Southern blotting w celu wykrycia rekombinacji homologicznej w genomie embrionalnych komórek macierzystych myszy

Streszczenie

Źródło: Li, J., et al. Identyfikacja zdarzeń rekombinacji homologicznej w embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą Southern blotting i reakcji łańcuchowej polimerazy. J. Vis. Exp. (2018).

W tym filmie opisujemy technikę Southern blotting w celu identyfikacji homologicznych zdarzeń rekombinacji w genomie embrionalnych komórek macierzystych myszy za pomocą sond znakowanych radioaktywnie. Regiony DNA zawierające zdarzenia rekombinacji homologicznej pojawiają się jako wyraźne prążki, gdy błona zawierająca DNA związane z sondą jest wystawiona na działanie promieni rentgenowskich.

Protokół

1. Przygotowanie genomowego DNA i trawienie za pomocą enzymu restrykcyjnego(-ych)

1. Przygotowanie gDNA z embrionalnych komórek macierzystych (komórek ES) za pomocą komercyjnego zestawu (zestaw do oczyszczania genomowego DNA) z niewielkimi modyfikacjami.
   1. Usunąć pożywkę z hodowli komórek ES i dodać 500 μl roztworu do lizy jąder, w tym RNazyA, bezpośrednio do studzienek w celu lizy komórek.
      nuta: Lizat komórkowy może być przechowywany w temperaturze -80 °C lub natychmiast poddany obróbce.
   2. Pipetuj kilka razy w górę i w dół, aby całkowicie zlizować komórki i przenieść je do czystej probówki o pojemności 1,5 ml.
   3. Dodać jedną trzecią objętości roztworu do wytrącania białek do probówki o pojemności 1,5 ml, energicznie wirować przez 20 s, schładzać próbki na lodzie przez 5 minut, a następnie wirować z siłą 2 000 x g przez 5 minut. Przenieść supernatant do innej czystej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej równą objętość izopropanolu; delikatnie wymieszać roztwór. (Odnotuj, że w tym momencie widać białe nitkowate pasma.) Wirować z siłą 2 000 x g przez 1 min; Następnie odrzuć supernatant.
   4. Umyj osad gDNA 1 ml 70% etanolu w temperaturze pokojowej, odwiruj z siłą 2,000 x g przez 1 minutę, ostrożnie odessaj supernatant, a następnie wysusz granulkę gDNA na powietrzu przez 3 minuty.
   5. Rozpuścić gDNA w 100 μl roztworu do rehydratacji DNA, a następnie inkubować w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę lub w temperaturze 4 °C przez noc.
   6. Przechowuj gDNA w temperaturze 2–8 °C.
2. Trawić gDNA za pomocą wstępnie zaprojektowanego RE Dra I. Ustawić reakcję trawienia 30 μl, mieszając 3 μl 10-krotnego buforu dla Dra I, 3 μl Dra I, 10 μg gDNA/próbkę i_H2Odo 30 μl i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
3. Sprawdź kompletność trawienia za pomocą żelu DNA, analizując 5 μl strawionej reakcji, a następnie dodaj 3 μl 10-krotnego buforu ładującego DNA do następnego etapu.

2. Południowa plama

1. Badania przesiewowe w kierunku blottingu południowego
   1. Oddziel strawione gDNA za pomocą elektroforezy i przenieś je do membrany.
      1. Przygotować 1% żel do elektroforezy agarozowej z bromkiem etydyny (EB), załadować strawione próbki gDNA i drabinkę o pojemności 1 kb, a następnie uruchomić żel pod niskim napięciem (30–40 V) przez noc.
      2. Wyjmij żel i zrób zdjęcie za pomocą systemu obrazowania DNA w żelu po elektroforezie. Sprawdź, czy strawione i oddzielone gDNA wyświetlają obraz podobny do rozmazu.
      3. Namocz żel na tacce z 0,2 N roztworem HCl i delikatnie potrząsaj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
      4. Przenieś żel do roztworu denaturującego DNA i delikatnie wstrząsaj nim przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
      5. Zamień żel w roztwór neutralizujący DNA i delikatnie potrząsaj nim przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
         nuta: Po tym kroku żel jest podatny na pękanie, dlatego należy obchodzić się z nim ostrożnie.
      6. Użyj systemu szybkiego transferu w dół, aby przenieść DNA z żelu do błony. Zmontuj TurboBlotter i stos bibuły zgodnie z instrukcją dostarczoną przez producenta.
         UWAGA: Jako bufor transferowy stosuje się 10x lub 20x roztwór cytrynianu soli fizjologicznej (SSC). Ogólnie rzecz biorąc, 3 godziny transferu wystarczają do przeniesienia 95% gDNA z żelu na błonę; Jednak dłuższy czas transferu jest nieszkodliwy.
      7. Wyjmij membranę i przemyj ją 2x SSC przez 1 min, wchłoń płyn z tkankami, a następnie usieciuj DNA z błoną za pomocą środka sieciującego UV.
         nuta: Membrana może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez tydzień.
2. Oznacz sondy DNA radioaktywnością.
   1. Oczyść plazmidy sondy za pomocą zestawu miniprep zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta.
   2. Uwolnić fragmenty DNA sond z wektora plazmidowego przez mineralizację EcoR I w roztworze reakcyjnym zawierającym 5 μl buforu dla EcoR I, 2 μl enzymu EcoR I, 20 μg plazmidowego DNA i_H2Odo 50 μl, przez 2 godziny.
   3. Uruchom 1% żel DNA do oddzielenia fragmentów DNA sondy od wektora i oczyść fragmenty DNA sond za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta.
   4. Używając 1 μl roztworu DNA, zmierzyć stężenie DNA we fragmentach DNA sondy za pomocą spektrofotometru o długości fali 260/280 nm.
   5. Przygotuj 40 ng DNA sondy w probówce o pojemności 1,5 ml z 45 μl buforu TE, gotuj przez 3 minuty, krótko wiruj, a następnie umieść probówkę (probówki) na lodzie na 2 minuty.
   6. Dodać denaturowane termicznie DNA sondy do probówki zawierającej gotowe do użycia kulki znakujące DNA (-dCTP), pipetować w górę i w dół do mieszania, dodać 5 μl [α³²P]dCTP, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
   7. Oczyścić oznakowane sondy za pomocą mikrokolumn G-50 zgodnie z instrukcją dostarczoną przez producenta, a następnie zmierzyć radioaktywność za pomocą licznika scyntylacyjnego (opcjonalnie).
3. Zhybrydyzuj membranę (membrany) z oznakowanymi sondami.
   1. Prehybrydyzacja błony.
      1. Podgrzej roztwór hybrydyzacyjny w temperaturze 42 °C przez 30 minut. Wymieszaj 20 ml podgrzanego roztworu hybrydyzacyjnego z 200 μg DNA plemników łososia w probówce o pojemności 50 ml.
      2. Umieść membranę w probówce hybrydyzacyjnej. Dodaj mieszany roztwór prehybrydyzacyjny do probówki hybrydyzacyjnej. Umieścić go w piecu do hybrydyzacji (ustawić walcowanie i temperaturę na 42 °C) i pozostawić prehybrydyzację przez 30 minut.
   2. Zhybrydyzuj membranę za pomocą oznakowanych sond (sond).
      1. Wyjąć probówkę do hybrydyzacji i wlać roztwór do hybrydyzacji do probówki o pojemności 50 ml; dodać denaturowaną sondę (podgrzewaną w temperaturze 100 °C przez 3 minuty) z etapu 2.1.2.7 do tej probówki i delikatnie wymieszać.
         nuta: Zmniejsz wszelkie pęcherzyki indukujące.
      2. Zwróć zmieszany roztwór do probówki hybrydyzacyjnej i przeprowadź hybrydyzację w temperaturze 42 °C przez noc.
4. Umyj membranę(y), aby usunąć niezhybrydyzowane sondy.
   1. Umieść membranę (membrany) na tacy z 1x SSC + 0,1% SDS i delikatnie wstrząsaj w temperaturze 55–60 °C przez 10 minut.
   2. Przenieś membranę(y) na tackę z 0,5x SSC + 0,1% SDS i delikatnie wstrząsaj w temperaturze 55–60 °C przez 10 minut.
   3. Sprawdź radioaktywność membrany (membran) za pomocą przenośnego licznika Geigera, aby zdecydować, czy wymagane jest trzecie mycie.
5. Wystaw radioaktywność na membranie na klisze rentgenowskie.
   1. Usuń płyn z umytej membrany (membran).
   2. Owiń membranę (membrany) folią i zamocuj ją/je w kasecie ekspozycyjnej.
   3. Wystaw membranę na dwa arkusze kliszy rentgenowskiej w ciemnym pomieszczeniu.
   4. Umieść kasetę naświetlacyjną w temperaturze -80 °C na noc lub dłużej.
6. Wywołaj filmy, aby zwizualizować wyniki. Oceń, czy odpowiedni klon ES jest pożądany z ukierunkowaną rekombinacją, czy nie, zgodnie z rozmiarami prążków DNA wykrytych przez sondy.
7. Tę samą membranę należy ponownie zhybrydyzować z inną sondą po usunięciu zużytej sondy zgodnie z następującą procedurą: wyjąć zużytą membranę, przemyć ją 1x czystym_H2O, a następnie inkubować w roztworze pasiastym (55% formamidu, 2% SSPE, 1% SDS,_H2O) w temperaturze 65 °C z delikatnym wstrząsaniem przez 1–2 godziny.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick	QIAGEN powiedział:	Numer katalogowy: 28704
Roztwór do denaturacji DNA	Firma VWR	Nr kat. 351-013-131
Roztwór neutralizujący DNA	Firma VWR	Nr kat. 351-014-131
Ekologia I	Thermo Scientific	Zobacz materiał ER0271
Dra I	Thermo Scientific	Zobacz materiał ER0221
Mikrokolumny ProbeQuan G-50	GE Opieka zdrowotna	28-9034-08
Roztwór hybrydyzacyjny Hybrisol I	Milipory	S4040
Gotowe do użycia koraliki do etykietowania DNA (-dCTP)	Firma VWR	27-9240-01
UltraPure SSC, 20x	Rybak termiczny	15557036
Roztwór DNA plemników łososia	Rybak termiczny	15632011
System transferowy Whatman TurboBlotter, duże zestawy	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 09-301-188
[α32P] dCTP	PerkinElmer powiedział:	NEG013H100UC
Film rentgenowski Kodak	Z&Z Medyczne	tel. 844 5702
Zestaw QIAprep Spin Miniprep	QIAGEN powiedział:	Numer katalogowy 27104
Roztwór do lizy jąder	Preparat Promega	A7941 (wersja
Roztwór do wytrącania białek	Preparat Promega	A7951

powiedział: powiedział: powiedział: angielska) (wersja angielska)