Mysi model prątkowego zapalenia błony naczyniowej oka do badania poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka

Streszczenie

Źródło: John, S., et al. Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) jako model dla poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film demonstruje metodę generowania mysiego modelu mysiego zapalenia błony naczyniowej oka (PMU) do badania poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka. Po indukcji PMU przez wstrzyknięcie do ciała szklistego zabitych termicznie Mycobacterium tuberculosis u myszy uprzednio uodpornionej tym samym immunogenem, postęp przewlekłego stanu zapalnego w oku jest analizowany za pomocą obrazowania i badania histopatologicznego

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Preparat antygenowy do wstrzyknięcia podskórnego

1. Wszystkie procedury opisane w tej sekcji należy wykonać wewnątrz dygestorium chemicznego, aby zapobiec wdychaniu lub kontaktowi skóry z proszkiem Mycobacterium tuberculosis (Mtb) H37Ra. Postępuj zgodnie z zasadami swojej instytucji dla kompletnego adiuwanta Freunda (zwykle BSL-1). Obejmuje to stosowanie rękawic odpornych na chemikalia, okularów ochronnych i ochronnej odzieży roboczej (fartuch laboratoryjny).
2. Stosuj dobrą sterylną technikę, aby zapobiec zanieczyszczeniu odczynników, które zostaną wprowadzone do zwierząt doświadczalnych.
3. Sporządzić zawiesinę Mtb w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), mieszając 5 mg liofilizowanego, zabitego termicznie proszku Mtb H37Ra z 2,5 ml zimnego PBS w probówce do mikrowirówek o pojemności 5 ml. Wiruj raz przez 30 sekund, a następnie umieść na lodzie.
4. Aby wytworzyć drobną zawiesinę H37Ra w PBS, należy sonikować zawiesinę na lodzie przez 5 minut.
   1. Zwolnij korpus konwertera i wyczyść sondę wacikiem nasączonym alkoholem o stężeniu 70% (v/v).
   2. Włącz sonikator, ustaw moc na 4, obracając pokrętło regulacji mocy i zanurz końcówkę sondy w proszku mykobakteryjnym zawierającym PBS. Upewnij się, że końcówka sondy jest zanurzona do co najmniej połowy głębokości próbki i że końcówka sondy nie dotyka ścianki probówki mikrowirówkowej.
5. Sonikować mieszaninę na lodzie przez 30 sekund, zrobić przerwę na 30 sekund i powtarzać łącznie przez 5 minut, aby w pełni rozproszyć proszek do równomiernej zawiesiny bez podgrzewania płynu.
6. Dodać 2,5 ml niekompletnego adiuwantu Freunda do mieszaniny i powtarzać proces sonikacji na lodzie, aż emulsja utworzy konsystencję przypominającą pastę do zębów.
7. Ustaw moc na 0 za pomocą pokrętła sterującego i wyłącz urządzenie, aby zakończyć sonikację. Zdejmij końcówkę z zawieszenia i przetrzyj sondę wacikiem nasączonym alkoholem.
8. Emulsję antygenową należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Wytwarzanie partii emulsji pomoże zapewnić spójność między eksperymentami. Emulsję można przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.

2. Wstrzyknięcie podskórne

1. Wykonaj wstrzyknięcie podskórne na tydzień przed wstrzyknięciem do ciała szklistego (IVT) (oznaczone jako dzień -7).
2. Załadować strzykawkę o pojemności 1 ml (bez dołączonej igły) z emulsją prątkową. Ze względu na lepkość i nieprzezroczystość emulsji, strzykawkę mogą wypełnić trudne do zauważenia pęcherzyki powietrza.
   1. Aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza w strzykawce, po załadowaniu 0,2-0,3 ml emulsji, odwróć strzykawkę (końcówką skierowaną do góry) i delikatnie postukaj strzykawką kilkakrotnie w krawędź blatu, aby pęcherzyki wypłynęły na powierzchnię.
3. Usunąć powietrze ze strzykawki i kontynuować napełnianie strzykawki. Odwróć i co jakiś czas stukaj, aż zostanie napełniony.
4. Umieścić igłę 25 G na strzykawce i przesunąć emulsję, aby napełnić igłę. Przechowywać strzykawkę na lodzie do czasu jej użycia.
5. Aby bezpiecznie wykonać wstrzyknięcie podskórne, należy znieczulić mysz lub zastosować humanitarne metody krępowania, które umożliwiają łatwy dostęp do tylnych kończyn zwierzęcia.
6. Aby znieczulić zwierzę do wstrzyknięcia podskórnego, należy umieścić zwierzę w komorze indukcyjnej izofluranu (3%-4% w przypadku indukcji i 1%-3% w przypadku podtrzymania). Po znieczuleniu upewnij się, że mysz ma powolną częstość oddechów i nie wykazuje żadnych oznak niewydolności oddechowej.
7. Wstrzyknięcia podskórne należy wykonać na grzbietowej powierzchni bioder lub na brzusznej powierzchni nóg proksymalnie do okolicy pachwinowych węzłów chłonnych.
   1. Ostrożnie wprowadzić igłę, aby zapobiec wstrzyknięciu do mięśnia. Wstrzyknąć 0,05 ml emulsji Mtb w przestrzeń podskórną. Nie należy natychmiast wyjmować igły, aby umożliwić pełne wstrzyknięcie gęstej emulsji.
   2. Powtórzyć wstrzyknięcie po lewej i prawej stronie, w sumie 0,1 ml na zwierzę.
8. W przypadku znieczulenia umieść mysz na ciepłej poduszce grzewczej do całkowitego wyzdrowienia. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.
9. Po całkowitym wyzdrowieniu należy umieścić mysz z powrotem w klatce i oznaczyć kartę klatki datą wstrzyknięcia podskórnego.
10. Przeciwbólowe należy stosować doustnie paracetamol (200 mg/kg/dobę), ale nie niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ), ponieważ środki przeciwzapalne mogą wpływać na indukcję zapalenia błony naczyniowej oka.

3. Preparat antygenu do iniekcji doszklistkowej

1. Wszystkie procedury opisane w tej sekcji należy wykonać w odpowiednich sterylnych warunkach, aby zapobiec zanieczyszczeniu zawiesiny MTB do ciała szklistego.
2. Wykonać zawiesiny doszklistkowe.
   1. W celu indukcji łagodnego do umiarkowanego zapalenia błony naczyniowej oka, należy przygotować zawiesinę doszklistkową o stężeniu 5 mg/ml, dodając 5 mg ekstraktu z prątków do 1 ml 1x PBS.
   2. W celu indukcji umiarkowanego do ciężkiego zapalenia błony naczyniowej oka, należy przygotować zawiesinę doszklistkową o stężeniu 10 mg/ml, dodając 10 mg ekstraktu z prątków do 1 ml 1x PBS.
3. Wiruj raz przez 30 sekund, a następnie umieść na lodzie.
4. Aby wytworzyć drobną zawiesinę H37Ra w PBS, należy sonikować zawiesinę na lodzie przez 10 minut, jak opisano w kroku 1.4. Roztwór podstawowy rozmieścić w objętości 100 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C.
5. Przed użyciem rozmrozić w temperaturze pokojowej i wirować na wysokich obrotach przez 1 minutę. Porcje należy przechowywać na lodzie podczas transportu do obiektu dla zwierząt.

4. Zabieg iniekcji do ciała szklistego w dniu 0

1. Przygotowanie zwierząt
   1. Załóż dopasowane rękawiczki do badania i umieść mysz na wadze, aby uzyskać jej wagę w gramach.
   2. Wykonać dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,02 ml/g masy ciała roztworu zawierającego 100 mg/ml ketaminy i 20 mg/ml ksylazyny zmieszanej ze sterylną wodą w celu znieczulenia zwierzęcia. Alternatywne podejście obejmuje indukcję przy użyciu ~1,5% izofluranu (wziewnego).
   3. Odczekaj około 2 minut, aż mysz zaśnie, a następnie umieść mysz w podgrzewanym pudełku i przykryj pokrywę. Wykonaj testy odruchów bólowych, takie jak szczypanie ucha, palców u nóg i ogona, aby ocenić głębokość znieczulenia do zabiegu.
   4. Po zaśnięciu znieczulij rogówkę 1 kroplą 0,5% (v/v) tetrakainy. Unikaj dostania się tetrakainy w pobliżu nosa lub ust myszy. Po 10 s zetrzyj nadmiar płynu.
      nuta: Zaobserwowano, że rozszerzenie tęczówki i wizualizacja komory przedniej (AC) ulegają poprawie po podaniu znieczulenia miejscowego, prawdopodobnie z powodu poprawy tłumienia odruchów rogówkowych za pomocą połączonego znieczulenia ogólnoustrojowego i miejscowego. Jednak w razie potrzeby ten krok można pominąć.
   5. Rozszerz źrenicę za pomocą 1 kropli 2,5% (v/v) fenylefryny. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć nadmiaru kropelek, które mogą dostać się do nosa lub ust. Po 2-3 minutach zetrzyj nadmiar płynu.
   6. Aby zmniejszyć ryzyko zapalenia wnętrza gałki ocznej, dodaj 1 kroplę 5% betadyny na powierzchnię oka i otaczające włosy. Pozostawić na oku na 2-3 min.
      nuta: Wszystkie procedury opisane w tej sekcji należy wykonywać w odpowiednich sterylnych warunkach, aby zapobiec zapaleniu wnętrza gałki ocznej.
   7. Usuń betadynę i przykryj oko hypromelozą (0,3%) lub karbomerowym żelem pod oczy 0,2% w/w), aby zapobiec wysuszeniu pod narkozą. Pomoże to również zapobiec powstawaniu zaćmy.
2. Konfiguracja systemu mikroiniekcji
   1. Wykonać iniekcję doszklistkową za pomocą mikropompy podłączonej do sterownika pompy mikrostrzykawkowej i strzykawki iniekcyjnej (Rysunek 1A-C). Alternatywnie należy wykonać wstrzyknięcie za pomocą igły 33 G dołączonej do strzykawki Hamiltona, jak opisano w podpunkcie 4.4.
   2. Podłączyć igłę 34 G do uchwytu do wstrzykiwań, aby zmontować wtryskiwacz. Poluzować srebrną nakrętkę z przodu uchwytu do wstrzykiwań i wsunąć igłę w korpus uchwytu mniej więcej do połowy. Dokręć palcami srebrną nakrętkę.
   3. Podłączyć rurkę do uchwytu wtrysku, jak opisano w krokach 4.2.4-4.2.5.
   4. Aby włożyć rurkę do uchwytu wtryskowego, poluzuj plastikową z tyłu uchwytu, wsuń rurkę przez uszczelkę do środka i dokręć.
   5. Należy zachować niewielką przerwę z końcem rurki, aby zapobiec uszkodzeniu rurki podczas wstrzykiwania. Patrz rysunek 1C.
   6. Rozmrozić 100 μl podwielokrotności zawiesiny wyjściowej prątków.
   7. Dodać 3 μl 1% roztworu fluoresceiny sodowej (AK-Fluor) i dobrze odwirować.
   8. Załadować strzykawkę o pojemności 10 μl mieszanką antygenu i fluoresceiny, nie dodając żadnych pęcherzyków powietrza.
   9. Wyjąć igłę ładującą ze strzykawki i wsunąć rurkę przez srebrną uszczelkę nakrętki, aż końcówka osiągnie znak zera w korpusie strzykawki.
   10. Gdy końcówka rurki zostanie prawidłowo wyrównana w żądanej pozycji, dokręć palcami nakrętkę.
   11. Przepłukać roztwór w strzykawce przez rurkę do wstrzykiwań, aby w pełni naładować system. Następnie powtórzyć kroki 4.2.8-4.2.11, aby ponownie załadować strzykawkę do wstrzykiwań.
   12. Aby zainstalować załadowaną strzykawkę na mikropompie, naciśnij przycisk zwalniający zacisk na końcu mikropompy, aby otworzyć zaciski strzykawki.
   13. Umieścić nasadkę tłoka w uchwycie nasadki tłoka na tylnym końcu mikropompy.
   14. Następnie wsunąć kołnierz strzykawki na ogranicznik kołnierza, a korpus strzykawki do zacisku strzykawki.
   15. Zwolnij clamp przycisk i dokręcić mocującą tłok. Patrz rysunek 1D.
   16. Wsunąć uchwyt do wstrzykiwań i igłę przez zacisk o kształcie litery O w stereotaktycznym aparacie do wstrzykiwań. Jest to platforma niestandardowa; Alternatywnie strzykawkę można trzymać i ustawiać ręcznie.
   17. Ustawić objętość infuzji i szybkość infuzji na sterowniku pompy mikrostrzykawkowej tak, aby wstrzykiwała odpowiednio 500 nl na cykl z szybkością 40 nL/s.
       nuta: Można stosować szybsze tempo wstrzykiwań, jednak przed uzyskaniem relokacji igły może wystąpić większy refluks
   .
   18. Przetestuj system, aby zapewnić prawidłowe działanie przed wykonaniem iniekcji do ciała szklistego.
       nuta: Jeśli system wstrzykiwania działa prawidłowo, aktywacja cyklu wstrzykiwania za pomocą pedału nożnego lub panelu sterowania spowoduje widoczny ruch uchwytu nasadki tłoka, a na końcu igły pojawi się niewielka kropla zielonkawego płynu. W przypadku, gdy płyn nie jest wytwarzany, należy aktywować dodatkowe cykle lub przepłukać i ponownie załadować strzykawkę.
   19. Przed wstrzyknięciem do oka należy delikatnie przetrzeć igłę płatkiem z 95% etanolu.
3. Zabieg iniekcji do ciała szklistego
   1. Mysz umieszcza się na aparacie stereotaktycznym w celu wykonania procedury iniekcji.
   2. Utrzymuj scenę/platformę, na której spoczywa mysz, mocując 2-3 ręczniki papierowe na jej powierzchni.
   3. Umieść mysz w pozycji leżącej na platformie. Użyj prawego i lewego paska na ucho, aby delikatnie przymocować głowę zwierzęcia. Patrz rysunek 1E.
   4. Ustaw mysz i ustaw ją pod lunetą tak, aby widoczny był górny nosowy aspekt prawego oka.
   5. Za pomocą igły 30 G przesunąć rzęsy i odsłonić twardówkę. Wizualizuj rąbek i promieniowe naczynie krwionośne.
   6. Za pomocą sterylnej igły 30 G wykonaj otwór prowadzący w twardówce 1-2 mm za rąbkiem.
   7. Wprowadzić igłę 34 G przymocowaną do uchwytu do wstrzykiwań do oka przez otwór prowadzący pod kątem, który pozwoli uniknąć soczewki, ale umieścić końcówkę igły w jamie ciała szklistego.
   8. Za pomocą sterownika pompy mikrostrzykawkowej ostrożnie wstrzyknąć 1 μl ekstraktu Mtb do jamy ciała szklistego. W przypadku stałego refluksu należy zwiększyć objętość wstrzyknięcia do 1,5 μl, aby zapewnić odpowiednie podanie dawki.
      nuta: W przypadku kontroli pozorowanej należy wstrzyknąć 1 μl PBS do oka zwierzęcia.
   9. Sprawdź umieszczenie w ciele szklistym, wizualizując zielonkawy odruch w oku. Patrz rysunek 1F.
   10. Po 10 sekundach wyjąć igłę z oka. Zwróć uwagę na refluks.
   11. Zdejmij mysz z platformy, umieść 0,3% hypromelozy lub 0,2% w/w maści karbomerowej do oczu na obu oczach w celu ochrony rogówki i przejdź do pudełka do podgrzewania regeneracji.
   12. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Nie wracaj do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieją.
   13. Gdy mysz jest w pełni przytomna, wróć do klatki i dodaj butelkę z paracetamolem (200-300 mg/kg/dzień). Oznacz kartę klatki datą wstrzyknięcia IVT.
   14. Iniekcje doszklistkowe są na ogół dobrze tolerowane. Objawy kliniczne, które mogą wskazywać na ból i konieczność usunięcia z badania, obejmują łysienie okołogałkowe (wskazujące na samouraz), owrzodzenie rogówki, utratę masy ciała i zgarbioną postawę.

Wyniki

Rycina 1: Konfiguracja iniekcji doszklistkowej u myszy. Iniekcję doszklistkową wykonuje się do oka myszy za pomocą (A) sterownika pompy mikrostrzykawkowej podłączonej do (B) mikropompy i (C) strzykawki do wstrzykiwań. Strzykawka jest ładowana i montowana na mikropompie (D). Głowa myszy jest ustawiana za pomocą pasków usznych (

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
AK-FLUOR	Akorn Pharmaceuticals, IL, Stany Zjednoczone		10% fluoresceiny sodowej 100 mg/ml w fiolce 5 ml
AnaSed	Akorn Animal Health, IL, Stany Zjednoczone	NDC 59399-110-20	Ksylazyna 20 mg/ml
Betadine 5% sterylny roztwór do przygotowywania okulistyki	Alcon, Teksas, Stany Zjednoczone	8007-1
ślizgu BD -25 g	Becton, Dickinson and Company, NJ, Stany Zjednoczone	305122
Igła B-D Precision Glide -30-G	Becton, Dickinson and Company, NJ, Stany Zjednoczone	305106
Obligacja MAX, Obligacja Rx	Leica Biosystems, Illinois, Stany Zjednoczone		Zautomatyzowany system barwienia IHC
Maść chloramfenikolowa	Martindale Pharma, Romford, Wielka Brytania		1% w/w Chloramfenikolu
EG1150H	Leica Biosystems, Illinois, Stany Zjednoczone		Osadzanie tkanek
Envisu R2300	Bioptigen/Leica		Maszyna OCT
Niekompletny adiuwant Freunda	BD Difco, NJ, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 263910
GenTeal lubrykantowa maść do oczu	Alcon, Teksas, Stany Zjednoczone	---
GenTeal lubrykant żel pod oczy	Alcon, Teksas, Stany Zjednoczone	---
Liofilizowany ekstrakt z prątków H37Ra	BD Difco, NJ, Stany Zjednoczone	231141
Igła Hamilton RN (33/12/2)S	Hamilton, Reno, NV	7803-05(33/12/2)	33 gramów
Strzykawka Hamilton	Hamilton, Reno, NV	CAL7633-01	5 μL
Igła do insuliny	Exel International, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy 26029	1 ml
Izofluran
Ketaset powiedział:	Zoetis, Stany Zjednoczone Ameryki	377341	Ketamina HCL 100 mg/ml
Pompa strzykawkowa do mikroiniekcji i Micro4Controller	World Precision Instruments, Floryda, Stany Zjednoczone	UMP3
Mikron IV	Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, Kalifornia		Alternatywna maszyna do obrazowania/OCT
Strzykawka Nanofil 10 μL	World Precision Instruments, Floryda, Stany Zjednoczone	NANOFIL
Zestaw do wstrzykiwań wewnątrzgałkowych Nanofil	World Precision Instruments, Floryda, Stany Zjednoczone	IO-ZESTAW
Olympus SZX10	Olympus		Zakres sekcji
Pbs	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 14190
Chlorowodorek fenylefryny Roztwór oftalmiczny USP 2,5% Sterylne 15 ml	Akorn Pharmaceuticals, IL, Stany Zjednoczone	17478020115
Zobacz materiał RM2255	Leica Biosystems, Illinois, Stany Zjednoczone		Cięcie tkanek
Strzykawka przeciwgruźlicowa	Becton, Dickinson and Company, NJ, Stany Zjednoczone	309602	1 ml
Tetrakaina 0,5%	Alcon, Teksas, Stany Zjednoczone	1041544
Seria Tissue Tek VIP	Sakura Finetek USA, Inc., Kalifornia		Przetwarzanie tkanek histologicznych
Tropikamid 1%	Chauvin Pharmaceuticals, Romford, Wielka Brytania		Minimalne wartości
Tylenol	Johnson & Johnson Consumer Inc., Pensylwania, Stany Zjednoczone	NDC 50580-614-01	Paracetamol
Naczynia napowietrzne	Novartis Pharmaceuticals, Camberley, Wielka Brytania		Carbomer żel pod oczy 0,2% w/w