Izolacja limfocytów T oparta na flotacji przy użyciu sortowania komórek aktywowanych wyporem

Streszczenie

Źródło: Snow, T., et al. Izolacja, aktywacja i ekspansja limfocytów T opartych na flotacji z próbek ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu mikropęcherzyków. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film pokazuje izolację limfocytów T z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) przy użyciu technologii funkcjonalizowanego sortowania komórek aktywowanych wypornością (BACS). Technika izolacji polega na pozytywnej selekcji limfocytów T CD3 + poprzez znakowanie komórek biotynylowanymi przeciwciałami anty-CD3 i oddzielenie komórek związanych z przeciwciałami za pomocą mikropęcherzyków związanych streptawidyną.

Protokół

1. Izolacja limfocytów T za pomocą mikropęcherzyków za pomocą selekcji pozytywnej

UWAGA: Ten protokół szczegółowo opisuje podejście do pozytywnej selekcji CD3⁺ na małą skalę przy użyciu SAMB.

1. Inkubować 3 x 10⁸ komercyjnie uzyskanych PBMC w 2,5 ml buforu separacyjnego z biotynylowanym przeciwciałem anty-CD3 (OKT3) w stężeniu 25 ng przeciwciała na 1 milion komórek (25 ng / M). Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
2. Dodać mikropęcherzyki streptawidyny (SAMB) w stosunku 0,5 (ilość SAMB):1 (ilość komórek) zgodnie ze stężeniem SAMB podanym przez producenta.
3. Mieszać za pomocą komercyjnego rotatora typu end-over-end (EOE) przy 20 obr./min przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej. Wirować przez 5 minut przy 400 x g w temperaturze pokojowej.
4. Po odwirowaniu, pozytywnie wybrane komórki znajdą się na górze zawiesiny z SAMB. Pozostałe niewybrane komórki znajdą się w granulce komórek na dnie probówki. Za pomocą szklanej pipety o średnicy 9 cali włóż końcówkę poniżej warstwy komórek bąbelkowych na dno probówki, zaessać osad komórek i subnatant za pomocą pipety elektronicznej i przenieś je do nowej probówki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciało anty-ludzkie CD3 (OKT3) z biotyną	Legenda biologiczna	Numer katalogowy: 317320
Leukopak	BioIVT (Kształcenie i Rozwój	HUMANLMX100-0001129
Normalne ludzkie PBMC	BioIVT (Kształcenie i Rozwój	HUMANHLPB-0002562
Zestaw mikropęcherzyków streptawidyny (zawiera bufor separacyjny Akadeum)	Akadeum	Numer katalogowy 11110-000

powiedział: T T powiedział: