$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Preparat antygenowy do wstrzyknięcia podskórnego
- Wszystkie procedury opisane w tej sekcji należy wykonać wewnątrz dygestorium chemicznego, aby zapobiec wdychaniu lub kontaktowi skóry z proszkiem Mycobacterium tuberculosis, Mtb H37Ra. Postępuj zgodnie z zasadami swojej instytucji dla kompletnego adiuwanta Freunda (zwykle BSL-1). Obejmuje to stosowanie rękawic odpornych na chemikalia, okularów ochronnych i ochronnej odzieży roboczej (fartuch laboratoryjny).
- Stosuj dobrą sterylną technikę, aby zapobiec zanieczyszczeniu odczynników, które zostaną wprowadzone do zwierząt doświadczalnych.
- Sporządzić zawiesinę Mtb w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), mieszając 5 mg liofilizowanego, zabitego termicznie proszku Mycobacterium tuberculosis H37Ra z 2,5 ml zimnego PBS w probówce do mikrowirówki o pojemności 5 ml. Wiruj raz przez 30 sekund, a następnie umieść na lodzie.
- Aby wytworzyć drobną zawiesinę H37Ra w PBS, należy sonikować zawiesinę na lodzie przez 5 minut.
- Zwolnij korpus konwertera i wyczyść sondę wacikiem nasączonym alkoholem o stężeniu 70% (v/v).
- Włącz sonikator, ustaw moc na 4, obracając pokrętło regulacji mocy i zanurz końcówkę sondy w proszku mykobakteryjnym zawierającym PBS. Upewnij się, że końcówka sondy jest zanurzona do co najmniej połowy głębokości próbki i że końcówka sondy nie dotyka ścianki probówki mikrowirówkowej.
- Sonikować mieszaninę na lodzie przez 30 sekund, zrobić przerwę na 30 sekund i powtarzać łącznie przez 5 minut, aby w pełni rozproszyć proszek do równomiernej zawiesiny bez podgrzewania płynu.
- Dodać 2,5 ml niekompletnego adiuwantu Freunda do mieszaniny i powtarzać proces sonikacji na lodzie, aż emulsja utworzy konsystencję przypominającą pastę do zębów.
- Ustaw moc na 0 za pomocą pokrętła sterującego i wyłącz urządzenie, aby zakończyć sonikację. Zdejmij końcówkę z zawieszenia i przetrzyj sondę wacikiem nasączonym alkoholem.
- Emulsję antygenową należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Wytwarzanie partii emulsji pomoże zapewnić spójność między eksperymentami. Emulsję można przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.
2. Wstrzyknięcie podskórne
- Wykonać wstrzyknięcie podskórne na tydzień przed wstrzyknięciem do ciała szklistego (oznaczone jako dzień -7).
- Załadować strzykawkę o pojemności 1 ml (bez dołączonej igły) z emulsją prątkową. Ze względu na lepkość i nieprzezroczystość emulsji, strzykawkę mogą wypełnić trudne do zauważenia pęcherzyki powietrza.
- Aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza w strzykawce, po załadowaniu 0,2-0,3 ml emulsji, odwróć strzykawkę (końcówką skierowaną do góry) i delikatnie postukaj strzykawką kilkakrotnie w krawędź blatu, aby pęcherzyki wypłynęły na powierzchnię.
- Usunąć powietrze ze strzykawki i kontynuować napełnianie strzykawki. Odwróć i co jakiś czas stukaj, aż zostanie napełniony.
- Umieścić igłę 25 G na strzykawce i przesunąć emulsję, aby napełnić igłę. Przechowywać strzykawkę na lodzie do czasu jej użycia.
- Aby bezpiecznie wykonać wstrzyknięcie podskórne, należy znieczulić mysz lub zastosować humanitarne metody krępowania, które umożliwiają łatwy dostęp do tylnych kończyn zwierzęcia.
- Aby znieczulić zwierzę do wstrzyknięcia podskórnego, należy umieścić zwierzę w komorze indukcyjnej izofluranu (3%-4% w przypadku indukcji i 1%-3% w przypadku podtrzymania). Po znieczuleniu upewnij się, że mysz ma powolną częstość oddechów i nie wykazuje żadnych oznak niewydolności oddechowej.
- Wstrzyknięcia podskórne należy wykonać na grzbietowej powierzchni bioder lub na brzusznej powierzchni nóg proksymalnie do okolicy pachwinowych węzłów chłonnych.
- Ostrożnie wprowadzić igłę, aby zapobiec wstrzyknięciu do mięśnia. Wstrzyknąć 0,05 ml emulsji Mtb w przestrzeń podskórną. Nie należy natychmiast wyjmować igły, aby umożliwić pełne wstrzyknięcie gęstej emulsji.
- Powtórzyć wstrzyknięcie po lewej i prawej stronie, w sumie 0,1 ml na zwierzę.
- W przypadku znieczulenia umieść mysz na ciepłej poduszce grzewczej do całkowitego wyzdrowienia. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.
- Po całkowitym wyzdrowieniu należy umieścić mysz z powrotem w klatce i oznaczyć kartę klatki datą wstrzyknięcia podskórnego.
- Przeciwbólowe należy stosować doustnie paracetamol (200 mg/kg/dobę), ale nie Niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ), ponieważ środki przeciwzapalne mogą wpływać na indukcję zapalenia błony naczyniowej oka.