Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Generowanie sieci NET
- Stymulować neutrofile za pomocą 500 nM PMA (na 30 ml roztworu neutrofili) i inkubować na płaskim naczyniu do hodowli tkankowej o wymiarach 150 x 25 mm z siatką 20 mm przez 4 godziny w temperaturze 37 °C 5% CO2 . Umożliwi to NETosis.
- Po 4 godzinach stymulacji delikatnie odessać i wyrzucić pożywkę, pozostawiając warstwę NET i neutrofili przylegającą na dnie. Nie naruszaj tej warstwy.
- Używając łącznie 15 ml zimnego PBS bez Ca i Mg na naczynie, umyj dno każdego naczynia, pipetując 15 ml PBS na dno naczynia w celu usunięcia całego przylegającego materiału z dna
.
- Zebrać roztwór otrzymany z mycia każdego naczynia (krok 1.3) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i odwirowywać przez 10 minut przy 450 x g w temperaturze 4 °C. Neutrofile i wszelkie pozostałe komórki osadzają się na dnie, pozostawiając bezkomórkowy supernatant bogaty w NET.
- Podzielić supernatant na 1,5 ml probówki do mikrowirówek i wirować przez 10 minut w temperaturze 18 000 x g w temperaturze 4 °C. Pozwoli to na granulowanie całego DNA.
nuta: Wirowanie w większych probówkach jest łatwiejsze i mniej czasochłonne, jeśli tak wysokie prędkości są osiągane w zwykłej wirówce, w przeciwnym razie konieczne będzie podzielenie supernatantów w mniejszych probówkach, aby można było użyć szybkiej mikrowirówki.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić wszystkie otrzymane razem granulki w lodowatym PBS do stężenia odpowiadającego 2 x 10,7 neutrofili na 100 μl PBS. W ten sposób uzyskamy bezkomórkowy materiał NET, który można wykorzystać do kolejnych eksperymentów.
- Zmierzyć stężenie DNA w próbce otrzymanej za pomocą spektrofotometrii lub alternatywnego narzędzia do oznaczania ilościowego DNA. Odpowiednie stężenie w próbce powinno mieścić się w przedziale 140 - 180 ng/μl.
