Test mający na celu określenie dawki zakaźnej wirusa Drosophila C w hodowanych komórkach owadów

Streszczenie

Źródło: Yang, S. et al., Ustalenie infekcji wirusowej i analiza interakcji gospodarz-wirus u Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019)

W tym filmie demonstrujemy test efektu cytopatycznego w celu określenia zakaźnej dawki wirusa Drosophila C w hodowli tkankowej na komórkach Drosophila S2*. Do zakażenia hodowanych komórek wykorzystuje się szereg stężeń wirusa. Określa się odsetek komórek wykazujących zmiany strukturalne, a dane te są wykorzystywane do obliczenia dawki infekcyjnej dla hodowli tkankowej.

Protokół

1. Miara obciążenia wirusem Drosophila C za pomocą testu CPE

1. Wybierz 5 losowych probówek zawierających wirusa, aby określić średnią dawkę infekcyjną kultury tkankowej wirusa (TCID₅₀) za pomocą testu efektu cytopatycznego (CPE) (1 jednostka TCID₅₀ = 0,7 jednostki tworzącej blaszkę [PFU]).
   nuta: CPE odnosi się do zmian strukturalnych w komórkach gospodarza spowodowanych inwazją wirusa. Infekujący wirus powoduje lizę komórki gospodarza lub gdy komórka umiera bez lizy z powodu niezdolności do rozmnażania.
2. W dniu 1 należy zebrać przygotowane komórki S2* za pomocą pipetowania. Policz numer komórki. Odwirować komórki przez 300 x g przez 4 minuty i odrzucić supernatant. Rozcieńczyć komórki do gęstości 1 x 10⁶ komórek/ml kompletną pożywką dla komórek S2*.
3. Wysiewaj 1 x 10⁵ komórek S2 * (100 μL) na studzienkę do 96-dołkowej płytki o płaskim dnie (~ 30% konfluencji).
4. Wykonaj seryjne 10-krotne rozcieńczenia materiału DCV za pomocą kompletnego podłoża dla ogniw S2*. Dodać 50 μl rozcieńczeń do studzienki. Dodać 50 μl pożywki hodowlanej bez wirusa do studzienki sklasyfikowanej jako studzienka kontroli ujemnej.
   nuta: Dla każdej szybkości rozcieńczenia użyto 8 studzienek. Ponieważ typowa wydajność DCV wynosi około 10^{8-10 9} PFU/ml, rozcieńczenie powinno obejmować co najmniej ~10^{−5-10−10.}
5. W 4 dniu obserwuj CPE za pomocą mikroskopu jasnego pola z obiektywem 20X lub 40X. Studzienkę, w której komórki wyglądają na rozmyte, a podłoże jest pełne fragmentów, należy sklasyfikować jako "studnię dodatnią", a studzienkę, w której morfologia komórki jest normalna, jako "studnię ujemną".
6. Oznacz dodatnie lub ujemne dołki CPE odpowiednio + lub –. Oblicz TCID_{wirusa 50} metodą Reeda i Muencha.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml	marka	Numer katalogowy: 352070
Naczynie do hodowli komórkowych 10 cm	Sigma	CLS430167	Hodowla komórkowa
Inkubator komórkowy	Sanyo powiedział:	MIR-553
wirówka	Eppendorf	Zobacz materiał 5810R
wirówka	Eppendorf	5424R
Inkubator Drosophila	Percival	I-41NL	Hodowla Drosophila
FBS (Sieć Usługowa	Invitrogen	Numer katalogowy: 12657-029	Hodowla komórkowa
Podłoże dla owadów Schneidera	Sigma	Numer katalogowy S9895	Hodowla komórkowa
Oprogramowanie statystyczne	GrafPad Pryzmat 7
Płytka 96-dołkowa z płaskim dnem	Sigma	CLS3922	Hodowla komórkowa
Inkubator komórkowy	Sanyo powiedział:	MIR-553
mikroskop	Olympus	CKX41

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: