Ilościowa spektroskopia NMR wodoru w komórce do monitorowania interakcji białko-ligand

Streszczenie

Źródło: Barbieri, L. et al., Monitorowanie interakcji białko-ligand w komórkach ludzkich za pomocą ilościowego NMR w komórce w czasie rzeczywistym przy użyciu bioreaktora o wysokiej gęstości komórek.J. Vis. Exp.(2021)

W tym filmie demonstrujemy technikę spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w komórce do badania interakcji białko-ligand między nieznakowanymi białkami o nadekspresji a małymi cząsteczkami. Udana interakcja ligand-białko jest potwierdzona wizualnie przez pojawienie się dodatkowego zestawu pików w obszarze widmowym będącym przedmiotem zainteresowania, który stopniowo zastępuje pierwotne piki.

Protokół

1. Konfiguracja odczynnika i roztworu

1. Aby przygotować kompletny DMEM, dodaj 5 ml L-glutaminy 200 mM, 5 ml penicyliny-streptomycyny 100x i 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS, końcowe stężenie 10% obj.) do 440 ml DMEM.
   nuta: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
2. Przygotować roztwór agarozy, rozpuszczając 150 mg agarozy o niskiej żelowości w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 85 °C w celu uzyskania 1,5% (m/v) roztworu. Sterylizuj przez filtrację za pomocą filtra 0,22 μm. Przygotować 1 ml podwielokrotności roztworu agarozy w 1,5 N
3. Przygotować pożywkę bioreaktora.
   1. Rozpuścić 13,4 g proszku DMEM w 1 l ultraczystego_H2O.
      nuta: W zależności od zastosowania wymagana objętość końcowa może się różnić (np. dla 500 ml pożywki rozpuścić 6,7 g proszku w 500 ml H₂O).
   2. Dodać 2% FBS, 10 mM NaHCO₃, 1x penicylina-streptomycyna (100x) i 2% D₂O (np. na 500 ml pożywki dodać 10 ml FBS, 0,4 g NaHCO₃, 5 ml penicyliny-streptomycyny 100x i 10 ml D₂O).
   3. Zmierz pH za pomocą pH-metru i w razie potrzeby dostosuj do 7,4, dodając HCl.
      nuta: Zazwyczaj początkowe pH jest bardzo zbliżone do 7,4.
   4. Przefiltruj pożywkę bioreaktora za pomocą sterylnego filtra próżniowego w sterylnej szklanej butelce o pojemności 250 ml lub 500 ml.
   5. W okapie z przepływem laminarnym uszczelnij butelkę sterylną stalową głowicą z dwiema dyszami węża i podłącz je do rurki FEP (o.d. = 1/8", ID = 1.6 mm), która będzie podłączona do pompy i do filtra strzykawkowego PTFE 0.22 μm do wlotu powietrza.

2. Konfiguracja bioreaktora

1. Zmontuj jednostkę przepływu za pomocą drugiej rurki NMR jednostki przepływu, która zostanie później zastąpiona tą zawierającą komórki. Zapoznaj się z instrukcją obsługi jednostki przepływowej, aby uzyskać informacje na temat prawidłowego montażu.
   nuta: W tym momencie jednostka przepływu powinna być już wyczyszczona (jeśli nie, wykonaj krok 4.2).
2. Ustawić łaźnię wodną podłączoną do regulatora temperatury jednostki przepływowej na 37 °C. Umieścić butelkę z biustem w łaźni wodnej.
3. Podłącz rurkę FEP butelki ze zbiornikiem do pompy.
4. Przekręć zawór bioreaktora w położenie "obejście" i wstępnie napełnij pompę medium.
5. Przekręć zawór bioreaktora na "przepływ" i wstępnie napełnij bioreaktor medium o prędkości 0,1 ml/min.

3. Przygotowanie próbki komórki

1. Pobrać komórki z inkubatora emisji_CO2.
   1. Pobrać kolbę T75 z transfekowanymi komórkami HEK293T z inkubatora CO₂ i usunąć zużytą pożywkę.
   2. Umyj komórki dwukrotnie 7 ml (każda) PBS w temperaturze pokojowej (~20 °C).
   3. Użyj 2 ml trypsyny/EDTA, aby odłączyć komórki. Po dodaniu roztworu inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu odłączenia komórek.
      nuta: Transfekowane komórki mogą potrzebować nieco więcej czasu, aby się odłączyć. W razie potrzeby inkubować komórki w temperaturze 37 °C.
   4. Dezaktywować trypsynę za pomocą 20 ml kompletnego DMEM; dokładnie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół i przenosząc je do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
   5. Odwirować komórki o sile 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
   6. Umyj komórki 10 ml PBS w temperaturze pokojowej, aby usunąć pozostałą pożywkę.
   7. Odwirować komórki o sile 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
   8. Przenieś osad komórkowy do zaślepionej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
2. Osadź komórki w niciach agarozy.
   1. Stopić jedną podwielokrotność zestalonej agarozy w temperaturze 85 °C w łaźni wodnej, a następnie przechowywać ją w roztworze w temperaturze 37 °C w bloku grzewczym.
   2. Za pomocą pipety Pasteura napełnij dno rurki NMR jednostki przepływowej 60-70 μl 1,5% żelu agarozowego i umieść ją w lodzie. Spowoduje to utworzenie dolnego korka o wysokości ~5 mm, który umożliwia umieszczenie próbki komórki w aktywnej objętości cewki ¹H NMR.
   3. Podgrzać osad komórek otrzymany w kroku 3.1.8 w temperaturze 37 °C przez 15−20 s w termobloku.
   4. Zawieś komórki w 450 μl roztworu agarozy. Uważaj, aby nie tworzyć się pęcherzyków.
   5. Odessać zawiesinę agarozy komórkowej do rurki chromatograficznej PEEK o długości ~30 cm (średnica wewnętrzna = 0,75 mm) podłączonej do strzykawki o pojemności 1 ml.
      nuta: Przed aspiracją rurkę i martwą objętość strzykawki należy wstępnie napełnić PBS w temperaturze pokojowej, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Długość rurki nie jest krytyczna.
   6. Pozwól rurki ostygnąć w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
   7. Napełnij rurkę NMR jednostki przepływowej 100 μl PBS w temperaturze pokojowej.
   8. Odlać nitki komórek zanurzonych w agarozie do rurki NMR jednostki przepływowej, delikatnie popychając strzykawkę.
      nuta: Aby równomiernie napełnić rurkę NMR, zacznij od umieszczenia końca rurki PEEK na dole rurki NMR i idź w kierunku góry, powoli obracając się w lewo i w prawo.
   9. Powtarzać kroki 3.2.5, 3.2.6 i 3.2.8, aż cała zawiesina agarozy komórkowej zostanie odlana.
3. Wprowadzić komórki do bioreaktora.
   1. Wyjmij pustą rurkę NMR z jednostki przepływowej i zwiększ natężenie przepływu do 2 ml/min na kilka minut, aby usunąć resztki pęcherzyków gazu z rurki doprowadzającej.
   2. Ustaw natężenie przepływu na 0,2 ml/min i włóż rurkę NMR zawierającą komórki, popychając ją powoli, ale równomiernie do góry.
      nuta: Aktywny przepływ medium pozwala uniknąć cofania się zawartości rurki przez wlot, które w przeciwnym razie miałoby miejsce podczas wkładania.

4. Obsługa i czyszczenie bioreaktora

1. Praca bioreaktora podczas eksperymentu NMR.
   1. Ustaw temperaturę w spektrometrze NMR na 310 K.
   2. Włożyć jednostkę przepływu do spektrometru.
   3. Zasilaj pożywkę bioreaktora z natężeniem przepływu 0,1 ml/min przez cały czas trwania eksperymentów NMR w komórce.
   4. W pożądanym czasie podczas eksperymentu wstrzyknąć stężony roztwór cząsteczki zewnętrznej do butelki ze zbiornikiem pożywki, przekłuwając silikonową rurkę sterylną strzykawką z długą igłą.
      nuta: Końcowe stężenie cząsteczki w pożywce powinno być wybrane na podstawie wcześniejszej wiedzy na temat toksyczności komórkowej oraz, jeśli jest to możliwe, na podstawie przewidywanej/szacowanej szybkości dyfuzji przez błonę komórkową.
   5. Pod koniec eksperymentu NMR zastąp probówkę zawierającą komórki pustą probówką i przepłucz jednostkę przepływową wodą.
2. Czyszczenie bioreaktora na miejscu.
   1. Oczyścić jednostkę przepływu, przepuszczając następujące roztwory o stężeniu 1 ml/min: 0,2 M wodorotlenku sodu (NaOH), 3 M kwasu cytrynowego, 0,2 M NaOH przez co najmniej 30 minut każdy, a następnie sterylnie przefiltrowaną ultraczystą wodą przez >2 godziny.
   2. Wyczyść i autoklawuj zbiornik, butelkę i zespół rurek po każdym uruchomieniu.

5. Eksperymenty NMR

1. Konfiguracja eksperymentów NMR.
   nuta: Wykonaj te czynności wcześniej, przed przygotowaniem próbki NMR w komórce, aby uniknąć opóźnień między pobraniem komórek a akwizycją danych.
   1. Utwórz nowy zestaw danych w spektrometrze NMR i ustaw parametry dla żądanych eksperymentów NMR.
   2. Ustawianie parametrów dla eksperymentów 1D ¹H NMR.
   3. Wyśrodkuj częstotliwość nośną ¹H na 4.7 ppm na sygnale wody.
   4. Wybierz program impulsowy zgesgp, ustaw szerokość widmową na 20 ppm i impuls kwadratowy 1,000 μs 180° do tłumienia wody. Ustaw opóźnienie między skanowaniami na 1 s. Uzyskaj widmo za pomocą 32 skanów.
   5. Dla komórek wyrażających nieznakowany CA II: wybierz program impulsowy p3919gp, ustaw szerokość widma na 30 ppm, aby pokryć obszar imino widma i dostosuj opóźnienie dwumianowego tłumienia wody tak, aby maksymalne wzbudzenie było wyśrodkowane na przesunięciach chemicznych sygnałów będących przedmiotem zainteresowania (d7 = 20 μs przy 950 MHz). Ustaw opóźnienie między skanowaniami na ≥1 s. Zdobądź za pomocą 512 skanów.
   6. Dla komórek wyrażających ¹⁵znakowanych N SOD1: wybierz program impulsów sfhmqf3gpph, ustaw szerokości widma ¹H i ¹⁵N odpowiednio na 16 i 50 ppm, przesunięcie impulsu kształtowego i szerokość pasma wzbudzenia odpowiednio na 8,5 i 6 ppm oraz impuls 350 μs dla schematu rozprzęgania (garp4 lub inny w zależności od instrumentu). Ustaw opóźnienie między skanowaniami na 0,3 s. Wykonaj 16 skanów i wykonaj 128 przyrostów w wymiarze ¹⁵N.
2. Akwizycja widm NMR w czasie rzeczywistym.
   1. Po włożeniu bioreaktora do spektrometru NMR odczekaj kilka minut, aby umożliwić wymianę pożywki.
      nuta: Proces ten można łatwo monitorować od momentu pojawienia się sygnału blokady, ponieważ PBS jest zastępowany medium zawierającym 2%_D2O.
   2. Dostosuj dopasowanie i dostrojenie kanału ¹H, podkładkę magnesu i oblicz długość impulsu ^{twardego 1}H 90°.
   3. Dostosuj poziomy mocy ¹H w każdej sekwencji impulsów zgodnie z twardym impulsem ¹H.
   4. Zapisać pierwsze widmo zgesgp ¹H, aby sprawdzić zawartość próbki i jednorodność pola.
   5. Skopiuj eksperymenty zgesgp i p3919gp/sfhmqcf3gpph na żądaną liczbę i umieść je w kolejce w buforze akwizycji.
      ca: Widma zgesgp są używane wyłącznie do kontroli stanu próbki i jednorodności pola; Dlatego można je pominąć lub rzadziej nagrywać.
   6. W przypadku komórek wykazujących ekspresję nieznakowanego CA II: przetwarzaj widma p3919gp, stosując wypełnienie zerem i funkcję wykładniczego rozszerzania linii (LB = 20 Hz).
   7. Dla komórek wyrażających ¹⁵znakowanych N SOD1: przetwarzaj widma sfhmqcf3gpph, stosując wypełnienie zerowe i funkcję kwadratowego okna dzwonka sinusoidalnego (SSB = 2) w obu wymiarach.
      nuta: Rozmiar przetwarzanych widm można dodatkowo zmniejszyć, usuwając obszary wolne od sygnałów (w Topspin odbywa się to poprzez ustawienie żądanych wartości STSR i STSI).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materiałów
Kwas cytrynowy	Sigma-Aldrich	251275
D2O	Sigma-Aldrich	453366
DMEM, wysoki poziom glukozy	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 10313-021
DMEM, wysoki poziom glukozy, proszek	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D5648
FBS (Sieć Usługowa	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 10270
Hcl	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 30721
L-glutamina (200 mM)	Technologie życiowe	Numer katalogowy 25030
Agaroza o niskiej żelowości, proszek	Sigma-Aldrich	A4018 (wersja
NaHCO3, proszek	Carlo Erba	478537
Pbs	Technologie życiowe	Numer katalogowy 10010
Penicylina-streptomycyna (10 000 j./ml)	Technologie życiowe	Rozdział 15140-122
Pelety NaOH	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 30620
Trypsyna-EDTA (0,05% (wag./obj.))	Technologie życiowe	25300-054
sprzęt
Spektrometr Avance III wyposażony w kriosondę 5 mm	Bruker	N/a	Wszystkie nowoczesne spektrometry i magnesy o wąskim otworze wyposażone w sondy 5 mm są kompatybilne.
Jednostka przepływu InsightMR	Bruker	N/a
Moduł pompy P-920 firmy ÄKTA FPLC	GE Opieka zdrowotna	N/a	Każda pompa perystaltyczna lub strzykawkowa FPLC, HPLC powinna być kompatybilna z jednostką przepływową.

TGL angielska)