Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie do eksperymentu
- Wykonanie urządzenia do hodowli narządów jelitowych (3 dni)
- Za pomocą drukarki 3D wydrukuj plastikowe formy wielokrotnego użytku do urządzenia do hodowli narządów (urządzenie ma 6 dołków, z 24 małymi i dużymi otworami oraz do pokrywy urządzenia).
UWAGA: Te plastikowe formy mogą być używane do produkcji wielu urządzeń.
- Włóż igły z końcami (22 G i 18 G) do odpowiedniej pozycji w formie urządzenia i odlej około 20 g mieszanki polidimetylosiloksanu (PDMS) (stosunek wagowy 1:10, zasada do katalizatora) na jeden zestaw urządzenia i pokrywki.
- Umieść foremki w komorze próżniowej na 30 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza z mieszanki PDMS.
- Inkubować pleśnie w temperaturze 55 °C przez noc, aby zakończyć polimeryzację PDMS.
- Po ustawieniu PDMS wyciągnij igły z formy i ostrożnie zwolnij urządzenie do hodowli i pokrywkę z plastikowych foremek.
- Usuń pozostałości PDMS z obrysu studni za pomocą ostrza chirurgicznego. Przymocuj urządzenie PDMS i pokrywę urządzenia do szkła nakrywkowego (mikroszkiełka 75 mm x 50 mm) za pomocą nietoksycznego kleju silikonowego i pozostaw części do zastygnięcia na noc (nałóż klej na gładką stronę urządzenia).
- Włóż dwanaście igieł 22 G do światła i dwanaście igieł 18 G do studzienki. Zamocuj wszystkie igły na miejscu za pomocą silikonu i pozostaw na noc. Włóż dwie igły 18 G do pokrywy, aby zapewnić prawidłowy przepływ powietrza do i z urządzenia do hodowli narządów jelitowych.
- Sprawdź wszystkie igły pod kątem wycieków za pomocą strzykawki wypełnionej wodą. Sprawdź, czy nie ma wycieków ze studni, napełniając studnie wodą.
- Umieść dwa węzły chirurgiczne na każdej igle 22 G, która zostanie połączona z okrężnicą. Umieść urządzenie i pokrywkę w papierowej torbie autoklawu i sterylizuj w autoklawie.
- Pożywka hodowlana (0,5 h)
- W kapturze biologicznym wymieszaj następujące ilości (w probówce o pojemności 50 ml): 37 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove (IMDM), 10 ml zamiennika surowicy KSR, 1 ml suplementu B27, 0,5 ml suplementu N2, 0,5 ml 1 M buforu HEPES i 0,5 ml aminokwasów endogennych.
- Przefiltrować i przechowywać całe podłoże w temperaturze 4 °C.
- Przygotowanie rurek i narzędzi chirurgicznych
- Wytnij odpowiednią długość rurek dla światła wejściowego, studzienki wejściowej, światła wyjściowego i studni wyjściowej (12 krótkich rurek i 12 długich rurek). Podłącz odpowiedni adapter z każdej strony rurki.
- Przygotuj narzędzia chirurgiczne: proste nożyczki, 4x cienkie kleszcze i 2x ostre kleszcze.
- Umieść probówki i narzędzia chirurgiczne w papierowej torbie autoklawu i wysterylizuj je w autoklawie.
- Przygotuj wejście światła (pożądana stymulacja - bakterie, stolec, leki itp.).
- Przed eksperymentem należy określić obciążenie bakteryjne kultury bakteryjnej przez seryjne rozcieńczenia i hodowlę w warunkach tlenowych i/lub beztlenowych.
- Po obliczeniu obciążenia bakteryjnego należy rozcieńczyć kultury bakteryjne w sterylnej pożywce do hodowli tkankowych, aby uzyskać wymagane stężenie bakterii. W przypadku próbek kału należy przefiltrować za pomocą sitka o średnicy 100 μm.
nuta: W przypadku stymulacji niebakteryjnej (leki, metabolity itp.) należy rozcieńczyć substancję do wymaganego stężenia za pomocą pożywki do hodowli jelitowych.
2. Przygotowanie do eksperymentu
- Wewnątrz inkubatora do hodowli narządów włączyć grzałkę i ustawić ją na 37 °C.
- Ustawić pompy, a także strzykawki wejściowe i wyjściowe.
- Wprowadzenie pożywki do hodowli tkankowych
- W okapie z przepływem biologicznym lub laminarnym napełnić strzykawki studzienki wejściowej kompletną pożywką hodowlaną. Ostateczna objętość zależy od czasu trwania eksperymentu i natężenia przepływu; zwykle 1 ml/h plus dodatkowa pożywka do przedmuchiwania.
- Podłączyć rurki do strzykawek za pomocą adaptera Luer-lock. Umieścić napełnione strzykawki w pompkach strzykawkowych.
- Opróżnić strzykawki wejściowe. Upewnij się, że medium studzienkowe wypływa ze wszystkich probówek do szklanki na odpady.
- Wejście luminalne
- Napełnij strzykawki z dopływem światła z leczeniem stymulującym (bakterie, leki itp.). Objętość zależy od czasu trwania eksperymentu i natężenia przepływu (zwykle 30 μl/h plus dodatkowe medium do przedmuchiwania).
- Podłączyć rurki do strzykawek za pomocą adaptera Luer-lock. Umieścić napełnione strzykawki w pompkach strzykawkowych.
- Przedmuchnąć strzykawki wejściowe. Upewnij się, że stymulacja wypływa ze wszystkich rurek do szklanki na odpady. Uważaj, aby nie zanieczyścić różnych stymulacji.
- Wyjść
- Umieścić puste strzykawki w wyjściowych pompach strzykawkowych (ustawić tryb pompy na "wycofanie").
- Konfiguracja urządzenia
- Ustaw regulator kontrolujący natężenie przepływu mieszaniny gazowej (95%O2 + 5% CO2 ), aby uzyskać delikatny, minimalny przepływ.
- Sprawdź urządzenie w okapie laminarnym.
- Przepłucz igły urządzenia sterylnym IMDM, aby umyć igły.
- Dodać 500 μl sterylnej pożywki hodowlanej do każdego dołka urządzenia.
- Przygotowanie do wypreparowania tkanek
- Umieść sterylne narzędzia chirurgiczne w kapturze laminarnym.
- Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml sterylnym IMDM i podłącz sterylną (autoklawowaną) igłę 22 G z końcem do płukania jelita grubego.
3. Hodowle narządów
- Składanie ofiar na myszach i sekcja tkanek
- W kapturze laminarnym złóż w ofierze 12-14-dniowe myszy przez ścięcie. Spryskaj myszy 70% etanolem i umieść myszy na plastikowej płytce.
- Za pomocą ostrych nożyczek i kleszczy rozetnij mysz i wyjmij przewód pokarmowy od żołądka do odbytu, przecinając cały tłuszcz i tkankę łączną. Wytnij dwukropek i umieść go na nowym talerzu.
nuta: Zminimalizuj kontakt z tkanką jelita grubego. Nie dotykaj środkowej części tkanki okrężnicy. Trzymaj tkankę delikatnie i tylko na krawędziach tkanki.
- Płukanie i mycie jelita grubego
- Pod mikroskopem preparacyjnym delikatnie przepłukać zawartość jelita grubego sterylnym IMDM (po stronie proksymalnej) za pomocą przygotowanej strzykawki o pojemności 10 ml (krok 2.7.2). Po usunięciu kału z tkanki jelitowej umieść okrężnicę w nowej 6-dołkowej płytce wypełnionej 0,5 ml sterylnego IMDM.
- Podłączanie dwukropka do urządzenia
- Weź chusteczkę, ostrożnie połącz ją z igłą 22 G i mocno zawiąż dwiema nitkami. W tym momencie konieczne jest utrzymanie prawidłowej orientacji jelita grubego do przepływu światła (proksymalnie = wejście, dystalnie = wyjście). Powtórz kroki 3.2-3.3 dla wszystkich 6 tkanek.
- Sprawdź, czy zamki Luer igły wejściowej są puste z podłoża. Jeśli nie, opróżnij je. Dodaj stymulacje do igły wejściowej Luer lock (aby uniknąć przedostawania się pęcherzyków powietrza do światła). Powtórz ten krok dla każdej okrężnicy z odpowiednią stymulacją.
- Sprawdź, czy wszystkie chusteczki są połączone i umieść pokrywę na górze urządzenia.
- Podłączanie urządzenia do hodowli narządów do pomp
- Umieść urządzenie w nagrzanej komorze z kontrolowaną temperaturą (37 °C).
- Podłącz przepływ gazu
- Podłącz adapter gazu do pokrywy za pomocą odpowiedniej igły wejściowej.
- Podłącz lampy wejściowe i wyjściowe do urządzenia.
nuta: Podłącz bliższą stronę okrężnicy do wanien wejściowych.
- Oczyść światło za pomocą wejść stymulacyjnych.
- Delikatnie przeprowadź stymulację świetlną przez jelito i sprawdź przepływ medium w rurkach wyjściowych.
- Umyj medium zewnętrzne.
- Umyj medium zewnętrzne 3 razy (ustaw pompy na szybkość 600 μl/min zarówno dla studni wejściowej, jak i wyjściowej). Każde mycie trwa 1 minutę (zaczynając od opróżnienia studzienki).
- Rozpocznij eksperyment.
- Uruchom pompy z następującymi szybkościami:
Natężenie przepływu: lumen: wejście- 30 μL/h, wyjście- 35 μL/h
Medium zewnętrzne: wejście- 1000 μL/h, wyjście- 950 μL/h
nuta: Czas eksperymentu może wahać się od 30 min do 24 h.
- Koniec doświadczenia (do 24 godzin w przypadku posiewów narządów jelita grubego)
- Odłącz wszystkie rurki od urządzenia.
- Odłącz tkanki od igieł i przejdź do żądanych odczytów.
