Test dwuhybrydowy drożdży w celu określenia samoasocjacji białek w komórkach drożdży

Streszczenie

Źródło: Stańczyk, P. J., et al., Genetyczne i biochemiczne podejścia do oceny oligomeryzacji białek in vivo i in vitro: studium przypadku receptora Ryanodine. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film demonstruje test dwóch hybryd drożdży do wykrywania specyficznych interakcji między białkami. W tym teście białko będące przedmiotem zainteresowania jest znakowane do dwóch domen czynnika transkrypcyjnego, który koduje enzym β-galaktozydazy. Kiedy te dwa białka wchodzą w interakcję, powoduje to transkrypcję i translację, które tworzą enzym, który jest następnie wykrywany za pomocą testu biochemicznego.

Protokół

1. Przemiana drożdży

1. Drożdże zbierać przez odwirowanie (w probówkach o pojemności 50 ml) w stężeniu 1 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić każdą osadkę w 5 ml sterylnego_H2Oi połączyć razem.
2. Ponownie odwirować przy 1 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Zawiesić granulki drożdży w 1 ml świeżo przygotowanego, sterylnego 1x LiAc/TE.
   nuta: Użyj kompetentnych komórek drożdży w ciągu 1 godziny od przygotowania.
3. Przygotować próbki plazmidu (w probówkach o pojemności 1,5 ml), dodając 200 ng plazmidowego DNA do pojedynczych przemian lub 0,5 - 1 μg każdego plazmidowego DNA do kotransformacji i 100 μg DNA nośnika jąder śledzia (gotowanego przez 20 minut i schładzonego na lodzie tuż przed użyciem).
   UWAGA: Uwzględnij kontrolę pozytywną, np. drożdże współtransformowane z pVA3 (kodowanie fuzji GAL4 DNA-BD z białkiem p53) i pTD1 (kodowanie fuzji GAL4 AD z dużym antygenem T SV40).
4. Dodać 100 μl świeżo przygotowanej, właściwej zawiesiny drożdży i 600 μl 1x roztworu LiAc/PEG (8 ml podstawowego PEG 3350, 1 ml podstawowego TE, 1 ml podstawowego LiAc) i wirować przez ~30 sek. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 30 min z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
5. Dodać 80 μl dimetylosulfotlenku (10% v/v stężenie końcowe) i dobrze wymieszać przez delikatne odwrócenie. Szok termiczny przez 15 min w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przy mieszaniu co 2 - 3 min.
6. Schładzać zawiesinę komórek na lodzie przez 2 minuty i odwirowywać przy 14 000 x g przez 15 sekund w temperaturze pokojowej w celu odzyskania drożdży.
7. Zawiesić osad komórkowy w 100 μl 1x TE i płytkę na odpowiednich minimalnych płytkach pożywki SD w celu selektywnego wzrostu (podłoże pozbawione leucyny i tryptofanu, aby utrzymać selektywny nacisk zarówno na przynętę, jak i docelowe plazmidy).
8. Inkubować płytki do góry nogami w temperaturze 30 °C, aż kolonie osiągną średnicę ~2 mm (zwykle 4 - 5 dni). Płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2 - 3 tygodnie; w celu dłuższego przechowywania należy przygotować zapasy glicerolu i przechowywać w temperaturze -80 °C.
   nuta: Sprawdź, czy białka przynęty i docelowe są wyrażane w drożdżach przez immunoblotting i czy nie mają autonomicznej aktywacji genu reporterowego, gdy są oddzielnie wyrażane w drożdżach.
9. Dodać 100 μl świeżo przygotowanej, właściwej zawiesiny drożdży i 600 μl 1x roztworu LiAc/PEG (8 ml podstawowego PEG 3350, 1 ml podstawowego TE, 1 ml podstawowego LiAc) i wirować przez ~30 sek. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 30 min z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
10. Dodać 80 μl dimetylosulfotlenku (10% v/v stężenie końcowe) i dobrze wymieszać przez delikatne odwrócenie. Szok termiczny przez 15 min w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przy mieszaniu co 2 - 3 min.
11. Schładzać zawiesinę komórek na lodzie przez 2 minuty i odwirowywać przy 14 000 x g przez 15 sekund w temperaturze pokojowej w celu odzyskania drożdży.
12. Zawiesić osad komórkowy w 100 μl 1x TE i płytkę na odpowiednich minimalnych płytkach pożywki SD w celu selektywnego wzrostu (podłoże pozbawione leucyny i tryptofanu, aby utrzymać selektywny nacisk zarówno na przynętę, jak i docelowe plazmidy).
13. Inkubować płytki do góry nogami w temperaturze 30 °C, aż kolonie osiągną średnicę ~2 mm (zwykle 4 - 5 dni). Płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2 - 3 tygodnie; w celu dłuższego przechowywania należy przygotować zapasy glicerolu i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Sprawdź, czy białka przynęty i docelowe są wyrażane w drożdżach przez immunoblotting i czy nie mają autonomicznej aktywacji genu reporterowego, gdy są oddzielnie wyrażane w drożdżach.

2. Badanie bibułą filtracyjną z β-galonów

1. Przygotuj następujące:
   1. Przygotować bufor Z zawierający 100 mM Na₂HPO₄, 40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KCl i 1 mM_MgSO4; dostosować pH do 7,4. Sterylizować w autoklawie i przechowywać w RT.
   2. Przygotować bufor X-Gal przez rozpuszczenie 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopyranozydu w stężeniu 20 mg/ml w N,N-dimetyloformamidzie i przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C. Przygotować roztwór buforu Z/X-Gal. Sporządzić bufor przed użyciem, mieszając X-Gal w stężeniu 0,33 mg/ml i β-merkaptoetanol w stężeniu 0,27% v/v w buforze Z. Stosować 2,5 ml na próbkę.
2. Dodać 2,5 ml świeżo przygotowanego roztworu buforu Z/X-Gal do czystej płytki o średnicy 100 mm i umieścić w celulozowej bibule filtracyjnej.
3. Umieścić nową bibułę filtracyjną na powierzchni płytki z koloniami drożdży, które mają być oznaczone. Delikatnie wetrzyj bibułę filtracyjną w płytkę za pomocą kleszczyków i pozostaw na ~5 minut, aby kolonie się przyczepiły.
   nuta: Przetwarzaj kontrolę pozytywną równolegle, tj. drożdże współtransformowane z pVA3 i pTD1.
4. Podnieś bibułę filtracyjną i zanurz ją (kleszczami) w kałuży ciekłego azotu na 30 sekund (z ciekłym azotem należy obchodzić się ostrożnie; zawsze noś grube rękawice i okulary). Pozwól zamrożonej bibule filtracyjnej rozmrozić się w temperaturze pokojowej przez ~ 2 min.
5. Umieścić bibułę filtracyjną (stroną z koloniami do góry) na wierzchu wstępnie nasączonej bibuły filtracyjnej wewnątrz płytki o średnicy 100 mm i inkubować w temperaturze 30 °C.
6. Sprawdzaj okresowo (co ~30 min) pojawienie się niebieskich kolonii.
   nuta: Słaba przynęta: interakcje docelowe mogą zająć kilka godzin, aby wytworzyć pozytywny niebieski sygnał (unikaj długotrwałej inkubacji (>8 godzin), która może dać fałszywie dodatnie wyniki). Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy używać świeżo przekształconych kolonii, tj. hodowanych w temperaturze 30 °C przez 4 - 5 dni, o średnicy ~2 mm.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Inkubator płytkowy	Oto nasz	Zobacz materiał B6120	urządzenie
Inkubator z wytrząsarką orbitalną	Naukowy Nowy Brunszwik	INNOVA 4300	urządzenie
Spektrofotometr	Perkin Elmer	Lambda Bio+	urządzenie
Zestaw Matchmaker Two-Hybrid System 2	Takara Clontech	Zobacz materiał K1604-1	Zawiera wektor przynęty pGBKT7, wektor ofiary pACT2 i szczep drożdży Y190
Baza azotowa drożdży	Sigma-Aldrich	Y0626	Aby przygotować minimalną pożywkę SD growh
Suplement na odpad pozbawiony leucyny i tryptofanu	Sigma-Aldrich	Y0750	Aby przygotować minimalną pożywkę SD growh
Suplement na odpad bez leucyny, tryptofanu, histydyny	Sigma-Aldrich	rok 2001	Aby przygotować minimalną pożywkę SD growh
DNA nosiciela jąder śledzia	Takara Clontech	Numer katalogowy: 630440	Do przemiany drożdży
Bibuła filtracyjna Whatman klasa 5	Sigma-Aldrich	WHA1005070	Do stosowania w teście bibuły filtracyjnej z bibułą filtracyjną typu colony-lift β-Gal
X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopyranozyd)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał B4252	Do stosowania w teście bibuły filtracyjnej z bibułą filtracyjną typu colony-lift β-Gal

powiedział: powiedział: