Atrakcyjnym modelem do badania różnicowania się komórek macierzystych w żywym organizmie jest płaskonic z rzędu Planarioidea. Regenerację bada się za pomocą prostych eksperymentów z amputacją, które można łatwo przeprowadzić w podstawowym laboratorium i które poddaje się manipulacjom farmakologicznym oraz genetycznym (in vivo RNAi), zgodnie ze szczegółowymi protokołami zawartymi w niniejszym artykule.
Artykuł metodologiczny
Badania farmakologiczne i funkcjonalne badania genetyczne w celu manipulacji regeneracją planarii Dugesia japonica
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wolnożyjące płaskostki z rzędu planarioidea mają długą historię zastosowań eksperymentalnych ze względu na swoje niezwykłe zdolności regeneracyjne1. Małe fragmenty wycięte z tych zwierząt odtwarzają pierwotny plan budowy ciała po regeneracji brakujących struktur organizmu. Na przykład, jeśli z nienaruszonego osobnika zostanie wycięty fragment „tułowia”, w części przedniej zregeneruje się nowa „głowa”, a w części tylnej „ogon”, co przywróci pierwotną polarność struktur ciała od „głowy do ogona” sprzed amputacji (Rycina 1A).
Regeneracja jest napędzana przez komórki macierzyste planarii, znane jako „neoblasty”, które różnicują się w około 30 różnych typów komórek podczas normalnej homeostazy organizmu oraz wymuszonej regeneracji tkanek. Proces regeneracyjny ten jest wydajny i łatwy do zademonstrowania. Dzięki zaangażowaniu kilku pionierskich laboratoriów wiele narzędzi i funkcjonalnych metod genetycznych zostało zoptymalizowanych dla tego systemu modelowego. W konsekwencji w ostatnim czasie poczyniono znaczne postępy w rozumieniu i manipulowaniu zdarzeniami molekularnymi leżącymi u podstaw plastyczności rozwojowej planarii2-9.
Model planarii będzie interesujący dla szerokiego grona naukowców. Dla neurobiologów model ten stwarza możliwość badania regeneracji całego układu nerwowego, a nie tylko odrastania lub naprawy pojedynczych wypustek komórek nerwowych, które zazwyczaj stanowią przedmiot badań w wielu uznanych modelach. Planarie wykazują ekspresję licznych neuroprzekaźników10, stanowią istotny system do badania ewolucji ośrodkowego układu nerwowego11, 12 i wykazują potencjał w zakresie przesiewowych badań behawioralnych13, 14.
Efekty regeneracyjne można modyfikować za pomocą metod farmakologicznych i genetycznych. Na przykład w celu badania wpływu leków na regenerację można po prostu umieścić fragmenty ciała w roztworach zawierających substancje lecznicze w różnych odstępach czasu po amputacji. Rolę poszczególnych genów można badać za pomocą metod wyciszania (in vivo RNAi), co można osiągnąć poprzez cykle mikroiniekcji lub podawanie w pożywce konstruktów dsRNA wyekspresowanych bakteryjnie8, 9, 15. Obie metody mogą prowadzić do powstania efektownych wizualnie fenotypów o wysokiej penetracji – na przykład regeneracji zwierząt dwubiegunowych16-21. Aby ułatwić przyjęcie tego modelu i wdrożenie takich metod, prezentujemy w niniejszym artykule wideo protokoły analiz farmakologicznych i genetycznych (in vivo RNAi poprzez podawanie w pożywce) z wykorzystaniem planarii Dugesia japonica.
Protokół
1. Test regeneracji fragmentów pnia
- Przynajmniej 5 dni przed testem regeneracyjnym zaprzestać karmienia kohorty płaskostków, aby upewnić się, że organizmy są wolne od odchodów i strawionej treści pokarmowej (˜30 nienaruszonych osobników, każdy o długości ˜8-10 mm po okresie głodówki).
- W dniu testu opłukać wodą uprzednio zamrożony pojemnik z wyrównaną warstwą lodu i przykryć płaską, zmrożoną powierzchnię folią spożywczą. Za pomocą pincety położyć arkusz papieru filtracyjnego na folii.
- Zwilżyć papier filtracyjny kilkoma kroplami wody źródlanej. Przenieść planarie na filtr (<20 osobników na filtr) za pomocą pipety transferowej. W razie potrzeby zwierzęta można ponownie rozmieścić na filtrze, przepipetowując je z dodatkiem wody źródlanej. Usunąć nadmiar cieczy.
- Za pomocą skalpela odciąć głowę jednym cięciem wykonanym mniej więcej w połowie odległości między przednim wierzchołkiem zwierzęcia a przednim końcem gardła (Rycina 1A).
- Za pomocą skalpela odciąć region ogona jednym cięciem wykonanym mniej więcej w połowie odległości między końcem ogona zwierzęcia a tylnym końcem gardła (Rycina 1A). Po cięciu usunąć nadmiar śluzu ze skalpela, używając ręcznika papierowego zwilżonego 70% etanolem. Przetrzeć skalpel, aby usunąć nadmiar etanolu.
- Przenieść filtr za pomocą pincety do szalki Petriego (100 x 25 mm głębokości) zawierającej wodę źródlaną. Odczekać ˜3 minuty (do czasu zamknięcia rany, co objawia się jej ściśnięciem i ściemnieniem).
- Spłukać fragmenty tułowia z papieru filtracyjnego do szalki Petriego zawierającej wybrany medium do testu regeneracyjnego i przenieść do inkubatora termostatowanego (24 °C).
- Ocenić fenotyp regeneracyjny po ˜1 tygodniu, gdy zregenerowane struktury będą możliwe do zidentyfikowania (Rycina 1A).
2. Farmakologiczna manipulacja regeneracją: bipolarność indukowana prazykwantelem
- Przygotuj roztwór zapasowy prazikwantelu (PZQ), rozpuszczając lek w DMSO (62,4 mg PZQ w 1 ml dla stężenia zapasowego 200 mM). Zużyj go w tym samym dniu.
- Przygotuj 50 ml roztworu zawierającego lek (90 μM PZQ) w buforowanych solach Montjucha. Mieszaj w wortexie przez ok. 1 minutę, aby zapewnić dyspersję.
- Przeprowadź test regeneracji fragmentów tułowia zgodnie z powyższym opisem [protokół #1], poddając grupę fragmentów tułowia działaniu PZQ w ostatnim kroku [1.7].
- Po 24–48 godzinach wymień medium zawierające PZQ na wodę źródlaną, płucząc robaki kilkukrotnie (>3 razy).
- Umieść robaki z powrotem w inkubatorze. Oceń bipolarność (dwugłowe osobniki, Rysunek 1B) tydzień po przecięciu.
3. Manipulacja genetyczna regeneracją: protokół karmienia w celu wywołania RNAi in vivo
- Przed analizą przygotować homogenat wątroby kurzej. Usunąć tłuste, żółte fragmenty z materiału źródłowego i zblendować pozostałą część wątroby. Przecedzić papkę przez sito i podzielić zawiesinę na aalikwoty do przechowywania (probówki 1,5 mL, -20 °C).
- Przed analizą przygotować erytrocyci (RBCs) bydlęce, dzieląc zapas na próbki po 1 mL, przechowywane w -20 °C.
- Wybrać nicienie do RNAi. Wykorzystuje się trzy grupy: geny docelowe, kontrolę pozytywną (gen o znanym fenotypie RNAi; Rycina 1C, D i E) oraz kontrolę negatywną (gen bez fenotypu RNAi, użyteczny również do oceny poziomu wyciszenia w porównaniu z grupą eksperymentalną). Dla każdej grupy użyć ˜250 nicieni (o długości ˜8-10 mm po co najmniej 5 dniach głodzenia). Przechowywać w wodzie źródlanej w plastikowym pojemniku.
- Dla każdej grupy RNAi rozmrozić zapas E. coli wykazującej ekspresję dsRNA celującego w gen docelowy [8], wraz z probówką homogenatu wątroby kurzej [3.1] i probówką RBCs [3.2].
- Odwirować bakterie (13 000g, 1 minuta). Usunąć supernatant i resuspendować osad w pożywce 2xYT (˜700 μL). Ponownie odwirować, usunąć supernatant i umieścić osad na lodzie.
- Przygotować końcówkę pipety P200 o dużym prześwicie, odcinając jej końcówkę. Dokładnie resuspendować osad bakteryjny w mieszaninie homogenatu wątroby kurzej (150 μL) i RBCs (50 μL), aby stworzyć mieszaninę do karmienia RNAi. Usunąć pęcherzyki powietrza poprzez wirowanie.
- W celu karmienia usunąć większość wody z plastikowego pojemnika z nicieniami (pozostawić głębokość ˜1 cala). Zakręcić zawartością pojemnika, aby skoncentrować nicienie w jego centrum, a następnie nanieść mieszaninę do karmienia RNAi kolistym ruchem, zaganiając zwierzęta. Użyć pipety transferowej, aby ostrożnie nakierować uciekające osobniki z powrotem do mieszaniny RNAi, nie niepokojąc pozostałych osobników!
- Po karmieniu (˜1 godzina) zidentyfikować planarie, które dobrze przyjęły pokarm. Nicienie te wykazują głębokie czerwone zabarwienie z powodu połkniętych RBCs. Pozostałe osobniki odrzucić.
- Ostrożnie zastąpić roztwór do karmienia świeżą wodą źródlaną, minimalizując zakłócenia, aby zapobiec wydalaniu pokarmu. W tym celu delikatnie przesunąć nicienie na jedną stronę probówki za pomocą pipety transferowej, wylać mętną wodę i ostrożnie wlać świeżą wodę po przeciwnej ściance pojemnika. Szybko ponownie zanurzyć planarie, ponieważ długotrwała ekspozycja na powietrze również prowadzi do wydalenia pokarmu.
- Luźno zamknąć pokrywkę pojemnika i przenieść do inkubatora (24 °C).
- Powtarzać protokół karmienia RNAi w wielu cyklach (w odstępach ˜2-3 dni), przeplatając go cyklami regeneracyjnymi [protokół #1] w celu przesiewania fenotypów RNAi. Standardowy protokół karmienia i regeneracji, skuteczny dla wielu genów, przedstawiono na Rycinie 2; całkowity czas trwania wynosi ˜1 miesiąc.
Należy zmodyfikować ten schemat dla różnych genów, ponieważ optymalny protokół będzie zależał od takich czynników, jak stabilność mRNA, lokalizacja tkankowa, trwałość białka lub rozwój fenotypu, który uniemożliwia wielokrotne cykle karmienia po regeneracji. Poziom wyciszenia należy ocenić poprzez prostą analizę penetracji fenotypu (jeśli jest on wyraźny) lub za pomocą metod qPCR w celu porównania poziomów docelowego mRNA z kohortą kontrolną negatywną.
4. Reprezentatywne wyniki:
Test regeneracji fragmentu tułowia jest stabilny, dzięki czemu wszystkie nicienie powinny regenerować się z prawidłową polarnością przednio-tylną („od głowy do ogona”). Można to ocenić już pięć dni po odcięciu, co ułatwia pojawienie się przednich plamek ocznych (oznaczonych gwiazdką, Rycina 1A). Jednakże pełna morfologiczna odbudowa utraconych struktur następuje po jednym tygodniu. Farmakologiczna manipulacja regeneracją fragmentu tułowia za pomocą PZQ w celu uzyskania dwugłowych nicieni (Rycina 1B) jest również stabilna (EC50=87 (+-) 11% fragmentów bipolarnych, 70μM PZQ przez 48 godzin20). Bipolarność występuje w ciągu jednego cyklu regeneracyjnego. Niższa skuteczność w tych testach wynika prawdopodobnie z problemów z rozpuszczalnością i/lub przechowywaniem leku lub zastosowania innego gatunku płaskostka, w którym PZQ jest nieskuteczny. W przypadku leków o mniejszej penetracji często stosuje się wskaźnik anteryzacji do oceny fenotypów pośrednich poza całkowitą bipolarnością22. Fenotypy wynikające z RNAi konstruktów kontroli pozytywnej pokazano na Rycynie 1: RNAi Dugesia japonica six-1 (Dj-six-1) prowadzi do fenotypu bezocznego23 (Rycina 1C), RNAi Dugesia japonica PC2 (Dj-PC2) prowadzi do utraty reakcji ucieczki przed światłem24 (Rycina 1D), a RNAi Dugesia japonica βcatenin-1 (Dj-βcatenin-1) prowadzi do fenotypu dwugłowego16-19, 21 z fragmentów tułowia (Rycina 1E). Fenotypy te można uzyskać, stosując następujące proste protokoły RNAi: Dj-six-1 (FFxFx), Dj-PC2 (FFFx), Dj-βcatenin-1 (FFxFx), gdzie odpowiednio F=cykl karmienia, a x=cykl regeneracyjny.
Rysunek 1: Test regeneracji fragmentu tułowia. A Po lewej, obraz planarii (góra) i schemat (środek) pokazujące lokalizację wyciętego fragmentu tułowia. Po prawej, przebieg czasowy regeneracji fragmentu tułowia przedstawiający pojawienie się regenerującego fragmentu w określonych punktach czasowych (dniach). B Obraz dwugłowej planarii powstałej w wyniku ekspozycji na PZQ. C Robak „bezyokowy” powstały w wyniku RNAi Dj-six-1. D Utrata reakcji unikania światła u nieruchomych robaków poddanych RNAi Dj-PC2 (zbarwione na czerwono) w porównaniu z ruchliwym robakiem kontrolnym (zbarwionym na zielono). E Bipolarna planaria powstała w wyniku RNAi Dj-βcatenin-1. Na rysunkach B-E oryginalny koniec przedni robaków poddanych RNAi jest skierowany w lewo.
Rycina 2: Sekwencja cykli karmienia i cięcia w typowym protokole RNAi obejmującym wielokrotne karmienia (F) oraz cykle regeneracyjne (x), który jest skuteczny w wyciszaniu wielu genów u D. japonica. Modyfikacja tego protokołu dla poszczególnych genów może być konieczna w celu uzyskania optymalnych wyników, na przykład poprzez zastosowanie mniejszej (w nawiasach) lub większej liczby cykli karmienia i regeneracji.
Dyskusja
Opisane tutaj protokoły szczegółowo przedstawiają testy służące do badania i manipulowania regeneracją planarii Dugesia japonica. Są one proste i nie wymagają specjalistycznego sprzętu, dzięki czemu można je łatwo przeprowadzić w laboratorium lub w sali lekcyjnej. Testy można wykonywać pojedynczo lub łączyć (np. w celu przesiewowego badania genetyczno-chemicznego skuteczności leków in vivo); mogą być one realizowane na poziomie konkretnych genów kandydackich lub mogą zostać dostosowane do bezstronnego przesiewania o wysokiej przepustowości8. Niezależnie od tego, czy służą one do badania intrygującej biologii planarii jako takiej, czy do oceny funkcji in vivo homologów ssaczych w alternatywnym modelu badania regeneracji tkanek, podejścia te powinny wzbudzić zainteresowanie szerokiego grona badaczy.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Prace laboratoryjne są wspierane przez NSF (MCB0919933) oraz NIH (GM088790).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Woda źródlana | Kandiyohi. Premium Waters Inc. Minneapolis, MN | n/a | Inne rodzaje wody źródlanej również sprawdzają się dobrze. Najpierw sprawdzić w testach żywotności. |
| 1 x buforowane sole Montjuïch: NaCl (1.6mM), CaCl2 (1mM), MgSO4 (1mM), MgCl2 (0.1mM), KCl (0.1mM), NaHCO3 (1.2mM), HEPES (1.5mM). pH 7.4 przy 24°C. | Różni dostawcy | n/a | Sztuczna woda do podawania leków podczas testów regeneracyjnych w celu zapewnienia buforowania pH. Alternatywą jest roztwór Holtfreter’a 5/8. |
| Pożywka 2xYT | Fisher Scientific | BP2467-500 | Medium = 31 g/L. Autoklawowane. |
| Szalka Petriego (100x25mm) | Fisher Scientific | 08-757-11 | Przechowywanie nicieni podczas cykli regeneracji |
| Szalka kwadratowa (100x100x15mm) | Fisher Scientific | 08-757-11A | Napełnić wodą i zamrozić, aby uzyskać tackę z lodem służącą jako powierzchnia do cięcia nicieni |
| Plastikowy pojemnik: Ziploc Twist ’n Loc (16oz). | Różne | n/a | Wygodne wodoszczelne pojemniki dla grup RNAi |
| Wątróbka z kurczaka | Sklep spożywczy | n/a | Preferowane produkty ekologiczne w celu uniknięcia antybiotyków. |
| Blender ręczny | Dowolny dostawca | n/a | Służy do przygotowania purée z wątróbki z kurczaka |
| Sito z drucianą siatką 1mm | Dowolny dostawca | n/a | Służy do przecierania purée z wątróbki z kurczaka |
| Bydle erytrocyty | Lampire Biological Laboratories | 7240807 | 100% przemyta i połączona zawiesina RBC |
| Okrągłe papiery filtracyjne | Whatman, GE Healthcare | 1003 055 | |
| Pipeta transferowa | Fisher Scientific | 13-711-41 | |
| Sterylne skalpele chirurgiczne | Różni dostawcy | n/a | |
| ±Prazykwantel | Sigma-Aldrich | P4668 | Przechowywać alikwoty w proszku w ciemności w 4°C. Suszyć w deskryptorze. |
| Dj-six-1 | GenBank AJ557022.1 | Pozytywna kontrola RNAi dla fenotypu “bezocznego”23 | |
| Dj-βcatenin-1 | GenBank AB181913.1 | Pozytywna kontrola RNAi dla fenotypu dwugłowia17 | |
| Dj-PC2 | Pozytywna kontrola RNAi dla fenotypu utraty awersji do światła24 |
Bibliografia
- Morgan, T. H. Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata. Arch Entwm Org. 7, 364-397 Forthcoming.
- Robb, S. M., Ross, E., Sánchez Alvarado, A. SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database. Nucleic Acids Res. 36, 599-606 (2008).
- Forsthoefel, D. J., Newmark, P. A. Emerging patterns in planarian regeneration. Curr Opin Genet Dev. 19, 412-4120 (2009).
- Adell, T., Cebrià, F., Saló, E. Gradients in Planarian Regeneration and Homeostasis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
- Agata, K., Watanabe, K. Molecular and cellular aspects of planarian regeneration. Semin Cell Dev Biol. 10, 377-383 (1999).
- Newmark, P. A. &, Sánchez-Alvarado, A. Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat Rev Genet. 3, 210-219 (2002).
- Reddien, P. W., Sánchez-Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Ann Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).
- Reddien, P. W., Bermange, A. L., Murfitt, K. J., Jennings, J. R., Sánchez-Alvarado, A. Identification of genes needed for regeneration, stem cell function, and tissue homeostasis by systematic gene perturbation in planaria. Dev Cell. 8, 635-649 (2005).
- Newmark, P. A., Reddien, P. W., Cebria, F. &, Sánchez-Alvarado, A. Ingestion of bacterially expressed double-stranded RNA inhibits gene expression in planarians. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 11861-11865 (2003).
- Collins, J. J. Genome-Wide Analyses Reveal a Role for Peptide Hormones in Planarian Germline Development. PLoS Biology. 8, e10000509-e10000509 (2010).
- Cebrià, F. Regenerating the central nervous system: how easy for planarians! Dev Genes Evol. , 733-748 (2007).
- Mineta, K. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7666-7671 (2003).
- Oviedo, N. J., Nicolas, C. L., Adams, D. S., Levin, M. Emerging Model Organisms. A Laboratory Manual Chapter. 8, (2009).
- Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. Neuropharmacology and behavior in planarians: translations to mammals. Comp Biochem Physiol. 147, 399-408 (2008).
- Sánchez-Alvarado, A., Newmark, P. A. Double-stranded RNA specifically disrupts gene expression during planarian regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 5049-5054 (1999).
- Gurley, K. A., Rink, J. C., Sánchez-Alvarado, A. Beta-catenin defines head versus tail identity during planarian regeneration and homeostasis. Science. 319, 323-327 (2008).
- Yazawa, S., Umesono, Y., Hayashi, T., Tarui, H., Agata, K. Planarian Hedgehog/Patched establishes anterior-posterior polarity by regulating Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 22329-22334 (2009).
- Petersen, C. P., Reddien, P. W. Smed-betacatenin-1 is required for anteroposterior blastema polarity in planarian regeneration. Science. 319, 327-330 (2008).
- Iglesias, M., Gomez-Skarmeta, J. L., Saló, E., Adell, T. Silencing of Smed-betacatenin1 generates radial-like hypercephalized planarians. Development. 135, 1215-1221 (2008).
- Nogi, T., Zhang, D., Chan, J. D., Marchant, J. S., S, J. A novel biological activity of praziquantel requiring voltage-operated Ca2+ channel beta subunits: subversion of flatworm regenerative polarity. PLoS Negl Trop Dis. 3, e464-e464 (2009).
- Oviedo, N. J. Long-range neural and gap junction protein-mediated cues control polarity during planarian regeneration. Dev Biol. 339, 188-199 (2010).
- Nogi, T., Levin, M. Characterization of innexin gene expression and functional roles of gap-junctional communication in planarian regeneration. Dev Biol. 287, 314-335 (2005).
- Mannini, L. Djeyes absent (Djeya) controls prototypic planarian eye regeneration by cooperating with the transcription factor Djsix-1. Dev Biol. 269, 346-359 (2004).
- Agata, K. Structure of the planarian central nervous system (CNS) revealed by neuronal cell markers. Zoolog Sci. 15, 433-440 (1998).
Przedruki i uprawnienia
