Identyfikacja inhibitorów kinaz, które modulują odpowiedź tymocytów na silne sygnały TCR

Streszczenie

Źródło: Chen, E. W., et al. Identyfikacja mediatorów sygnalizacji receptora limfocytów T poprzez badanie przesiewowe bibliotek inhibitorów chemicznych. J. Vis. Exp. (2019).

W tym filmie opisujemy metodę identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów kinaz, które modulują apoptozę podwójnie dodatnich niedojrzałych tymocytów samoreaktywnych CD4⁺CD8⁺. Apoptoza jest indukowana w podwójnie dodatnich tymocytach poprzez aktywację ich za pomocą kulek magnetycznych pokrytych anty-CD3 i anty-CD28; Następnie przeprowadza się leczenie inhibitorami małocząsteczkowymi i analizę cytometrii przepływowej w celu wykrycia, czy inhibitory modulują ekspresję markera apoptotycznego.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Badanie przesiewowe biblioteki inhibitorów kinaz (test niezależny od wirówki)

1. Leczenie tymocytów inhibitorami kinaz
   1. Przygotować zawiesinę tymocytów.
   2. Rozcieńczyć tymocyty w pełnym RPMI, aby uzyskać zawiesinę tymocytów o wymiarach 25 x 10⁶ komórek/ml.
   3. Dodaj 40 μl tymocytów do każdego dołka płytki o małej objętości, używając pipety wielokanałowej. Połóż talerz na lodzie.
   4. Rozcieńczyć inhibitory z płytki podstawowej, DMSO i deksametazonu w pełnym RPMI w stosunku czterech części całkowitego RPMI do jednej części inhibitora/DMSO/deksametazonu (współczynnik rozcieńczenia 5).
      nuta: Ponieważ objętości użyte w tej płytce o małej objętości są 5 razy mniejsze niż w metodzie konwencjonalnej, inhibitory i odczynniki kontrolne są rozcieńczane pięciokrotnie przed dodaniem ich do tymocytów w płytce.
   5. Dodać 0,5 μl inhibitorów kinaz do płytki 96-dołkowej z odpowiednich dołków płytki inhibitorowej przygotowanej w kroku 1.1.4.
   6. Przygotować osiem studzienek z niepoddanymi działaniu substancji kontrolnych. Przygotować cztery studzienki kontrolne poddane działaniu nośnika, dodając 0,5 μl DMSO przygotowanego w kroku 1.1.4. Przygotować cztery studzienki kontrolne poddane działaniu deksametazonu o wielkości 5 μM, używając rozcieńczonego deksametazonu przygotowanego w kroku 1.1.4 (rysunek 1).

2. Stymulacja tymocytów za pomocą kulek anty-CD3/CD28

1. Upewnij się, że koraliki są równomiernie zawieszone. Weź 1 ml kulek i umyj je 2 ml PBS. Oddziel koraliki za pomocą stojaka magnetycznego i odessaj roztwór. Ponownie zawiesić kulki w 1 ml pełnego RPMI.
   nuta: Stosunek koralików do komórek wynosi od 1 do 2,5. Dostosuj ilość koralików w zależności od liczby studzienek do stymulacji i liczby użytych tymocytów.
2. Dodać 10 μl zawiesiny kulek do każdej próbki poddanej działaniu inhibitora, czterech próbek poddanych działaniu DMSO i czterech z ośmiu próbek niepoddanych działaniu inhibitora. Dodać 10 μl pełnego RPMI do pozostałych czterech nieoczyszczonych studzienek. Rysunek 1 przedstawia ogólny układ płyt.
   nuta: Ostateczna objętość studzienek wynosi 50 μl, co mieści się w maksymalnej pojemności studzienek. Ważne jest, aby zachować ostrożność i trzymać płytki w pozycji pionowej, aby uniknąć rozlania przez studzienkę.
3. Aby wymieszać, wymieszać płytkę za pomocą wytrząsarki orbitalnej do mikropłytek. Alternatywnie wymieszaj zawartość studzienek za pomocą pipety wielokanałowej.
4. Inkubować tymocyty w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 17 - 20 godzin (lub przez noc) z pokrywką zapobiegającą parowaniu.

3. Ustawienie podkładki do płyt

UWAGA: Instrukcje dotyczące konfiguracji podkładki do płyt są dostarczane przez producenta. Kroki są pokrótce wymienione poniżej. Na każdy etap zalewania potrzeba około 150 ml roztworu.

1. Zalać system mycia 70% etanolem zawierającym 1% Tween 20.
2. Zalać system mycia wodą dejonizowaną zawierającą 1% Tween 20.
3. Zalać system mycia buforem myjącym FACS.

4. Barwienie antygenów powierzchniowych

1. Przygotować mieszaninę barwiącą przeciwciała zawierającą przeciwciała anty-TCRβ, anty-CD4, anty-CD8 i anty-CD69. Rozcieńczyć przeciwciała w buforze płuczącym FACS w stosunku 1:100 (v/v).
2. Umyj płytkę 9 razy, używając 55 μl buforu myjącego FACS na jedno mycie, przy użyciu automatycznego systemu mycia z przepływem laminarnym.
   nuta: Pod koniec płukania w każdym dołku będzie 25 μl pozostałej objętości.
3. Zawiesić komórki w 25 μl mieszaniny przeciwciał barwiących przygotowanej w kroku 1.4.1.
4. Jeśli próbki są przenoszone z płytki 96-dołkowej, należy ponownie zawiesić komórki w 50 μl mieszaniny przeciwciał i przenieść próbki na płytkę o małej objętości. Ten krok odpowiada metodzie numer 2, jak pokazano na rysunku 2A.
5. Aby wymieszać, należy wymieszać płytkę za pomocą wytrząsarki orbitalnej do mikropłytek lub wymieszać próbki za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować na lodzie przez 30 minut.

5. Utrwalenie komórek

1. Umyj płytkę 9 razy, używając 55 μl buforu myjącego FACS na mycie, przy użyciu automatycznego systemu mycia z przepływem laminarnym.
2. Dodaj bufor do utrwalania/permeabilizacji (w zestawie z zestawem do aktywnej apoptozy kaspazy-3; to samo z 10-krotnym buforem do trwałej ondulacji/płukania wspomnianym w kroku 1.6.1 i przeciwciałem anty-kaspazą-3 w kroku 1.6.2) w ilości 50 μl na studzienkę.
3. Inkubować na lodzie przez 30 minut.

6. Barwienie wewnątrzkomórkowe dla aktywnej kaspazy 3

1. Przygotuj 1x bufor do trwałej ondulacji/mycia, rozcieńczając 25 ml 10x buforu do trwałej ondulacji/mycia w 225 ml ultraczystej wody.
2. Przygotuj wewnątrzkomórkowe aktywne barwienie kaspazy, dodając 1 ml przeciwciała anty-kaspazy-3 do 2 ml 1x buforu do trwałej ondulacji/płukania. Stosunek przeciwciała do buforu do trwałej ondulacji/płukania wynosi 1:2.
3. Zalać system mycia 1x buforem do trwałej ondulacji/prania.
4. Umyj płytkę 9x 1x buforem do trwałej ondulacji/mycia, w ilości 55 μl na każde mycie.
5. Dodać 25 μl wewnątrzkomórkowego barwnika kaspazy przygotowanego w kroku 1.6.2 do wszystkich studzienek.
6. Aby wymieszać, należy wymieszać płytkę za pomocą wytrząsarki orbitalnej do mikropłytek lub wymieszać próbki za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować na lodzie przez 1 godzinę.
7. Umyj płytkę 9x 1x buforem do trwałej ondulacji/mycia, w ilości 55 μl na każde mycie.
8. Dodać 25 μl buforu płuczącego FACS do wszystkich studzienek.
9. Przenieść próbki do probówek do mikromiareczkowania po odpowiednim wymieszaniu za pomocą pipetowania.
10. Dodać kolejne 50 μl buforu płuczącego FACS do pustych studzienek i powtórzyć krok 1.6.9.
11. Powtarzać kroki 1.6.9 i 1.6.10 2x aż do zebrania 200 μl próbek w probówkach do mikromiareczkowania.
    nuta: Celem procedur opisanych w krokach 1.6.10 i 1.6.11 jest zapewnienie maksymalnego odzysku komórek z płytki o małej objętości. Jeśli liczba komórek nie stanowi problemu, po kroku 1.6.10 po prostu uzupełnij probówki do mikromiareczkowania do 200 μl buforem płuczącym FACS.
12. Przeprowadź analizę cytometryczną przepływową próbek i przeanalizuj wyniki za pomocą programu do analizy FACS. Aktywacja kaspazy-3 i ekspresja CD69 są analizowane w bramce zawierającej tymocyty CD4 + CD8 + DP.

Wyniki

Rycina 1: Układ płytki w teście aktywacji tymocytów. (Góra) Kolumny 1 i 12 są zarezerwowane dla kontroli, natomiast kolumny 2–11 to próbki poddane działaniu inhibitora (kolor beżowy). Kontrola negatywna (niestymulowana [NS]; szara) zajmuje studzienki od A1 do D1, a kontrola pozytywna dotycząca śmierci komórki (traktowana deksametazonem [DEX]; fioletowa) zajmuje studzienki od E1 do H1. Kolumny od 2 do 12 zawierają tymocyty stymulowa...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Prędkość obrotowa	Klon HyClone	SH30027FS
FBS (Sieć Usługowa	Klon HyClone	SH3007103
L-glutamina	Klon HyClone	SH3003401
Pirogronian sodu	Klon HyClone	SH3023901
10 razy więcej kanałów na sekundę	Vivantis powiedział:	PB0344 – 1L
Biblioteka badań przesiewowych kinaz (96-dołkowa)	Chemiczny Kajmany	Numer katalogowy 10505	Dokładna zawartość biblioteki może się różnić
Dmso	Sigma Aldrich	Zobacz materiał D2650
deksametazon	Sigma Aldrich	Zobacz materiał D4902
Koraliki anty-CD3/CD28	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy 11452D
Zestaw do aktywnej apoptozy kaspazy-3 FITC	BD Pharmingen	Numer katalogowy: 550480	Zawiera bufor do utrwalania/permeabilizacji, 10X bufor do trwałej ondulacji/płukania i przeciwciało anty-kaspazowe 3
Myjka DA-Cell	CURIOX	Zobacz materiał HT1000
96-dołkowa płytka DA-Cell	CURIOX	96-DC-CL-05
przeciwciała
CD3e (biblioteka CD3e	Legenda biologiczna	100236
TCRb (Biblioteka Przemysłowa)	BD Nauki biologiczne	553174
Płyta CD4	BD Nauki biologiczne	740007
Płyta CD8	BD Nauki biologiczne	563786
Płyta CD69	eBionauka	25-0699-42
Inhibitory
TG003	Chemiczny Kajmany		Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
TG003	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
PKC 412	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Doramapimod	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Paklitaksel	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Erlotynib	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Nekrostatyna-5	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
NVP-BEZ235	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Ftalazynon-pirazol	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Karabin AG-879	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
1-NA-PP1	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Torin 1	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Bisindolilomaleimid II	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
BIBF 1120	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Zobacz materiał SMI-4a	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Bisindolilomaleimid XI (chlorowodorek)	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
CAY10657	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
AS-703026	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Chlorek chelerytryny	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Tunikamycyna	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
1059615 GSK	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Ruksolitynib	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Nekrostatyna-1	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
SB 505124	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
ATRAMENT128	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Kanertynib (chlorowodorek)	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
SB 431542	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
PD 173074	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Kwas walproinowy (sól sodowa)	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
PD 0325901	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
SB 203580	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
VX-702	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Emodyny	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
CHIR99021	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
bio	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Imatynib (mezylan)	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Jabłczan sunitynibu	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Gefitynib	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Zobacz materiał PP2	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
3-metyladenina	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Bisyndolilomaleimid I	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Bisindolilomaleimid IV	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Bisindolilomaleimid V	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
663284 NSC	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
D 4476	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
NU 7026	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
H-9 (chlorowodorek)	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
3'-monoksom indyrubiny	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
KN-62	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
KN-93	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Zobacz materiał CGP 57380	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Izo-olomomucyna	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
(S)-glicylo-H-1152 (chlorowodorek)	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Bisyndolilomaleimid VIII (octan)	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Zobacz materiał ST638	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Zobacz materiał SU 6656	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
LY364947	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
SB 203580 (chlorowodorek)	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
CAY10621	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
YM-201636	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
ZM 447439	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
AS-041164	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
NVP-AEW541 (chlorowodorek)	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Zobacz materiał PP242	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
ABT-869	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
CAY10622	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
17β-hydroksy Wortmannin	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
CAY10626	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Zobacz materiał SU 6668	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
CAY10572	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
N,N-dimetylosfingozyna	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
LY294002	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
U-0126	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Staurosporyna	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
KN-92 (chlorowodorek)	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
AS-605240 (sól potasowa)	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
O-1918	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Y-27632 (chlorowodorek)	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Leelamine (Leelamine)	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
PD 98059	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
PD 169316	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
TGX-221	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
(S)-H-1152 (chlorowodorek)	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
AS-605240	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
D-erytro-sfingozyna C-18	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
OSU03012	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
JNJ-10198409	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Leelaamina (chlorowodorek)	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Leelamid kwasu arachidonowego	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Leelamid kwasu laurynowego	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
AS-252424	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
CAY10505	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Zobacz materiał PI-103	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
PIK-75 (chlorowodorek)	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Inhibitor kinazy sfingozynowej 2	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Piceatannol powiedział:	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Zobacz materiał SC-1	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
(R)-Roskowityna	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
ZATOKA-43-9006	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
CAY10561	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
AS-604850	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Inhibitor kinazy α PI3 2	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Czołg ML-9	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Tricyrybina	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Analog erbstatyny	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Kenpaullone	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Olomoucina	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
AG-494	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Czołg AG-825	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
AG-1478	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
SB 216763	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
SB 415286	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Karabin AG-17	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
H-8 (chlorowodorek)	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
LFM-A13	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Zobacz materiał SC-514	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Apigenina	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Karabin AG-18	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
CAY10554	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
DRB (Demokratyczne Rejestr	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Przekaźnik RG-13022	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Przekaźnik RG-14620	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Czołg AG-490	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Karabin AG-82	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Karabin AG-99	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Czołg AG-213	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Czołg AG-183	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Lawendyna C	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
ZM 336372	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
5-jodotubercydyna	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
SB 202190	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
CAY10571	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Nilotynib	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
SP 600125	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
L-treo-sfingozyna C-18	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
H-89	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
HA-1077 (chlorowodorek)	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Czołg AG-370	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Wortmannin	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
AG-1296	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Zobacz materiał KT 5823	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Janex 1	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
CAY10574	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
CAY10575	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
CAY10576	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Zobacz materiał NH125	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
TWS119	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
210902 NSC	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
CAY10577	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
CAY10578	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
PD 184161	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
CCT018159	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy
Mirycetyna	Chemiczny Kajmany	-	Z biblioteki badań przesiewowych kinazy

powiedział: powiedział: ) powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: