Izolacja marginesujących leukocytów wątrobowych z wątroby myszy

Streszczenie

Źródło: Sorski, L., et al. Selektywne pobieranie leukocytów wątrobowych z marginesem. J. Vis. Exp. (2016)

W tym filmie pokazujemy izolację leukocytów wątrobowych z wątroby myszy za pomocą wymuszonej perfuzji.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Protokół myszy

1. Perfuzja wątroby i zbiór MH-leukocytów
   1. Poddać zwierzę eutanazji za pomocą przedawkowania 8% izofluranu. Na wszelki wypadek umieść probówkę o pojemności 15 ml zawierającą podkładkę nasączoną izofluranem wokół głowy myszy, aż do otwarcia jej klatki piersiowej.
   2. Przymocuj kończyny myszy do łóżka.
   3. Otwórz jamy otrzewnej i klatki piersiowej, aby odsłonić wątrobę i kompleks krążeniowo-oddechowy natychmiast po ustaniu oddychania, pozostawiając dolną część przepony w stanie nienaruszonym (aby stworzyć drenującą kałużę klatki piersiowej). Unikaj krwawienia przez ten proces.
      1. W szczególności rozpocznij nacięcie w dolnym punkcie linii środkowej brzucha, nie uszkadzając narządów wewnętrznych, i przesuwaj się na obie strony po przekątnej w kierunku żeber, przecinając je do górnych poziomów jamy klatki piersiowej.
   4. Wyciągnij jelita i umieść je na zewnątrz zwierzęcia po prawej stronie eksperymentatora, aby odsłonić żyłę wrotną.
   5. Wprowadzić igłę o wadze 30 g, podłączoną do pompy perystaltycznej, do żyły wrotnej rostralnej do żyły śledziony.
   6. Przeciąć żyłę główną dolną powyżej przepony, aby umożliwić drenaż i zebranie perfuzatu z jamy klatki piersiowej.
   7. Włączyć pompę perystaltyczną z prędkością około 3 ml/min i delikatnie pobrać pierwsze 3 ml perfuzatu zanieczyszczonego krwią z kałuży klatki piersiowej.
   8. Odrzuć ten perfuzat. W razie potrzeby powtórz takie mycie ponownie, używając soli fizjologicznej, a dopiero potem zacznij zbierać perfuzat wątroby.
   9. Ponownie rozpocząć perfuzję z prędkością do 4 ml/min i pobrać 10 ml perfuzatu z jamy klatki piersiowej za pomocą motylka podłączonego do strzykawki.
   10. Zakończ perfuzję, gdy kolor wątroby zmieni kolor na jasnobrązowy.

2. Ekstrakcja leukocytów

1. Odwirować perfuzat przez 10 minut przy 400 x g.
2. Odessać supernatant.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pompa perystaltyczna Autoclud
Igła motylkowa	O MÓJ BOŻE, O MÓJ		26 GB
Igła motylkowa	O MÓJ BOŻE, O MÓJ		21G * 3/4 "
strzykawka	Rozwiązanie		Pojemność 1 ml
strzykawka	Rozwiązanie		Pojemność 2,5 ml
strzykawka	Rozwiązanie		Pojemność 5 ml
strzykawka	Rozwiązanie		Pojemność 10 ml
strzykawka	Rozwiązanie		Pojemność 25 ml
Kleszcze o stępionych krawędziach
nożyczki
Hemostat
Kleszcze do tkanek