz materiał AB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer: Wkład z elektrodą	Agilent		Zaopatrzenie w sprzęt do bioanalizatora 2100
Agilent 2100 Bioanalizator: mieszalnik wirowy IKA	Agilent		Zaopatrzenie w sprzęt do bioanalizatora 2100
Analizator biologiczny Agilent 2100: Oprogramowanie do wymiarowania Oprogramowanie 2100 Expert	Agilent		Zaopatrzenie w sprzęt do bioanalizatora 2100
Przyrząd do bioanalizowania Agilent 2100: Chipy testowe	Agilent		Zaopatrzenie w sprzęt do bioanalizatora 2100
Zestaw Agilent DNA 7500	Agilent	5067-1506	Do określania rozmiaru fragmentu
Zestaw Agilent DNA 7500: Drabina DNA 7500 (żółta nasadka)	Agilent		W zestawie: Zestaw Agilent DNA 7500 (numer katalogowy: 5067-1506)
Zestaw Agilent DNA 7500: Markery DNA 7500 (zielona nasadka)	Agilent		W zestawie: Zestaw Agilent DNA 7500 (numer katalogowy: 5067-1506)
Zestaw Agilent DNA 7500: chipy DNA	Agilent		W zestawie: Zestaw Agilent DNA 7500 (numer katalogowy: 5067-1506)
Zestaw Agilent DNA 7500: Koncentrat barwnika DNA (niebieska nakrętka)	Agilent		W zestawie: Zestaw Agilent DNA 7500 (numer katalogowy: 5067-1506)
Zestaw Agilent DNA 7500: Fiolka z żelem DNA (czerwona nakrętka)	Agilent		W zestawie: Zestaw Agilent DNA 7500 (numer katalogowy: 5067-1506)
Zestaw Agilent DNA 7500: Środek do czyszczenia elektrod	Agilent		W zestawie: Zestaw Agilent DNA 7500 (numer katalogowy: 5067-1506)
Zestaw Agilent DNA 7500: Filtr wirowy	Agilent		Zapas zestawu Agilent DNA 7500 (numer katalogowy: 5067-1506)
Zestaw Agilent DNA 7500: Strzykawka	Agilent		Zapas zestawu Agilent DNA 7500 (numer katalogowy: 5067-1506)
Stacja zasysania wiórów	Agilent	5065-4401	Zaopatrzenie w sprzęt do bioanalizatora 2100
Kolektor próżniowy z płytą filtracyjną: Kolektor próżniowy MultiScreenHTS	Merck Millipore	MSVMHTS00	Przyrząd próżniowy do kolektora próżniowego z płytą filtracyjną do oczyszczania produktu PCR
Kolektor próżniowy z płytą filtracyjną: Korek silikonowy	Merck Millipore	XX2004718	Kolektor próżniowy z płytą filtracyjną
Kolektor próżniowy z płytą filtracyjną: Pompa próżniowa	Merck Millipore	WP6122050	Kolektor próżniowy z płytą filtracyjną
Kolektor próżniowy z płytą filtracyjną: Naczynie na odpady	Merck Millipore	XX1004705	Kolektor próżniowy z płytą filtracyjną

)